一种LncRNA标志物及其在急性心肌梗死诊断中的应用的制作方法

本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种lncrna标志物在急性心肌梗死诊断中的应用。

背景技术：

急性心肌梗死是一种具有高死亡率、高致残率和高医疗费用的急性心血管疾病，目前，急性心肌梗死已经成为一个突出的公共卫生问题和社会问题。急性心肌梗死是在冠状动脉粥样硬化的基础上，多因斑块的破裂而导致官腔内血栓形成血管阻塞，继而心肌因冠状动脉血流中断而坏死。在我国，随着生活方式和饮食结构的改变，ami的发病率正呈现出逐年上升的趋势。目前，临床实践中广泛使用的诊断心肌梗死的生物学标志物是肌钙蛋白（ctni），但是血浆中的肌钙蛋白浓度可能会在某些心脏和非心脏疾病如严重心力衰竭、心房颤动、慢性肾脏病、严重败血病等情况下出现假性升高。因此，探索在急性心肌梗死诊断中具有较高特异性和敏感性的生物标志物是十分必要的。

长链非编码rna是一类转录长度大于200nt的rna分子，他们并不编码蛋白，而是通过基因印记、染色质重构、调控细胞周期、可变剪切、mrna调控等形式在表观遗传、转录以及转录后调控等多层面调控基因表达，参与细胞代谢。由于长链非编码rna往往会形成相对稳定的二级结构，因此，可以在血液中被监测到。目前，长链非编码rna在心肌梗死中的研究还较少，而且相较于传统生化标志物，长链非编码rna具有高度的稳定性，因此，寻找对心肌梗死具有特异性和敏感性的长链非编码rna，对于早期诊断心肌梗死具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于特异性诊断急性心肌梗死的基因标志物。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种急性心肌梗死lncrna标志物，所述lncrna标志物为linc01104。

优选地，所述linc01104的序列如seqidno.1所示。

优选地，所述linc01104在急性心肌梗死患者中低表达。

此外，本发明提供了一种linc01104在制备诊断急性心肌梗死荧光定量pcr试剂盒中的应用。

优选地，所述pcr试剂盒包括用于特异性检测linc01104表达的引物对。

优选地，所述引物对的正向引物为5'-agggcatgacaggcaattca-3'，所述引物对的反向引物为5'-agtgatcctcttgccttggc-3'。

优选地，所述试剂盒还包括gapdh引物对、sybrgreen荧光染料、ddh2o。

除此之外，本发明提供了一种用于诊断急性心肌梗死的荧光定量pcr试剂盒，所述试剂盒包括用于特异性检测linc01104表达的引物对，所述引物对的正向引物为5'-agggcatgacaggcaattca-3'，所述引物对的反向引物为5'-agtgatcctcttgccttggc-3'。

优选地，所述试剂盒还包括gapdh引物对、sybrgreen荧光染料、ddh2o。

优选地，所述试剂盒用于诊断急性心肌梗死。

本发明的有益效果在于：

本发明证明了linc01104在正常人和急性心肌梗死患者的外周血血浆中存在差异，并且可以作为诊断急性心肌梗死的标志物。同时，本发明提供了一种可以特异性检测linc1104表达的荧光定量pcr试剂盒用于检测急性心肌梗死患者。相较于传统的生物标志物，本发明所提供的linc01104标志物具有更好的组织特异性和良好的稳定性，将大大提高急性心肌梗死诊断的敏感性和特异性。

附图说明

图1linc01104在正常组，急性心肌梗死组和治疗组中的表达差异

图2正常组和急性心肌梗死组之间的roc曲线

图3急性心肌梗死组和治疗组之间的roc曲线

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。需要明白，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。

本研究主要收集山东大学齐鲁医院（青岛）急性胸痛发生12h内的急性心肌梗死患者外周血血液（42例）和正常人外周血血液（42例）以及治疗后急性心肌梗死患者的外周血血液。

急性心肌梗死的诊断标准：1心肌生物标志物肌钙蛋白的变化超过参考值上限，并且有如下至少一项心肌缺血的证据：（1）有心脏缺血的临床症状；（2）提示有新的心肌缺血的典型心电图变化表现，例如st段改变、新发左束支传导阻滞；（3）心电图不同部位导联出现病理性q波。（4）影像学证据显示新发活力心肌损失或新发的区域性心肌壁运动异常。入选的急性心肌梗死患者均行冠状动脉造影术提示冠状动脉狭窄大于50%，并严格遵循中华医学会心血管分会等推荐在我国采用心肌梗死的全球统一的急性心肌梗死定义。正常人均为行冠状动脉造影检测排除冠心病的胸疼患者。

排除标准：明确诊断心肌病、房颤、严重室性心律失常、恶性肿瘤、慢性肝肾病、近期接受过外科手术的患者。

所有患者均接受常规治疗，知情并签署同意书。

实施例1

1.血浆样本的处理

将采集的血液于4℃冰箱静置冷藏30min后，与室温下3000rpm,离心15min，取上层血浆转移至1.5ml离心管中，保存于-20℃冰箱中备用。

2.血浆总rna提取

（1）将分离得到的血浆置于冰上融化，取250μl血浆样品至2ml离心管中，加入750μltrizol，吹打混匀后，静置5min；

（2）加入200μl氯仿，上下颠倒混匀20次，室温静置5分钟，12000转/分，离心15分钟；

（3）小心的将上层水相转移至新的无rna酶离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后冰上放置10min；

（4）13000转/分，4℃，离心10min，弃去上清，保留沉淀；

（5）加入500μl预冷的70%乙醇溶解沉淀，12000转/分，4℃，离心3分钟，弃去上清，室温干燥5-10min，加入40μldepc水，即得到rna。

3.逆转录反应

参照天根生物逆转录试剂盒：

（1）gdna去除反应体系

反应条件：pcr仪中42℃，3min，冰上放置。

（2）逆转录反应体系

反应条件：42℃孵育15min，95℃孵育3min，之后置于冰上。

4.荧光定量pcr

参照invitrogen公司的2xsybrgreenpcrmastermix说明书：

反应体系：

反应条件：95℃10min；95℃15s，60℃60s40个循环。

引物序列

linc01104

forwardprimer5'-agggcatgacaggcaattca-3'

reverseprimer5'-agtgatcctcttgccttggc-3'

gapdh

forwardprimer5'-acgtgtcagtggtggacctg-3'

reverseprimer5'-gtgtagcccaggatgccctt-3'

采用2^-△△ct方法处理实时定量pcr数据，计算linc01104的表达变化，实验结果如图1所示。

实验结果

实验结果如图1所示，从图中可以看出，急性心肌梗死组外周血血浆中的linc01104表达量（0.402±0.046）显著低于正常组，且差异具有统计学意义。

治疗组外周血血浆中的linc01104表达量（0.853±0.040）显著高于急性心肌梗死组，且差异具有统计学意义。说明linc01104可以作为诊断急性心肌梗死的标志物，并且可以作为急性心肌梗死患者的预后标志物。

正常组和急性心肌梗死组的roc曲线如图2所示，从图中可以看出，roc曲线的auc值为0.869，std.error0.03986，95%confidenceinterval0.7909to0.9472，pvalue<0.0001。说明linc01104作为急性心肌梗死诊断标志物具有优异的诊断价值。

急性心肌梗死组和治疗组的roc曲线如图3所示，从图中可以看出，roc曲线的auc值为0.8841，std.error0.04026，95%confidenceinterval0.8052to0.9630，pvalue<0.0001。说明linc01104作为急性心肌梗死预后标志物具有优异的诊断价值

实施例2

一种用于诊断急性心肌梗死的荧光定量pcr试剂盒

1.组成成分

linc01104引物对、gapdh引物对、sybrgreen荧光染料和ddh2o。

linc01104

forwardprimer5'-agggcatgacaggcaattca-3'

reverseprimer5'-agtgatcctcttgccttggc-3'

gapdh

forwardprimer5'-acgtgtcagtggtggacctg-3'

reverseprimer5'-gtgtagcccaggatgccctt-3'

2.添加方式

2.反应条件

反应条件：95℃10min；95℃15s，60℃60s40个循环。

序列表

<110>山东大学齐鲁医院（青岛）

<120>一种lncrna标志物及其在急性心肌梗死诊断中的应用

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>3115

<212>dna

<213>人源(human)

<400>1

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catgtctcccttttaggaaaaatagggattatggcgttcatctgtttcatccagaactag120

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attatttccacgagacaagcacgccagccattggctcataatgagctgaaagaccaatga360

ctgcttctcagagactccctagggcccagtgtcctgggggcagacctgtggctgagtcag420

catggtgcacagcagaaagtggggggagagtggccagcgctgccccggcgggctctgtct480

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ttggataacttccgctcgggagagaagcccaaactccgcgtcccggagacctgaagtgtg660

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tggtatccggtaggtgtgtctcattgttgttttaatttgcatttctctgatgacatatga840

tgtggattatcttttcatctgctcatttgccatctatatatcttctttgaggcatctgct900

cagatctttgcctttggccttttgttatctctaaaacacagaaggcggtgcagggtgcgt960

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accccaccaaagtgtctcagtttggacaataaccacagttattatccttgggaaaggaca1320

tttgggctctgacatctggcctggctgaatcacctcctccctgttggagggggtcagggg1380

tcagggttgcttccctggagctctggaaagaccagtgaaggtgagggaggtgtgacagta1440

gaaactgctgcgaagagcagactcctctgtccatgggcagggacctcaaaggctttcact1500

tcacacccacctccatcaacgtcaatggtcaccaaggtcctgaagccttcctgaatttct1560

tcctgcatttctccaaccagagcaattctctttctttgagtcctcaagtccacactgagc1620

ttctttctcctcccttagtacattccttctcctgagagacaggttaacatgcagcagctc1680

tgtgaccttgggcctcagtttccccatctgcaaaatgaggagggtcatagtgcctgtctc1740

atagagtcatgaagaggataaagtgaatgaatacatgtgatgtgctgggagcagcttcgg1800

acacatggaaatgttcgctatcattttaagcactgaatcttagattgtaagcatctttcc1860

tttaaaagagcaaagttcaaagttatatgttgagtaatgaccatatgccaggtgctttca1920

cacccacatcaatgctccagactccaagagctggcggtcattggatccagttcatagggt1980

ggagaagaggaggttcagagtggtgaactaacgggcccaggtcacacagcagaacagtga2040

aaaggtcatggatggcttaaaataccagcccttccttcaccctccttcagcctctttctc2100

tctctctctctctctctctcacacacacacacacacacacactcccttcataaaaatctc2160

acaatggcaagtgtcttatatgagacacacagaggagaagatcctgtgaagagggaggca2220

gagattggagaatcacagccacaagtcaaggaaggccgacaaccaccagaagctggaagg2280

ggtaagagcagcttccccgcgctgtttctagagggtgcatggccctgccagtaccttgat2340

tttggacttctggcttccacagttgtgagataatacactttccttgttttacgtcaacat2400

tttgtgtaatttgtctcggctgccacagaaagtgaatagaaatagttttccctcagcgca2460

acctggtgatgcacgtgttcactttgaaaacacgtcatttccacctgcaaaggttttagg2520

ttcctcaaagggactgtgcagagggatcgctgcaagtgaagtcaacatttggcctcattc2580

tgttagaacacctgcaagaggaggctcaggtgctgactgaacaaatcccctggctcttgg2640

ggtggtccatgcctttaccgaatgcctcctttgttggggtcattctgctgggaagacatt2700

cccattggaagatactggacctttcctttaccatgtcaggcatgacactcctacgttaaa2760

aaactgtccataccaagggcatgacaggcaattcatagaagaaagcaggatgatcaatgg2820

cctatgaaaggatcctcagctgtggctaggcgcagtggctcacctctgtaatcccagcac2880

tttgggaggccaaggcaagaggatcacttgagcccaggcgttcgagactggcatgggaaa2940

catggcaaaaccccatctctataaaaacttagctgggtgtggtggcatgtgcctggagtc3000

ccagctactcaggaggctgaggtgggaagatcatctaagcccagaaggttgagactgcag3060

tgagccaccatcgtaccactgcactccagcctggatgacagagtgaaaccctgtc3115

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

agggcatgacaggcaattca20

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

agtgatcctcttgccttggc20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

acgtgtcagtggtggacctg20

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

gtgtagcccaggatgccctt20