抗病原高免卵黄抗体及基于AAV载体疫苗制备的方法和制剂与流程

本发明涉及病毒疫苗技术领域，具体涉及一种抗病原高免卵黄抗体及基于aav载体疫苗制备的方法和制剂。

背景技术：

病毒和细菌在千百年来，在地球上与人类共存，人类已经对许多病毒和细菌具有了免疫功能。但是对有些病毒仍然没有抵抗力，而且病毒也在随着时间发生变异和进化，比如对人体伤害较小的流感病毒，以及对人体具有致命伤害的鼠疫等。因此，为了抵抗病毒的袭击，已经出现了多种病毒疫苗。病毒疫苗一般为注射剂，注射一次或多次后体内产生病毒抗体，从而免于此类病毒的感染。

2020年2月11日，国际病毒分类学委员会将新型冠状病毒英文名正式命名为sars-cov-2，其引起的肺炎也在同日被世界卫生组织正式命名为2019冠状病毒肺炎(covid-19)。

sars-cov-2属于冠状病毒科冠状病毒属，为单股正链rna病毒，有包膜，包膜上有放射状排列的花瓣样或纤毛状突起，形似王冕，属于β类冠状病毒。由于新型冠状病毒的潜伏期长、传播力强、致病性强，给人民生命安全和社会公共健康带来极大威胁，因此新冠肺炎疫情十分严峻，对其防控尤为紧迫。目前没有有效的药物、疫苗用于治疗和预防该病，患者需要依靠自身的免疫系统自我康复。

卵黄抗体(immunoglobulinofyolk，igy)是一种存在于免疫后禽蛋中的特异性多克隆抗体，分子量为180kda，在功能上等价于哺乳动物igg。但与igg相比，igy具有许多独特的优点:

1)容易快递、大量获得，抗原免疫母禽后收取禽蛋即可获得大量igy，能够迅速应对爆发性疾病，起到预防及辅助治疗的作用；

2)igy性质相对较稳定，巴氏灭菌温度下不会失活。耐酸，在ph值4.0-11.0时不发生明显降解情况，加工后在ph值值小于3时仍能保持稳定活性。实验表明缺乏铰链区的igy在体内具有能够完全避免被其肠道内胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化的能力，故无需加保护剂即可用于肠道疾病的预防与治疗；

3)安全性好，禽类igy与哺乳动物免疫球蛋白之间不会发生交叉血清学反应。igy不与人类风湿因子或fc受体相结合，不激活补体系统，因此一般不会引起过敏反应的发生；

4)能避免在免疫检测过程中产生假阴性或假阳性结果。

目前igy在人类一些疾病防控中起到重要作用，如igy口服剂已被成功应用到幽门螺旋杆菌、轮状病毒、冠状病毒、耶尔森鼠疫杆菌、大肠埃希菌、葡萄球菌等胃肠道病毒及细菌感染的治疗与防治[5-9]，igy喷雾剂则被用于口腔、喉部黏膜，以预防及治疗呼吸道疾病感染，且在人类肿瘤疾病诊断中也有igy的应用。针对sars-cov的卵黄抗体igy可有效中和sars-cov。而2019新型冠状病毒(sars-cov-2)与sars-cov病毒同源性较高，提示制备针对sars-cov-2的卵黄抗体可用于预防新冠病毒的感染，清除胃肠道中的病毒，阻断“粪-口”传播，防止排泄物引起的二次感染。

传统卵黄抗体的制备主要是通过利用灭活的病原或者病原保护性抗原蛋白作为疫苗，多次免疫母禽，收获禽蛋获得。

新冠肺炎传染性极强，而疫苗研发由于周期长的问题仍需时间，公众将在较长的一段时间内面临新冠病毒感染威胁，而针对新冠病毒的卵黄抗体可以在一定程度上杀灭新冠病毒，起到一定的预防感染作用。传统卵黄抗体的制备主要是通过利用灭活的病原或者病原保护性抗原蛋白作为疫苗，多次免疫母禽，收获禽蛋获得。在制备上存在以下不足之处：

(1)多次免疫一方面增加工作量，导致人力、物力、时间成本上升；另一方面会引起母禽应激，产蛋下降、抗体水平降低，甚至母禽死亡，最终导致卵黄抗体效价降低；

(2)灭活病原存在安全风险。利用灭活病原，会存在灭活不彻底，最终导致散毒风险风险，且灭活病原基因组的存在也会病原基因重组风险；

(3)蛋白免疫不能持续刺激免疫系统。利用病原保护性抗原蛋白，虽然没有散毒安全风险，但是蛋白容易被机体分解，不能持续存在刺激免疫系统产生抗体，最终也会导致卵黄抗体效价降低。

有鉴于此，亟需发明利用一次免疫即可持续表达抗原，且安全，可迅速、大规模获得的免疫载体作为免疫手段的一种针对新冠病毒的安全、快速、高效制备高免卵黄抗体及其方法。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是目前的抗新冠病毒高免卵黄抗体不能一次性免疫获得、灭活病原存在安全风险、蛋白免疫不能持续刺激免疫系统的问题。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是提供一种基于aav载体疫苗制备抗病原高免卵黄抗体的方法，包括以下步骤：

从病原的基因组序列中，选取出含有抗原蛋白片段的第一基因序列，并通过家鸡密码子优化合成相应的病原保护性抗原基因；

通过双酶切aav载体疫苗的核心质粒paav-cmv-egfp，获得载体片段；以所述抗原基因的抗原蛋白扩增引物，扩增获得两端含有双酶切位点的第二基因序列，再次双酶切所述第二基因序列，回收后分别与所述载体片段转染，获得到携带抗原蛋白的重组aav载体疫苗；

选用健康的产蛋母鸡，将所述重组aav载体疫苗多点接种于鸡胸部肌肉，免疫后收集其鸡卵；

利用所述鸡卵的卵黄液制备针对所述病原的抗病原高免卵黄抗体。

在另一个优选的实施例中，所述病原为新冠病毒，获取病原保护性抗原基因的步骤具体为：

从新冠病毒的基因组序列中，选取含有rbd结构域的刺突糖蛋白s1片段基因序列，通过家鸡密码子优化合成相应的病原保护性抗原基因。

在另一个优选的实施例中，获得携带抗原蛋白的重组aav载体疫苗的步骤具体为：

将所述核心质粒paav-cmv-egfp用ecori及bamhi进行双酶切，回收获得载体片段aav-cmv；

分别设计刺突糖蛋白s1及rbd的抗原基因的扩增引物，以新冠病毒的s1基因片段为模板，扩增获得两端含有ecori及bamhi酶切位点的s1抗原基因片段和rbd抗原基因片段，再用ecori及bamhi进行双酶切回收后，与载体片段aav-cmv连接并转化dh5α感受态，获得第一核心质粒paav-cmv-s1及第二核心质粒paav-cmv-rbd；

无内毒素提取所述第一核心质粒paav-cmv-s1及第二核心质粒paav-cmv-rbd，并分别与两个辅助质粒，按照摩尔比1：1：1的比例，用阳离子转染试剂pei共转染hek293t细胞；

收取所述转染hek293t细胞，反复冻融多次后收集上清液，并加入核酸酶孵育；

孵育后再次收集上清液，去除杂质蛋白及杂质，获得所述重组aav载体疫苗raav-s1和raav-rbd。

在另一个优选的实施例中，免疫收集鸡卵的步骤具体为：

选用健康的母鸡，按照1e+11vg/只剂量，将所述重组aav载体疫苗raav-s1和raav-rbd多点接种于鸡胸部肌肉，免疫后收集其鸡卵；

对所述鸡卵的蛋壳消毒，蛋壳严重污染的，事先选出进行单独消毒，用清水冲洗干净后与净蛋一同浸入水温42℃的0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15min，随后浸入90-95℃水浴中消毒5秒钟，快速取出后晾干，4℃环境下保存。

在另一个优选的实施例中，采用硫酸铵沉淀法获得所述卵黄抗体，具体步骤为：

用去离子水7倍稀释所述卵黄，再用3ml浓度为0.1mol/l的hcl溶液，调节ph值至5.2后，4℃环境下静置6h，12000r/min离心30min，过滤取上清液；

各取2ml上清液3份，加入饱和硫酸铵溶液至其终浓度分别为40％，60％，80％，4℃环境下过夜后，5000r/min离心25min，弃去上清液，将沉淀物分别以2ml的纯水复溶。

在另一个优选的实施例中，采用聚乙二醇沉淀法获得所述卵黄抗体，具体步骤为：

在所述卵黄中加入20ml的tris-hcl缓冲液中，所述tris-hcl缓冲液的浓度为0.1mol/l，ph值为7.6，混合均匀后加入peg至其浓度w/v为3.5％并充分混合，8000r/min离心25min；

取上清液再加入peg至其终浓度w/v为12％并充分混合，12000r/min离心10min，弃去上清液；

将沉淀物用10ml的1×pbs溶液复溶，再加入peg至终浓度w/v为12％，充分混合，12000r/min离心10min，弃去上清液，将沉淀物用2ml的pbs溶液复溶。

在另一个优选的实施例中，采用冷乙醇沉淀法获得所述卵黄抗体，具体步骤为：

用去离子水7倍稀释所述卵黄，用3ml浓度为0.1mol/l的hcl溶液，调节ph值至5.2后，4℃环境下静置6h，12000r/min离心30min，过滤取上清液；

再加入95％的乙醇，使终浓度v/v至60％，4℃环境下搅拌30min，置于4℃环境下10000r/min离心30min，得到沉淀物；

将沉淀物溶于10ml浓度为0.028mol/l的nacl溶液中，室温下过滤除脂，滤液中加入95％乙醇，使终浓度v/v至30％，充分混匀，并在4℃环境下10000r/min离心30min，再将沉淀物溶解于2ml的pbs溶液中。

在另一个优选的实施例中，采用水稀释法获得所述卵黄抗体，具体步骤为：

以去离子纯水稀释所述卵黄，调节ph值为7.6，4℃环境下搅拌4小时，离心后弃去沉淀，将上清液先用200kda滤膜过滤，再用150kda蛋白超滤管浓缩至2ml。

本发明还公开了一种基于aav载体疫苗制备的抗病原高免卵黄抗体，根据上述方法制得。

本发明还公开了一种基于aav载体疫苗制备的抗病原高免卵黄抗体喷雾制剂，采用上述抗病原高免卵黄抗体制得。

与现有技术相比，本发明，具有以下优点：

1.经过一次免疫健康产蛋鸡即可收集鸡卵，提取卵黄中的活性成分(抗病毒或细菌的卵黄抗体)，工作量大幅降低，人力、物力和时间成本降低；而且不易引起母禽应激，有效保证母禽的个体健康以及卵黄抗体的有效性。

2.利用具有安全性高、包装迅速简单、成本低、表达稳定的重组腺相关病毒(raav)作为表达病毒或细菌的病原保护性抗原基因的载体疫苗，不是采用灭活病原，因此安全性高，避免了散毒风险；而且，腺相关病毒的宿主范围十分广泛且组织感染能力强，重组腺相关病毒删除了野生型aav的病毒结构，只留下cap蛋白、rep蛋白以及两端的反向互补序列itrs，既可高效的表达外源基因，又可以获得大量抗原性、免疫原性较好的、与天然蛋白功能相似的可溶性重组蛋白，不易被机体分解，可长期表达外源基因，而不依赖于宿主细胞活跃的分裂能力，因此能持续刺激免疫系统并最终获得有效的卵黄抗体。

3.本发明制备卵黄抗体的方法，安全高效、快速、成本低、提取效率高、产量高，易于产业化，是面对重大突发疫情防控的重要手段。

4.本发明的抗病毒或细菌的卵黄抗体，采用紫外分光光度计测定蛋白质浓度在18-30mg/ml；经间接免疫荧光检测其可以与病毒或细菌的病原保护性抗原基因结合，即制备成喷雾制剂可用于预防病毒或细菌引起的感染。

附图说明

图1为本发明方法的流程图；

图2为本发明中aav载体疫苗的核心质粒paav-cmv-egfp的图谱；

图3为本发明中核心质粒paav-cmv-egfp用ecori及bamhi进行双酶切的凝胶电泳图；

图4为本发明中的s1基因扩增凝胶电泳图；

图5为本发明中的rbd基因扩增凝胶电泳图；

图6为本发明中的第一核心质粒paav-cmv-s1的图谱；

图7为本发明中的第二核心质粒paav-cmv-rbd的图谱；

图8为本发明中的抗新冠病毒sars-cov2的s1蛋白卵黄抗体sds-page凝胶电泳图；

图9为本发明中的抗新冠病毒sars-cov2的rbd蛋白卵黄抗体sds-page凝胶电泳图；

图10为本发明中的抗新冠病毒sars-cov2的s1蛋白卵黄抗体的间接免疫荧光图；

图11为本发明中的抗新冠病毒sars-cov2的rbd蛋白卵黄抗体的间接免疫荧光图；

图12为本发明中的raav-cmv-gep感染df1细胞绿色荧光表达图；

图13为本发明中的raav-cmv-gep感染母鸡鸡腿肌肉的绿色荧光表达图。

具体实施方式

目前已有研究证明，新型冠状病毒sars-cov-2与sars-cov一样，均是通过病毒表面的spike蛋白与宿主细胞表面受体血管紧张素转化酶2(ace2)结合来介导病毒对宿主细胞的侵入，但也有研究证明，针对sars全长spike蛋白的igg可以介导sars病毒感染巨噬细胞从而加重感染。

为此，本发明提供了一种基于aav载体疫苗制备的抗病原高免卵黄抗体、方法及制剂，以制备针对sars-cov-2病毒spike蛋白的卵黄抗体来用于预防新冠病毒感染。选用sars-cov-2病毒spike蛋白部分片段，例如s1蛋白或者受体结构域(receptor-bindingdomain,rbd)基因作为抗原来制备卵黄抗体更有优势。下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明做出详细说明。

本发明提供的基于aav载体疫苗制备抗病原高免卵黄抗体的方法，包括以下步骤：

根据病原(病毒或细菌)的基因组序列，选取其含抗原蛋白片段的第一基因序列，通过家鸡密码子优化合成相应的病原保护性抗原基因；

将aav载体疫苗(腺相关病毒载体疫苗)的核心质粒paav-cmv-egfp通过双酶切，获得载体片段；针对上述通过家鸡密码子优化合成病原保护性抗原基因，设计抗原蛋白扩增引物，以上述扩增引物扩增病原的基因片段，获得两端含有双酶切位点的第二基因序列，再次双酶切所述第二基因序列paav-cmv-抗原基因，回收后分别与所述载体片段转染，获得到携带抗原蛋白的重组aav载体疫苗raav-抗原基因，采用荧光定量pcr对raav-抗原基因的滴度进行测定，分装保存；

选用健康的产蛋母鸡，将上步中得到的重组aav载体疫苗(raav-抗原基因)多点接种鸡胸部肌肉，免疫20天后收集鸡卵，蛋壳消毒，保存；

打开鸡卵，流掉蛋清，用滤纸吸去剩余蛋清，将卵黄液混匀，取10ml卵黄液放于离心管中，利用所述鸡卵的卵黄液制备针对所述病原的抗病原高免卵黄抗体。

本发明，利用具有安全性高、包装迅速简单、成本低、表达稳定的重组腺相关病毒作为表达病毒或细菌的保护性抗原基因的载体疫苗，经过一次免疫健康产蛋鸡即可收集鸡卵，有效提高了工作效率。

腺相关病毒载体作为一种已经运用于人类临床基因治疗的载体，具有安全性高、病毒包装操作相对简单、成本低、表达稳定等优点，常用于基因工程活疫苗载体。其宿主范围十分广泛且组织感染能力强，并可长期表达外源基因，而不依赖于宿主细胞活跃的分裂能力。重组腺相关病毒(recombinantadeno-associatedvirus，raav)删除了野生型aav的病毒结构，只留下cap蛋白、rep蛋白以及两端的反向互补序列itrs，既可高效的表达外源基因，又可以获得大量抗原性、免疫原性较好的、与天然蛋白功能相似的可溶性重组蛋白。

一、具体实施例

所述病毒或细菌为新冠病毒，如图1所示。

步骤s10.合成病原保护性抗原基因。

从genebank上获得新冠病毒sars-cov2的基因组序列(id：mn988668.1)，选取刺突糖蛋白s1片段(含rbd结构域)基因序列，经家鸡密码子优化后送基因合成公司，合成相应的病原保护性抗原基因。

步骤s20.包装携带s1或rbd基因的重组aav载体疫苗，具体为：

步骤s21.构建第一核心质粒paav-cmv-s1及第二核心质粒paav-cmv-rbd。

将核心质粒paav-cmv-egfp(其图谱如图2所示)，用ecori及bamhi进行双酶切(其双酶切凝胶电泳图如图3所示)，回收载体片段aav-cmv；分别设计刺突糖蛋白s1及rbd扩增引物，以新冠病毒s1基因为模板，扩增获得两端含有ecori及bamhi酶切位点序列的s1基因片段和rbd基因片段，(s1基因和rbd基因扩增凝胶电泳图分别如图4和5所示)，用ecori及bamhi再次进行双酶切回收后，与载体片段aav-cmv连接后转化dh5α感受态，送测序鉴定，获得第一核心质粒paav-cmv-s1(图谱如图6所示)及第二核心质粒paav-cmv-rbd(图谱如图7所示)。

具体地，第一核心质粒paav-cmv-s1的基因序列为：ctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctgcggccgcacgcgtggagctagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgtcaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttgcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggattcgaatcccggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtctataggcccacaaaaaatgctttcttcttttaatatacttttttgtttatcttatttctaatactttccctaatctctttctttcagggcaataatgatacaatgtatcatgcctctttgcaccattctaaagaataacagtgataatttctgggttaaggcaatagcaatatttctgcatataaatatttctgcatataaattgtaactgatgtaagaggtttcatattgctaatagcagctacaatccagctaccattctgcttttattttatggttgggataaggctggattattctgagtccaagctaggcccttttgctaatcatgttcatacctcttatcttcctcccacagctcctgggcaacgtgctggtctgtgtgctggcccatcactttggcaaagaattgggattcgaacatcgattgaattcgccaccatgtttgtgtttctggtgctgctgcccctggtgagcagccagtgcgtgaatctgacaacaaggacccagctgccccccgcctacaccaacagtttcacaagaggcgtgtactaccctgataaagtgtttagaagcagcgtgctgcactccacacaggatctgtttctgccctttttctccaatgtgacctggttccatgctattcacgtgtctggaacaaacggcacaaaacggttcgataaccccgtgctgcccttcaacgacggagtgtacttcgcatccactgagaaatcaaatatcattcgggggtggatctttggcacaacactggatagcaaaacccagagcctgctgatcgtgaacaatgcaacaaacgtggtcattaaggtgtgcgagtttcagttttgcaacgatccattcctgggcgtgtactaccacaagaataataagagctggatggaaagcgagtttagagtgtacagctctgccaacaactgcacctttgagtacgtgtcccagcctttcctgatggatctggaaggcaaacagggcaactttaaaaacctgcgcgagttcgtctttaagaacattgatggctacttcaagatctattccaaacacacaccaatcaatctggtgagagatctgccacagggattttcagcactggagcccctggtggatctgcctattggaatcaatatcacaaggttccagacactgctggctctgcacagaagctacctgacccctggagattcttccagcgggtggaccgccggagccgccgcctactacgtgggatacctgcagccaagaaccttcctgctgaaatataacgaaaacggaacaattactgatgccgtggactgcgccctcgacccactgagcgaaactaaatgcaccctgaagagcttcaccgtggagaagggcatctatcagacatctaacttcagggtgcagcccaccgaatctattgtgaggtttcccaacatcactaacctgtgcccattcggcgaggtgtttaacgctactaggtttgctagcgtgtacgcatggaaccgcaagagaattagcaattgtgtggccgattatagcgtcctgtataacagcgcctctttcagcacattcaagtgctacggcgtgtcccctaccaagctgaatgatctgtgcttcacaaacgtgtatgctgatagctttgtgattagaggcgacgaggtgcggcagatcgctcctggccagaccggcaagatcgctgactacaactacaagctgcccgatgacttcacaggctgcgtgatcgcttggaactccaacaacctggattccaaggtgggcggcaactacaattatttgtacagactgtttaggaaaagcaacctgaagccctttgaaagagacattagcacagagatctaccaggccgggtctactccttgcaacggcgtcgaaggctttaattgttacttcccactgcagagctacggattccagcccactaacggagtggggtaccagccataccgcgtggtggtgctgtcctttgaattgctgcatgcccccgctacagtgtgcgggcccaagaagtccactaacctggtgaagaataagtgcgtgaacttcaattttaacggcctgaccggaacaggcgtgctgactgaatctaacaagaagttcctgccatttcagcagttcgggagggacatcgctgacaccactgatgccgtgagagacccccagaccctggagattctggatatcactccatgcagctttggcggcgtgagcgtgatcacacccggcacaaacacctctaatcaggtggcagtgctgtaccaggacgtgaactgcacagaggtgcccgtggccattcacgctgatcagctgacccccacctggagagtgtacagcaccggaagcaacgtgttccagacaagagccggctgcctgatcggagccgagcatgtgaacaacagctacgagtgcgatattcccatcggcgctggcatctgcgctagctaccagtacccctacgacgtgcccgactacgcctgaggatcctctagagtcgacctgcagaagcttgcctcgagcagcgctgctcgagagatctacgggtggcatccctgtgacccctccccagtgcctctcctggccctggaagttgccactccagtgcccaccagccttgtcctaataaaattaagttgcatcattttgtctgactaggtgtccttctataatattatggggtggaggggggtggtatggagcaaggggcaagttgggaagacaacctgtagggcctgcggggtctattgggaaccaagctggagtgcagtggcacaatcttggctcactgcaatctccgcctcctgggttcaagcgattctcctgcctcagcctcccgagttgttgggattccaggcatgcatgaccaggctcagctaatttttgtttttttggtagagacggggtttcaccatattggccaggctggtctccaactcctaatctcaggtgatctacccaccttggcctcccaaattgctgggattacaggcgtgaaccactgctcccttccctgtccttctgattttgtaggtaaccacgtgcggaccgagcggccgcaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcaggggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatacgtcaaagcaaccatagtacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgatttgggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcgggctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaattttatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgct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第二核心质粒paav-cmv-rbd的基因序列为：cctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctgcggccgcacgcgtggagctagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgtcaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttgcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggattcgaatcccggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtctataggcccacaaaaaatgctttcttcttttaatatacttttttgtttatcttatttctaatactttccctaatctctttctttcagggcaataatgatacaatgtatcatgcctctttgcaccattctaaagaataacagtgataatttctgggttaaggcaatagcaatatttctgcatataaatatttctgcatataaattgtaactgatgtaagaggtttcatattgctaatagcagctacaatccagctaccattctgcttttattttatggttgggataaggctggattattctgagtccaagctaggcccttttgctaatcatgttcatacctcttatcttcctcccacagctcctgggcaacgtgctggtctgtgtgctggcccatcactttggcaaagaattgggattcgaacatcgattgaattcgccaccatgtccatgttccgcgtgcagccaaccgagagcatcgtgcggtttccaaacattacaaatctgtgccccttcggggaagtgtttaacgcaacaagatttgccagcgtgtacgcttggaacagaaagaggatttccaattgcgtggctgattacagcgtgctgtacaatagcgcatccttcagcacttttaagtgctacggcgtgtcccccactaaactgaacgacctgtgcttcaccaacgtgtacgccgatagctttgtgatcagaggagacgaagtgaggcagattgcacctggacagactgggaagatcgccgattacaactacaaactgccagatgacttcaccggatgcgtgatcgcttggaacagcaacaatctggacagcaaagtgggcggaaactacaattacctgtaccgcctgttccggaagtccaacctgaaaccctttgagagagatatctccacagaaatttaccaggcaggaagcactccttgcaacggcgtggaaggattcaattgctactttcctctgcagagctacgggtttcagccaaccaacggggtgggctaccagccctacagggtgtacccctacgatgtgcctgactacgcctgaggatcctctagagtcgacctgcagaagcttgcctcgagcagcgctgctcgagagatctacgggtggcatccctgtgacccctccccagtgcctctcctggccctggaagttgccactccagtgcccaccagccttgtcctaataaaattaagttgcatcattttgtctgactaggtgtccttctataatattatggggtggaggggggtggtatggagcaaggggcaagttgggaagacaacctgtagggcctgcggggtctattgggaaccaagctggagtgcagtggcacaatcttggctcactgcaatctccgcctcctgggttcaagcgattctcctgcctcagcctcccgagttgttgggattccaggcatgcatgaccaggctcagctaatttttgtttttttggtagagacggggtttcaccatattggccaggctggtctccaactcctaatctcaggtgatctacccaccttggcctcccaaattgctgggattacaggcgtgaaccactgctcccttccctgtccttctgattttgtaggtaaccacgtgcggaccgagcggccgcaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcaggggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatacgtcaaagcaaccatagtacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgatttgggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcgggctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaattttatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgt

s1的扩增引物f为：5‘-ccggaattcgccaccatgtttgtgtttctggtgctg-3‘，r：5‘-cgcggatcctcaggcgtagtcgggcacgtc-3‘

rbd的扩增引物f为：5‘-ccggaattcgccaccatgtccatgttccgcgtgcag-3‘，r：5‘-cgcggatcctcaggcgtagtcaggcacatc-3‘

步骤s22.三质粒共转染包装raav-s1及raav-rbd。

无内毒素提取第一核心质粒paav-cmv-s1和第二核心质粒paav-cmv-rbd以及两个辅助质粒，分别将第一核心质粒paav-cmv-s1和第二核心质粒paav-cmv-rbd与两个辅助质粒，按照摩尔比1：1：1的比例，用阳离子转染试剂pei共转染hek293t细胞，72小时后收取细胞，液氮/37℃水浴反复冻融四次，而后在4℃环境下，10000g离心10min后收集含重组腺相关病毒上清液，向上清液中加入核酸酶至终浓度为50u/ml，混匀，于37℃水浴锅中孵育1h，而后在4℃环境下，10000g离心10min，收集上清液；将上清液依次用0.45微米及0.22微米滤器过滤去除杂质蛋白，收集滤后样品，采用100kd蛋白超滤管进行超滤浓缩及去除细胞因子等杂质，置换的液体采用pbs(可加入万分之一pluronicf68，防止样品絮凝堵住膜包)。采用荧光定量pcr对raav-s1及raav-rbd滴度进行测定，分装后于-80℃保存。

具体地，ecori是大肠杆菌中的一种限制酶,能专一识别gaattc的序列,并在g和a之间将这段序列切开。bamhi是一种限制酶,能专一识别ggatcc的序列,并在g和g之间将这段序列切开。pei转染试剂是一种阳离子聚合物，分子量25000，它能与核酸形成复合物，并使该复合物进入哺乳动物细胞，pei转染试剂广泛适用于常见细胞系，如hek-293、hek293t、hepg2、hela、cho-k1、cos-1、cos-7、nih/3t3和sf9等，该试剂即使在有血清存在的情况下，它仍然能高效地将核酸导入细胞。pbs是磷酸缓冲盐溶液(phosphatebuffersaline)一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用，是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，主要成分为na2hpo4、kh2po4、nacl和kcl，由于na2hpo4和kh2po4它们有二级解离，缓冲液的ph值范围很广；而nacl和kcl主要作用为增加盐离子浓度。荧光定量pcr是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对pcr产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。hek293细胞分为几种，293a是用来包腺病毒，293t是用来包慢病毒，本实施例采用后者。

步骤s30.免疫健康产蛋母鸡，并收集其鸡卵。

步骤s31.选用健康的白来航母鸡，按照1e+11vg/只剂量，将raav-s1及raav-rbd多点接种鸡胸部肌肉，免疫20天后收集其鸡卵；

步骤s32.蛋壳消毒，蛋壳严重污染的，应事先选出进行单独消毒，用清水冲洗干净后与净蛋一同浸入水温42℃的0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15min，随后浸入90-95℃水浴中消毒5秒钟，快速取出后晾干，4℃环境下保存。

具体地，白来航母鸡原产意大利、分布世界甚广的著名蛋用型品种，该鸡体型小，成熟早，无就巢性，产蛋量高而饲料消耗少。

步骤s40.提取卵黄抗体

打开鸡卵，流掉蛋清，用滤纸吸去剩余蛋清，将卵黄液混匀，取10ml卵黄液放于离心管中，用硫酸铵沉淀法、聚乙二醇沉淀法、冷乙醇沉淀法或水稀释法，得到针对新冠病毒sars-cov2的刺突糖蛋白s1及rbd结构域的抗病原高免卵黄抗体，该卵黄抗体含有携带抗原蛋白的重组aav载体疫苗。

具体地，硫酸铵沉淀法的具体步骤为：

用去离子水7倍稀释卵黄，再用3ml浓度为0.1mol/l的hcl溶液，调节ph值至5.2后，4℃静置6h，12000r/min离心30min，过滤取上清液；

各取2ml上清液3份，加入饱和硫酸铵溶液至其终浓度分别为40％，60％，80％，4℃环境下过夜后，5000r/min离心25min。弃去上清液，将沉淀物分别以2ml纯水复溶。

具体地，聚乙二醇沉淀法的具体步骤为：

卵黄中加入20ml浓度为0.1mol/l的ph值为7.6的tris-hcl缓冲液，混合均匀后加入peg至其浓度为3.5％(w/v)并充分混合，000r/min离心25min，取上清液再加入peg至其终浓度为12％(w/v)并充分混合，12000r/min离心10min；

弃去上清液，将沉淀物用10ml的1×pbs溶液复溶，再加入peg至终浓度为12％(w/v)，充分混合。12000r/min离心10min，弃去上清液，

将沉淀物用10ml的1×pbs溶液复溶，再加入peg至终浓度w/v为12％，充分混合，12000r/min离心10min，弃去上清液，将沉淀物用2mlpbs溶液复溶。

其中，peg是聚乙二醇英文名polyethyleneglycol的简称，无毒、无刺激性，具有良好的水溶性，并与许多有机物组份有良好的相溶性。pbs溶液又称磷酸盐缓冲溶液，一般选择na2hpo4和kh2po4配制，因为钠盐溶解的较慢。根据不同ph值的溶液，称量不同质量的磷酸盐，也可以用ph计调节溶液的ph值。

具体地，冷乙醇沉淀法的具体步骤为：

用去离子水7倍稀释卵黄，用3ml浓度为0.1mol/l的hcl溶液，调节ph值至5.2后，4℃环境下静置6h，12000r/min离心30min，过滤取上清液；

再加入95％的冷乙醇，使终浓度至60％(v/v)，4℃环境下搅拌30min，置于4℃环境下10000r/min离心30min，得到沉淀物；

将沉淀物溶于10ml浓度为0.028mol/l的nacl溶液中，室温下过滤除脂，滤液中加入95％冷乙醇，使终浓度至30％(v/v)，充分混匀，并在4℃环境下，10000r/min离心30min，再将沉淀物溶解于2ml的pbs溶液中。

具体地，水稀释法的具体步骤为：

以去离子纯水稀释卵黄，调节ph值为7.6，4℃环境下搅拌4小时，离心后弃去沉淀，将上清液先用200kda滤膜过滤，再用150kda蛋白超滤管浓缩至2ml。

至此，通过上述步骤分别得到针对新冠病毒sars-cov2的s1蛋白及rbd结构域的保护性卵黄抗体。

二、免疫检测

针对sars-cov2的s1蛋白及rbd结构域的卵黄抗体，分别进行图谱检测、蛋白质浓度检测和与抗原的结合性检测。

1.图谱

将针对sars-cov2的s1蛋白及rbd结构域的卵黄抗体(上述方法制备的抗病原高免卵黄抗体)，取32μl，加入8μl5×蛋白上样buffer，沸水浴10min后冰上放置10min，点样，电压80v，sds-page电泳2h，电泳图分别如图8和9所示。

放入染色杠中，倒入改良考马斯染色液，微波炉中火1min，拿出放水平摇床摇10min后，换脱色液，微波炉中火1min，拿出放水平摇床摇10min，换脱色液重复2次后成像，分别如图8、图9所示。

检测结果：针对sars-cov2的s1蛋白及rbd结构域的抗病原高免卵黄抗体，按照sds-page凝胶电泳，经过改良型考马斯亮蓝染色后，图谱呈现两条条带，westernblotting检测可以在70kda和25kda处发现两条特异条带。

2.蛋白质浓度

采用紫外分光光度计测定蛋白质浓度在18-30mg/ml。

3.与抗原结合性

用间接免疫荧光进行检测：

1)分别将paav-cmv-s1及paav-cmv-rbd转染hek293t细胞，48h后

2)1×pbs洗3次，每次3min

3)4％多聚甲醛固定15min

4)1×pbs洗3次，每次3min

5)用含有5％bsa，0.1％tritonx-100的pbs将实验例2、实验例3所得抗病原高免卵黄抗体稀释200倍，加入培养板中，37℃孵育2h

6)1×pbs洗3次，每次3min

7)加入含绿色荧光标记兔抗igy的1×pbs，37℃孵育1h

8)1×pbs洗3次，每次3min

荧光显微镜下成像，分别如图10、图11所示。

检测结果：经间接免疫荧光检测其可以与新冠病毒sars-cov2保护性抗原s1结合。经间接免疫荧光检测其可以与新冠病毒sars-cov2保护性抗原rbd结合。

三.验证

为验证重组腺相关病毒载体可以感染鸡并表达蛋白，分别在细胞水平和活体水平进行验证：

1.细胞水平验证

用携带增强型绿色荧光蛋白基因的重组aav载体raav-cmv-egfp以moi＝100，接种鸡成纤维细胞df1，感染3天后使用荧光显微镜进行观察，可以看到绿色荧光蛋白表达(如图12所示)，证明raav可以感染鸡细胞并表达蛋白。

2、活体水平验证

用携带增强型绿色荧光蛋白基因的重组avv载体raav-cmv-egfp以1e+11vg/只剂量，接种健康白来航母鸡腿部肌肉，感染20天后，取材切片使用荧光显微镜进行观察，可以看到绿色荧光蛋白表达(如图13所示)，证明raav可以感染母鸡并表达蛋白。

本发明还公开了一种基于aav载体疫苗制备的抗病原高免卵黄抗体，根据上述制备方法制得。

本发明还公开了一种基于aav载体疫苗制备的抗病原高免卵黄抗体喷雾制剂，将上述的高免卵黄抗体利用0.06％葡萄糖溶液作为保护剂，使用喷雾干燥机干燥后，取200mg与5g山梨糖醇、0.05g三氯蔗糖、2g氢化蓖麻油和494.78g去离子水混合制得。采用喷雾形式，更有利于使用，操作难度小。

与现有技术相比，本发明，具有以下优点：

1.经过一次免疫健康产蛋鸡即可收集鸡卵，提取卵黄中的活性成分(抗病毒或细菌的高免卵黄抗体)，工作量大幅降低，人力、物力和时间成本降低；而且不易引起母禽应激，有效保证母禽的个体健康以及高免卵黄抗体的有效性。

2.利用具有安全性高、包装迅速简单、成本低、表达稳定的重组腺相关病毒(recombinantadeno-associatedvirus,raav)作为表达病毒或细菌的病原保护性抗原基因的载体疫苗，不是采用灭活病原，因此安全性高，避免了散毒风险；而且，腺相关病毒的宿主范围十分广泛且组织感染能力强，重组腺相关病毒删除了野生型aav的病毒结构，只留下cap蛋白、rep蛋白以及两端的反向互补序列itrs，既可高效的表达外源基因，又可以获得大量抗原性、免疫原性较好的、与天然蛋白功能相似的可溶性重组蛋白，不易被机体分解，可长期表达外源基因，而不依赖于宿主细胞活跃的分裂能力，因此能持续刺激免疫系统并最终获得有效的高免卵黄抗体。

3.本发明中制备高免卵黄抗体的方法，安全高效、快速、成本低、提取效率高、产量高，易于产业化，是面对重大突发疫情防控的重要手段。

4.本发明的抗病毒或细菌的高免卵黄抗体，采用紫外分光光度计测定蛋白质浓度在18-30mg/ml；经间接免疫荧光检测其可以与病毒或细菌的病原保护性抗原基因结合，即制备成喷雾制剂用于预防病毒或细菌引起的感染。

本发明并不局限于上述最佳实施方式，任何人应该得知在本发明的启示下做出的结构变化，凡是与本发明具有相同或相近的技术方案，均落入本发明的保护范围之内。