月季童期类型SNP分子标记及其应用的制作方法

本发明涉及观赏木本植物分子育种技术领域，尤其涉及月季童期类型snp分子标记及其应用。

背景技术：

木本植物童期较长，缩短木本植物童期，对促进木本植物育种及提高经济效益有重要的作用。要缩短木本植物童期就需要研究如何能够使植物提早完成从童期到成年期的营养阶段转变，提早获得开花能力。虽然在模式植物中已对营养阶段转变的分子机制有许多研究，且得到了一些重要的调控基因，但在木本植物中的研究还很缓慢。

现代月季(r.hybrida)是世界四大鲜切花中唯一的木本花卉，在世界鲜切花生产和贸易中占有举足轻重的地位。现代月季在全球范围内广受欢迎的原因之一就是它童期极短(仅20-30天)且能够全年连续开花。月季花(r.chinensis)是现代月季最重要的亲本，而童期极短且连续开花的性状就是月季花提供的(liorzouetal.,2016；raymondetal.,2018)。因此连续开花型月季在缩短木本植物童期的研究方面具有极大的优势。目前人们对月季的研究主要集中在花色、花型、抗病、连续开花等性状上，对童期性状尚无展开深入的研究。

技术实现要素：

本发明针对月季花童期极短且连续开花的性状的优势，对童期性状开展开深入的研究。开发了3个特异性强、稳定性高的月季童期类型snp分子标记，为进行月季童期性状关键基因在遗传连锁图谱上的精细定位及基因克隆、功能分析提供重要基础。

bsa(bulkedsegremantanalysis)混合分离群体分析是指通过构建两个极端表型基因混合池，筛选两个混池之间具多态性的分子标记，这些标记即为与目标性状基因连锁的分子标记。

bsr-seq(bulkedsegregantrna-seq)混合池转录组测序技术是将bsa和转录组测序相结合，分析一对相对性状的两个极端混合池在转录本水平的序列变异(snp)，开发决定目标性状基因的遗传标记，进而快速定位目的基因。

本发明利用bsr技术，获得三个月季童期类型snp分子标记，snp分子标记的标号分别为：ch3r_25426663、ch3r_9699185、ch3r_17371798，其核苷酸序列分别如seqno.1、seqno.2和seqno.3所示。

本发明还提供了ch3r_25426663、ch3r_9699185、ch3r_17371798的特异性pcr引物，ch3r_25426663正向引物序列如seqno.4所示，其反向引物序列如seqno.5所示，其延伸引物如seqno.6所示；ch3r_9699185正向引物序列如seqno.7所示，其反向引物序列如seqno.8所示，其延伸引物如seqno.9所示；ch3r_17371798正向引物序列如seqno.10所示，其反向引物序列如seqno.11所示，其延伸引物如seqno.12所示。

本发明的又一目的是提供上述月季童期类型snp分子标记在在筛选或鉴定童期性状基因分型中的应用。

具体地，上述应用包括以下步骤：

s1提取待测植株的基因组dna；

s2以待测植株的基因组dna为模板，利用扩增所述分子标记的引物，进行pcr扩增反应；

s3检测pcr扩增产物，如果扩增产物相应snp位点表现纯合，则待测植株为极短童期类型，如果相应snp位点表现为杂合或另一碱基的纯和时，则待测植株为较长童期类型。

此外，本发明的月季童期类型snp分子标记还可应用在童期性状定向分子育种中的应用。

本发明还提供了包含上述的月季童期类型snp分子标记的试剂盒。

本发明的有益效果：

(1)本发明利用bsr技术开发月季童期类型分子标记，其周期短、成本低、效率高，可为在其他物种中开发特异性分子标记提供重要的成功案例，也为分子育种、遗传多样性、分子标记辅助选择育种提供了重要的开发途径。

(2)本发明所获得的snp分子标记或试剂盒在不同材料和不同群体中表现重复性好、扩增稳定，不受环境条件的影响。

(3)本发明提供的引物用于massarray结合maldi-tof质谱技术，可以快速经济地进行基因分型分析，一个样本可以同时检测多个snp位点，大大降低snp检测成本。

(4)本发明筛选出的3个月季童期类型snp分子标记，可用于月季童期类型性状在遗传连锁图谱上的精细定位，从而促进童期类型性状关键决定基因的锁定，加快实现童期性状定向分子育种的进程。此外还可为其它木本植物缩短童期的研究提供参考。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例3提供的ch3r_25426663、ch3r_9699185、ch3r_17371798对zf群体的182个单株基因分型验证结果。

图2是本发明实施例3提供的ch3r_25426663、ch3r_9699185、ch3r_17371798对zh群体的80个单株基因分型验证结果。

图3为本发明实施例3提供的ch3r_25426663、ch3r_9699185、ch3r_17371798对21个月季和蔷薇属野生种基因分型验证结果。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合附图对本发明作进一步的详细介绍。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述。

实施例1基于bsr技术开发月季株型性状分子标记

本发明采用‘窄叶藤本月季花’ב月月红’f1子代(zh群体)和‘窄叶藤本月季花’ב月月粉’f1子代体(zf群体)作为试验群体。zh群体与zf群体中性状分离比均为接近1:1。随机选择182株zf群体植株(cf71株；if111株)和80株zh群体植株(cf42株；if38株)作为对snp分子标记的验证材料。同时对snp标记在7个二倍体的四季开花型月季品种(极短童期型)和13个二倍体单季开花型(较长童期型)月季和蔷薇属野生种进行snp基因分型。月季品种中包括了zf群体和zh群体的父母本，野生种中涵盖了蔷薇属的七个组。所有材料均定植于国家花卉工程移栽技术研究中心北京小汤山实验基地(北纬n40°02′，东经e115°50′)。

zf群体中极短童期型和较长童期型的单株各150株，等量混合提取rna。使用rnapreppureplantkit天根植物总rna提取试剂盒(dp432)提取总rna，样品浓度大于100ng/μl。得到的rna样品先检测是否被污染或降解(琼脂糖凝胶电泳法)，使用qubit精确检测样品的浓度，然后使用nanodrop2000检测样品的纯度，最后进行样品完整性检测(rnanano6000试剂盒，agilent2100)。对rna样品进行转录组测序。测序得到的cleanreads与‘月月粉’基因组(https://iris.angers.inra.fr/obh/)(hibrandsaint-oyantetal.,2018)进行比对。使用samtools(v0.1.18)软件进行mpileup分析生成bcf文件，然后使用bcftools软件进行snp的分析。结果显示snp变异频率越高与目标性状的相关性越高。

实施例2snp标记基因分型引物的设计

根据bsr测序结果，选择与目标性状相关性最高的三个snp标记(ch3r_25426663、ch3r_9699185、ch3r_17371798)进行基因分型验证。利用snp位点两侧各300bp的序列设计snp扩增和延伸引物，质谱分型法所用的pcr反应和延伸引物序列详见表1。

表1质谱法检测snp标记基因分型引物

实施例3标记的准确性、稳定性、重复性检测

基因组dna的提取采用dna提取试剂盒法(tiangen，dp305)，按照试剂盒说明书进行具体操作。使用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测dna的质量和浓度，确保dna模板的完整性。

在zf群体、zh群体和品种及野生种中，利用massarraycompactsystem(sequenom,sandiego,ca)对3个snp标记进行分型验证。质谱法分型所需pcr反应引物和延伸引物见表1。利用hotstartaqdna聚合酶(qiagen)在384孔板种进行pcr扩增，每孔5μl扩增体系。pcr反应程序及sap消化反应(shrimpalkalinephosphatase)处理依据sequenomiplexapplicationguide(version1,sequenom,sandiego,ca)中的说明。引物的延伸利用iplextmreagentkit(sequenom)试剂盒进行，具体步骤详见说明书。将延伸的反应产稀释3倍后，使用树脂进行脱盐。将脱盐处理后的样品点在样品靶上，自然结晶，然后上机进行质谱检测，并收集数据。利用typer软件分析实验结果，得到基因型数据。

ch3r_25426663、ch3r_9699185、ch3r_17371798的基因分型结果如表2所示。

表2分子标记在不同童期类型中的基因分型

结果表明，从zf群体中通过bsr技术的到的三个snp标记ch3r_25426663、ch3r_9699185、ch3r_17371798对zf群体的182个单株、zh群体的80个单株、21个月季和蔷薇属野生种进行基因分型验证，成功率见图1-3，发现准确率最高的为ch3r_25426663，在各群体极短童期个体中准确率高达95.8％、90.5％和100％。ch3r_9699185在各群体极短童期个体中准确率高达77.5％、81.0％和85.7％。ch3r_17371798在各群体极短童期个体中准确率高达77.5％、90.5％和100％。三个标记在各群体较长童期型个体中准确率也同样很高。

本发明建立的snp标记可用于月季童期类型性状在遗传连锁图谱上的精细定位，从而促进童期类型性状关键决定基因的锁定，加快实现童期性状定向分子育种的进程。

以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，上述附图和描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。对与该技术领域的普通技术人员来说，在不偏离本发明原理的前提下，如做出稍微的改进和修饰，也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>运城学院

<120>月季童期类型snp分子标记及其应用

<160>12

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>401

<212>dna

<213>r.chinensis

<400>1

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