一种真菌操纵子的基因表达元件及其应用的制作方法

本发明涉及基因定向表达线路合成
技术领域：
，具体涉及一种真菌操纵子的基因表达元件及其应用，更具体涉及一种真菌操纵子的基因表达元件及其在实现多个外源基因的偶联表达中的应用。
背景技术：
：基因工程和合成生物技术已成为研究和改良作物性状的重要手段，传统的基因工程表达包括利用组成型启动子驱动单个基因的表达获得相应的性状，或利用组成型启动子驱动两个甚至多个目标基因聚合表达获取复合性状。新一代基因工程技术通过发展组织特异性启动子及各种调控元件应用于基因的定向表达，使其趋向于智能化、有效化、精细化、安全化和环境友好化表达和整合，可广泛应用于农业生物改造，包括植物、动物与微生物。基因工程技术在作物上的研究相对比较成熟，新一代的分子设计育种通过调控元件设计和模块组装可望创制突破性的品种，建立基因定向表达与整合技术的平台，实现基因表达或整合部位精准控制，对于推进基因工程相关技术和产业的发展具有重大的现实意义。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题为如何实现两个或两个以上基因在植物原生质体中的偶联表达(共表达)，如在水稻原生质体中的偶联表达。为解决上述技术问题，本发明首先公开了一种dna分子。本发明所述dna分子为真菌操纵子的基因表达元件，其核苷酸序列为seqidno.1所示。上述dna分子在两个或两个以上基因偶联表达中的应用也在本发明的保护范围之内。本发明进一步提供了包含上述dna分子的融合基因。本发明所述融合基因包括两个或两个以上基因，及位于相邻两个基因之间的上述dna分子。上述融合基因中，所述基因可以为红色荧光蛋白(rfp)基因和绿色荧光蛋白(egfp)基因，即融合基因依次包括红色荧光蛋白基因、seqidno.1所示的dna分子和绿色荧光蛋白基因；所述基因也可以为甲基转移酶osddm1a基因和去甲基酶osalkbh1基因，即融合基因依次包括甲基转移酶osddm1a基因、seqidno.1所示的dna分子和去甲基酶osalkbh1基因。上述融合基因中，所述红色荧光蛋白基因为如下b1)或b2)所示：b1)编码序列为seqidno.2第758-1453位的dna分子；b2)将seqidno.2第758-1453位的dna分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与b1)具有相同功能的dna分子；所述绿色荧光蛋白基因为如下b3)或b4)所示：b3)编码序列为seqidno.2第1463-2185位的dna分子；b4)将seqidno.2第1463-2185位的dna分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与b3)具有相同功能的dna分子。上述融合基因中，所述甲基转移酶osddm1a基因为如下c1)或c2)所示：c1)编码序列为seqidno.3第758-3295位的dna分子；c2)将seqidno.3第758-3295位的dna分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与c1)具有相同功能的dna分子；所述去甲基酶osalkbh1基因为如下c3)或c4)所示：c3)编码序列为seqidno.3第3305-4420位的dna分子；c4)将seqidno.3第3305-4420位的dna分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与c3)具有相同功能的dna分子。含有上述dna分子或上述融合基因的表达盒或重组表达载体也在本发明的保护范围之内。上述重组表达载体为将上述融合基因插入表达载体中，得到能表达相应蛋白的重组表达载体。在本发明的具体实施例中，采用的表达载体为水稻原生质体瞬时转化载体pan580。包含红色荧光蛋白rfp基因和绿色荧光蛋白egfp基因的融合基因的重组表达载体为pan580-rfp-9bp-egfp；包含甲基转移酶osddm1a基因和去甲基酶osalkbh1基因的融合基因的重组表达载体为pan580-osddm1a-9bp-osalkbh1；其中，9bp为seqidno.1所示的真菌操纵子的基因表达元件。上述融合基因或表达盒或重组表达载体在两个或两个以上基因偶联表达中的应用也在本发明的保护范围之内。本发明进一步提供了两个或两个以上基因偶联表达的方法。本发明两个或两个以上基因偶联表达的方法，包括将上述融合基因、表达盒或重组表达载体转化到植物原生质体，实现两个或两个以上基因在植物原生质体中的偶联表达。上述方法中，所述植物原生质体为水稻原生质体；具体为水稻叶鞘原生质体。本发明通过seqidno.1所示的真菌操纵子的基因表达元件将红色荧光蛋白(rfp)基因和绿色荧光蛋白(egfp)基因连接得到融合基因并转化到水稻原生质体中，可观察到明显的绿色荧光及红色荧光信号，说明通过seqidno.1所示的真菌操纵子的基因表达元件(9bp)串联后的gfp及rfp基因同时可以得到表达；进一步利用真菌操纵子的基因表达元件将甲基化修饰相关的甲基转移酶osddm1a基因和去甲基酶osalkbh1基因连接得到融合基因，并转化到水稻原生质体内完成具有降低基因组甲基化修饰作用的两个基因(即甲基转移酶osddm1a基因和去甲基酶osalkbh1基因)的偶联表达，实现智能感应温度变化后改变水稻基因组甲基化水平，进而影响植物抗逆能力。本发明利用真菌操纵子的基因表达元件实现定点偶联两个或两个以上外源基因，不需额外启动子，可有效防止外源基因的丢失，减少宿主遗传负担，定量和定时偶联表达外源基因，实现智能响应环境。附图说明图1为水稻原生质体瞬时转化载体pan580的结构示意图。图2为水稻原生质体瞬时转化载体prtv-crfp的结构示意图。图3为水稻原生质体瞬时转化载体prtv-cgfp的结构示意图。图4为包含红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白编码基因的片段pcr产物电泳图谱图。图5为瞬时转化载体pan580-rfp-9bp-egfp及pan580-osddm1a-9bp-osalkbh1和的结构示意图。图6为荧光共聚焦技术检测pan580-rfp-9bp-egfp中egfp、rfp蛋白表达。图7为pan580-osddm1a-9bp-osalkbh1载体转化水稻原生质体利用dotblot检测dna6ma水平变化。图8为pan580-osddm1-9bp-osalkbh1载体转化水稻原生质体利用lc/ms检测dna6ma水平变化。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本发明发明人对丝状真菌glarealozoyensisatcc20868glpks3/glnrps7两个基因间隔区(tgttgagtcaatcaaacactcaacag，26bp)进行优化后得到如seqidno.1所示的真菌操纵子的基因表达元件(caatcaaac，9bp)，该真菌操纵子的基因表达元件(9bp)实现两个或两个以上在植物原生质体中的偶联表达，尤其是在水稻原生质体中的偶联表达。实施例1荧光共聚焦技术检测瞬时转化载体pan580-rfp-9bp-egfp中egfp、rfp蛋白表达一、瞬时转化载体pan580-rfp-9bp-egfp的构建1、利用spei、psti限制性酶对水稻原生质体瞬时转化载体pan580(结构示意图如图1所示，序列如seqidno.4所示)进行双酶切，得到目的载体片段。2、pcr扩增包含红色荧光蛋白(rfp)编码基因和绿色荧光蛋白(egfp)编码基因的片段：以水稻原生质体瞬时转化载体prtv-crfp(genbank:mh373674.1，结构示意图如图2所示)为模板，利用引物pan580-rfp-f1和rfp-r1(表1)进行pcr扩增，得到的pcr产物利用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，结果如图4，得到如seqidno.2第738-1480位的包含红色荧光蛋白(rfp)编码基因的片段，其中，红色荧光蛋白(rfp)的编码基因的序列如seqidno.2第758-1453位所示，真菌操纵子的基因表达元件的序列如seqidno.2第1454-1462位所示。以水稻原生质体瞬时转化载体prtv-cgfp(genbank:mh373672.1，结构示意图如图3所示)为模板，利用引物egfp-f1和pan580-egfp-r1(表1)进行pcr扩增，得到的pcr产物利用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，结果如图4，得到如seqidno.2第1443-2205位的包含绿色荧光蛋白(egfp)编码基因的片段，其中，绿色荧光蛋白(egfp)的编码基因的序列如seqidno.2第1463-2185位所示，真菌操纵子的基因表达元件位于seqidno.2第1454-1462位。表1引物序列3、将步骤2得到的包含红色荧光蛋白(rfp)编码基因的片段、包含绿色荧光蛋白(egfp)编码基因的片段与步骤1得到的目的载体片段利用无缝克隆试剂盒进行重组，最终得到如seqidno.2所示的重组载体pan580-rfp-9bp-egfp(结构示意图如图5所示)；其中，红色荧光蛋白(rfp)的编码基因位于seqidno.2第758-1453位、绿色字体序列为绿色荧光蛋白(egfp)编码基因位于seqidno.2第1463-2185位、真菌操纵子的基因表达元件(9bp)位于seqidno.2第1454-1462位。实施例2瞬时转化载体pan580-osddm1a-9bp-osalkbh1的构建1、利用spei、psti限制性酶对水稻原生质体瞬时转化载体pan580(结构示意图如图2所示)进行双酶切，得到目的载体片段。2、pcr扩增得到包含甲基转移酶(osddm1a)的片段和包含去甲基酶(osalkbh1)的编码基因的片段。其中，甲基转移酶osddm1a编码基因的序列如seqidno.3第758-3295位所示；去甲基酶osalkbh1编码基因的序列如seqidno.3第3305-4420位所示。3、将步骤2得到的包含甲基转移酶osddm1a编码基因的片段和包含去甲基酶(osalkbh1)的编码基因的片段与步骤1得到的目的载体片段利用无缝克隆试剂盒进行重组，最终得到如seqidno.3所示的瞬时转化载体pan580-osddm1a-9bp-osalkbh1(结构示意图如图5所示)；其中，甲基转移酶osddm1a编码基因位于seqidno.3第758-3295位；去甲基酶osalkbh1编码基因的序列如seqidno.3第3305-4420位所示；真菌操纵子的基因表达元件位于seqidno.3第3296-3304位。实施例3水稻原生质体的制备及转化1、水稻原生质体的制备及转化所需溶液配制1.1配制以下母液：100mmmes(4-吗啉乙磺酸)缓冲液：称取1.95gmes溶于100mlddh2o，用koh调节溶液ph值5.7。100mmkcl：称取0.7455gkcl溶于100mlddh2o。1mmgcl2：称取10.165gmgcl2溶于50mlddh2o。100mmmgcl2：称取2.03gmgcl2溶于100mlddh2o。1mcacl2：称取7.351gcacl2溶于50mlddh2o。100mmcacl2：称取1.47gcacl2溶于100mlddh2o。1.2配制水稻原生质体酶解液(现配现用)1.3配制mmg溶液组分水稻终浓度甘露醇1.093g0.6m/0.4m0.1mmgcl21.5ml0.1％100mmmes400μl4mm1.4配制w5溶液1.5配制40％peg溶液(1)称取4gsigmapeg3350(sigma-fluka,#81240)溶解于3mlddh2o，得到溶液1；(2)1.093g甘露醇溶解于2mlddh2o，再加入1ml1mcacl2溶液，可加热至65℃助溶，得到溶液2。将上述液体1和溶液2完全混合均匀，用koh调节溶液ph值7.5-8.0，最后定容至10ml。2、水稻叶鞘原生质体制备及转化(1)水稻日本晴种子露白后，移至96孔板中避光培养8-10天，每天更换一次自来水。用蓝吉列刀片将40棵水稻幼苗茎切为1mm小段，置于盛有20ml酶解液的小烧杯(包裹锡纸)中，酶解液使用时全程避光。(2)用锡纸封住烧杯口，用枪头扎一个小洞，30分钟抽真空，压力0.6-0.8；抽真空后将烧杯轻轻转移至28度摇床，50rpm，振荡4h后镜检。(3)将剪过的蓝枪头用火烧一下，保证边缘平滑，在酶解液底部吸取300-400μl，转移至双凹载玻片上，用普通光学显微镜镜检，一般用10×物镜，若能轻易找到原生质体，且无破碎则可进行下一步；若原生质体少，则延长酶解时间，若原生质体在酶解4h时就大量破碎，则可能于溶液配制或水稻幼苗材料的状态有关。(4)贴壁缓缓加入等体积的w5溶液，经300目的筛子过滤，将滤液收集培养皿中。用剪过的蓝枪头将滤液转移至50ml离心管。全程动作轻柔，以防破坏原生质体。(5)低速离心，170×g离心3min，加速和减速度均设置为1。(6)用移液器转移离心后上清，弃去上清。贴壁缓缓加入15-20mlw5溶液(清洗原生质体)，不用吹打混匀。(7)低速离心，170×g离心3min，加速和减速度均设置为1。(8)用移液器转移离心后上清，弃去上清。加入mmg溶液250μl，轻轻混匀，得到水稻叶鞘原生质体。用细胞计数板在显微镜下计数，每100μl包含8×104至2×105个细胞。(9)取100ul水稻叶鞘原生质体，加入100μg瞬时转化载体pan580-rfp-9bp-egfp，轻轻混匀，得到细胞悬浮液，然后加入此时细胞悬浮液1.1倍体积的40％peg(250μl体系对应275μlpeg)。peg较粘稠，吸取时注意剪枪头，缓慢加入，盖紧盖子后轻轻转动管体使体系均匀。28℃避光放置20min。(10)加入此时体系10倍体积的w5溶液(10×(250+275μl))，可取近似值：加入w5溶液体积为10×500μl。低速离心，170×g3min，加速和减速度均设置为1g。(11)用移液器吸取离心后上清液，弃去上清。再次加入w5溶液5ml，低速离心，170×g3min，加速和减速度均设置为1g。(12)离心完成后，转移并弃去绝大部分上清液，最后保留1ml上清液及沉淀于管底。加入1μl羧苄(100mg/ml)，发挥抑菌作用。轻轻混匀，28℃避光静止培养16h。3、荧光蛋白信号检测原生质体中转化pan580-rfp-9bp-egfp后egfp、rfp蛋白表达使用激光共聚焦显微镜(zeisslsm700)进行观察，egfp蛋白基因开放阅读框(orf，openreadingframe)表达有功能的蛋白，在488nm下发绿光；rfp蛋白基因orf在563nm下发红光。结果如图6所示，结果表明：瞬时转化pan580-rfp-9bp-egfp的水稻原生质体内观察到明显的绿色荧光及红色荧光信号，说明通过seqidno.1所示的真菌操纵子的基因表达元件(9bp)串联后的gfp及rfp基因同时可以得到表达。4、dotblot检测dna6madot-blot法，即斑点印迹杂交法，是一种快速检测特异核酸(dna或rna)分子的核酸杂交技术。该方法通过将核酸样品直接转移到适当的杂交滤膜上，然后利用抗体与核酸修饰的特异性结合，从而达到定性检测核酸样品中特异性修饰的目的。将步骤2中的pan580-rfp-9bp-egfp替换为pan580-osddm1a-9bp-osalkbh1，其他步骤与步骤2相同，进行水稻叶鞘原生质体制备和转化试验。在转化前和转化后分别提取水稻叶鞘原生质体的基因组dna，进行dot-blot检测转化前后的水稻叶鞘原生质体的dna6ma的变化趋势。具体操作步骤如下：(1)在200μlpcr管内使用ddh2o设置dna浓度梯度(50ng/ul、100ng/ul、200ng/ul、400ng/ul)，pcr仪内95℃变性3min后，立即将pcr管取出，置于冰上3min以上。(2)取合适大小的nc膜置于塑料培养皿内，取1μldna样品点在nc膜上。(3)待膜干燥后，调整紫外交联仪至200kj/cm2，将培养皿打开盖子后放置在交联仪内进行紫外交联，20s后即可取出。(4)在皿内加入20ml5％脱脂奶粉封闭1h。(5)倒掉培养皿内的脱脂奶粉，使用pbst溶液清洗膜3次，每次1min。(6)使用5mlpbst溶液按照1:1000比例稀释anti-6ma抗体(购自synapticsystems，货号为202003)后，加入到培养皿内，4℃过夜(7)回收一抗至离心管内，4℃保存。使用pbst溶液清洗膜3次，每次1min。(8)使用10mlpbst溶液按照1:5000比例稀释辣根过氧化物酶标记的anti-mouseigg抗体后，加入到培养皿内，室温孵育1h。(9)使用pbst溶液清洗膜3次，每次1min。(10)将膜上的液体使用无尘纸吸干后，各取500μlecl发光底物a液和b液充分混匀后，将膜浸没至发光底物中反应2min。(11)使用化学发光检测成像系统检测信号并拍照分析。结果如图7所示，转化前后，从瞬时转化pan580-osddm1a-9bp-osalkbh1的水稻原生质体中提取基因组dna进行6ma点杂交，转化后基因组dna6ma修饰水平降低，说明串联基因模块osddm1a-9bp-osalkbh1转化后发挥去甲基化修饰功能。5、lc/ms检测dna6malc-ms/ms法为液相色谱-串联质谱法，即将液相色谱仪与质谱仪联用来对复杂混合物进行定性与定量分析的方法，并且简化了样品的先处理过程，使得样品的分析更加简便。lc-ms/ms可以通过采集质谱得到总离子色谱图，由于电喷雾是一种软电离源，通常很少或没有碎片，谱图中只有准分子离子，因而只能提供未知化合物的分子量信息，之后再串联使用一个单级ms，不使用软电离源，而用ei电离源的话，就可以得到碎片离子峰，从而定性分析结构信息。即lc-ms/ms可以对样品进行定量与定性地分析。将步骤2中的pan580-rfp-9bp-egfp替换为pan580-osddm1a-9bp-osalkbh1，其他步骤与步骤2相同，进行水稻叶鞘原生质体制备和转化试验。在转化前和转化后分别提取水稻叶鞘原生质体的基因组dna，利用lc-ms/ms法定量检测转化前后水稻叶鞘原生质体dna6ma修饰量的变化。具体操作步骤如下：(1)用核酸酶p1、磷酸二酯酶i、30mm醋酸钠和2mm氯化锌调整dna至400μl体系。(2)37℃孵育3h后，加入1μl细菌碱性磷酸酶(10u/μl)。(3)继续37℃孵育1h，将rna消解成单个核糖核苷。(4)使用10kda超滤管，12000rpm离心15min，将超滤管2ml收集管中的液体转移至进样瓶内。(5)使用安捷伦6400三重四级杆液相色谱质谱联用仪器，屈臣氏蒸馏水(0.1％甲酸)和乙腈(0.1％甲酸)作为流动相，goldaq柱子(100mm*2.1mm)孔径1.9μm，设定离子对进样检测。结果如图8所示，转化前后，从瞬时转化pan580-osddm1a-9bp-osalkbh1的水稻原生质体中提取基因组dna利用lc/ms进行6ma修饰水平检测，转化后基因组dna6ma修饰水平降低，说明串联基因模块osddm1a-9bp-osalkbh1转化后发挥去甲基化修饰功能。以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。sequencelisting<110>中国农业科学院生物技术研究所<120>一种真菌操纵子的基因表达元件及其应用<130>gncfy200760<160>4<170>patentinversion3.5<210>1<211>9<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1caatcaaac<210>2<211>5350<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ccctacccctactccaaaaatgtcaaagatacagtctcagaagaccaaagggctattgag60acttttcaacaaagggtaatttcgggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgt120cacttcatcgaaaggacagtagaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgat180aaaggaaaggctatcattcaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggaccccca240cccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggat300tgatgtgacatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccacccctactccaaaaat360gtcaaagatacagtctcagaagaccaaagggctattgagacttttcaacaaagggtaatt420tcgggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttcatcgaaaggacagta480gaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggctatcattcaa540gatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaa600aaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgacatctccactgac660gtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagt720tcatttcatttggagaggacagcccagatcaactagtatgagcgagctgattaaggagaa780catgcacatgaagctgtacatggagggcaccgtgaacaaccaccacttcaagtgcacatc840cgagggcgaaggcaagccctacgagggcacccagaccatgagaatcaaggtggtcgaggg900cggccctctccccttcgccttcgacatcctggctaccagcttcatgtacggcagcagaac960cttcatcaaccacacccagggcatccccgacttctttaagcagtccttccctgagggctt1020cacatgggagagagtcaccacatacgaagacgggggcgtgctgaccgctacccaggacac1080cagcctccaggacggctgcctcatctacaacgtcaagatcagaggggtgaacttcccatc1140caacggccctgtgatgcagaagaaaacactcggctgggaggccaacaccgagatgctgta1200ccccgctgacggcggcctggaaggcagaagcgacatggccctgaagctcgtgggcggggg1260ccacctgatctgcaacttcaagaccacatacagatccaagaaacccgctaagaacctcaa1320gatgcccggcgtctactatgtggaccacagactggaaagaatcaaggaggccgacaaaga1380gacctacgtcgagcagcacgaggtggctgtggccagatactgcgacctccctagcaaact1440ggggcacaagtgacaatcaaacatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggt1500gcccatcctggtcgagctggacggcgacgtgaacggccacaagttcagcgtgtccggcga1560gggcgagggcgatgccacctacggcaagc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