用于多肽生产的细胞培养组合物和方法与流程
本申请为2013年4月24日提交的，发明名称为“用于多肽生产的细胞培养组合物和方法”的申请号为201380032959.7的分案申请。
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2012年4月24日递交的美国临时申请系列号61/637,778、2012年4月24日递交的美国临时申请系列号61/637,780、和2013年3月15日递交的美国临时申请系列号13/841,864的优先权，这些美国临时申请之每一个的内容特此完整地并入此处作为参考。
背景技术：
使用重组细胞培养物体外生产蛋白质的方法是熟知的，其用于工业规模生产基于蛋白质的药物产品。然而，对于从重组细胞培养物有效地制备蛋白质而言，仍然存在显著的挑战。例如，基于蛋白质的药物产品有某些品质属性，例如大小分布、序列完整性、和产品颜色，可能受蛋白质生产方法的影响。
蛋白质药物产品的颜色是尤其令人关注的一个品质属性。此外，也必须符合对蛋白质基药物产品的可接受颜色水平的监管要求。因此，生产具有可接受的颜色(例如，以满足产品市场化的监管要求)的蛋白质产品是药物生产的一个重要方面。建立与早先临床材料的产品质量可比性也可能是关键的。
最近在单克隆抗体皮下递送方面的趋势伴随着制剂中药物物质的浓度增加(例如,达到≥150mg/ml)。在这些浓度，药物产品的颜色可能更强，使得更难于生产具有可接受颜色的蛋白质基药物产品。细胞培养条件可能影响蛋白质基药物产品的品质属性。用于培养细胞的培养基对蛋白质生产可能具有尤其显著的影响。
用于体外生产蛋白质的重组dna技术在历史上使用培养在培养基中的细胞系，其中培养基中补充有变化的、化学不确定的培养基组分例如动物血清和蛋白胨。化学不确定的营养物可能导致批与批之间的变异，并且动物来源的产品可能造成不期望成分对培养基的污染。化学成分确定的细胞培养基(cdm)，其组成已知且在批次间一致，已被开发用于解决这些问题。由于与使用cdm生产蛋白质相关的各种优点，工业广泛的趋势是从含血清和含蛋白胨的方法转变为利用cdm的方法。各种cdm已经描述在专利文献中，例如美国专利号4,767,704；5,691,202；6,048,728；6,900,056；和7,601,535,以及u.s.专利申请公布号20030087372和20110039330。然而，化学不确定的培养基仍继续用于蛋白质生产中。
持续需要提供改善的、成本有效的蛋白质(例如抗体)体外生产方法，其中所述蛋白质具有可接受的产品品质属性。调节一种或多种产品品质属性的细胞培养基是期望的。具有如下成分的细胞培养基，无论是化学不确定的还是化学确定的，将可以用于开发蛋白产品，例如抗体(例如用于皮下注射)，其中所述成分可以一贯地生产较低颜色强度的蛋白质产品，同时保持期望的蛋白质浓度(例如≥150mg/ml)。
发明概述
本发明描述可以提供具有可接受颜色的药物产品的细胞培养基、以及将该培养基用于细胞生长(即，细胞培养)和/或蛋白质生产的方法。本发明还提供这样的培养基，所述培养基可以提供具有可接受颜色的蛋白质基药物产品并同时保持期望的蛋白质基药物产品浓度(例如≥100mg/ml或≥150mg/ml)，该培养基可以用于蛋白质生产方法，例如用于生产皮下注射用抗体。本文描述的细胞培养基可以是化学不确定的或是cdm。本发明还考虑组合物，所述组合物含有本文描述的培养基和多肽(例如由宿主细胞分泌至培养基的多肽)和/或含有编码多肽的分离核酸的细胞。本发明提供通过本文描述的方法制备的多肽、以及含有该多肽和载体(例如可药用载体)的制剂。该多肽制剂一方面具有可接受的颜色，同时保持至少100mg/ml或150mg/ml的蛋白质基药物产品浓度。
本文描述的细胞培养基一般以实现蛋白质产品品质属性例如颜色的量含有一种或多种下述成分：(a)胱氨酸或半胱氨酸；(b)维生素b2,(c)维生素b6(吡哆醇和/或吡哆醛,其可以以hcl盐的形式提供),(d)维生素b9,(e)维生素b12,(f)铁源例如硝酸铁、柠檬酸铁或硫酸亚铁和(g)氢化可的松。在一个变体方案中，细胞培养基含有成分(a),(b),(c),(d),(e),(f)和(g)中的2种或3种或4种或5种或6种或每一种。可以理解，本文提供的细胞培养基可以含有成分(a),(b),(c),(d),(e),(f)和(g)的任何组合，就如同具体且单独地列出了每一种组合一样。一方面，细胞培养基是cdm。另一方面，细胞培养基是化学不确定的。在一个特定的变体方案中，本文描述的细胞培养基包含：(a)大约300mg/l(在一些实施方案中,200mg/l)至约1200mg/l胱氨酸；(b)约0.05mg/l至约1.0mg/l维生素b2；(c)约0.05mg/l至约10.0mg/l维生素b6；(d)约0.05mg/l至约12.0mg/l维生素b9；和(e)约0.05mg/l至约2.5mg/l维生素b12，其中细胞培养基(a)可以在一个变体方案中是cdm和/或(b)可以进一步包含一种或多种下述成分:(1)铁源，例如柠檬酸铁或硫酸亚铁(其在一方面以约2μm至约80μm的浓度存在)和(2)氢化可的松(其在一方面以约0.05μm至约0.25μm的浓度存在)。在另一变体方案中，本文描述的细胞培养基包含:(a)约300mg/l(在一些实施方案中,200mg/l)至约1200mg/l胱氨酸；(b)约2μm至约80μm柠檬酸铁；和(c)约0.05μm至约0.5μm氢化可的松,其中所述细胞培养基(1)可以在一个变体方案中是cdm和/或(2)可以进一步包含一种或多种下述成分：(a)维生素b2(其在一方面以约0.05mg/l至约1.0mg/l的浓度存在)；(b)维生素b6(其在一方面以约0.05mg/l至约10.0mg/l的浓度存在)；(c)维生素b9(其在一方面以约0.05mg/l至约12.0mg/l的浓度存在)；和(d)维生素b12(其在一方面以约0.05mg/l至约2.5mg/l的浓度存在)。对于本文提供的任何培养基，在一个变体方案中，当该培养基用于生产多肽的方法中时，相比于在不同细胞培养基(例如含有不同培养基成分或以不同量含有相同培养基成分的培养基)中生产多肽时获得的电荷变体(在一方面是酸性电荷变体)，本文提供的培养基减少电荷变体(在一方面是酸性电荷变体)的存在。在本文提供的组合物和方法的一个变体方案中，电荷变体(在一方面是酸性电荷变体)构成多肽产品的不到25％或20％或18％或15％或10％。在本文提供的组合物和方法的另一变体方案中，多肽产品的至少75％或80％或85％或90％或95％或更多是主要种类的蛋白质。在一些变体方案中，主要种类的蛋白质是量上占优势的蛋白质，如通过蛋白质的氨基酸序列、二级结构和/或三级结构所鉴定的。在一些变体方案中，主要种类的蛋白质是量上占优势的蛋白质，其可以通过一种或多种翻译后修饰鉴定。在一些变体方案中，翻译后修饰是糖基化。可以理解，本文描述的多肽产品的百分数可以在纯化多肽产品之前、在纯化多肽产品之后、或在多肽纯化过程中的任何步骤进行确定。
酸性变体可以通过各种方法评价，但优选此类方法包括以下之一、二、三、四或五种：离子交换色谱(iec)，其中在iec之前、之后和/或期间用唾液酸酶处理组合物(例如，以评价唾液酸化变体)；还原性ce-sds(例如，以评价二硫桥还原的变体)；非还原性ce-sds(例如，以评价非还原变体)；硼酸色谱(例如以评价糖基化的变体)；和肽作图(例如以评价脱酰胺的变体)。在一个变体方案中，通过离子交换色谱，例如，使用弱阳离子交换剂和/或具有羧酸官能团的阳离子交换剂(例如，使用dionexpropactmwcx-10色谱柱)，评价总体酸性变体。
在本发明另一方面，本文描述的细胞培养基一般以实现蛋白质产品的品质属性例如颜色的量包含一种或多种下述成分：(a)胱氨酸；(b)维生素b1；(c)维生素b2；(d)维生素b3；(e)维生素b5；(f)维生素b6(吡哆醇和/或吡哆醛，其可以以hcl盐的形式提供)；(g)维生素b7；(h)维生素b9；(i)维生素b12；和(j)铁源例如硝酸铁、柠檬酸铁或硫酸亚铁。在一个变体方案中，细胞培养基含有成分(a),(b),(c),(d),(e),(f),(g),(h),(i)和(j)中的2种或3种或4种或5种或6种或7种或8种或9种或每一种。可以理解，本文提供的细胞培养基可以含有成分(a),(b),(c),(d),(e),(f),(g),(h),(i)和(j)的任何组合，就如同具体且单独地列出了每一种组合一样。一方面，细胞培养基是cdm。另一方面，细胞培养基是化学不确定的。在一个特定的变体方案中，本文描述的细胞培养基包含：(a)约0.8mm(在一些实施方案中,0.7mm)至约2.5mm胱氨酸；(b)约0.11μm至约0.72μm维生素b2；(c)约4.5μm至约30.0μm维生素b6；(c)约3.4μm至约22.0μm维生素b9；和(d)约0.2μm至约1.5μm维生素b12，其中细胞培养基(a)可以在一个变体方案中是cdm和/或(b)可以进一步包含一种或多种下述成分:(1)铁源，例如柠檬酸铁或硫酸亚铁(其在一方面以约11.0μm至约36.0μm的浓度存在),(2)维生素b1(其在一方面以约2.0μm至约14.0μm的浓度存在),(3)维生素b3(其在一方面以约11.0μm至约72.0μm的浓度存在),(4)维生素b5(其在一方面以约6.8μm至约44.0μm的浓度存在)和(5)维生素b7(其在一方面以约0.02μm至约0.24μm的浓度存在)。
相比于在具有不同组成的细胞培养基(例如不含有本文描述的培养基成分和/或成分量的培养基)中产生的蛋白质产品，使用本文描述的细胞培养基可以增加蛋白质产品的稳定性(例如物理稳定性和/或化学稳定性)，例如，通过减少主要种类蛋白质的氧化来实现。相比于在具有不同组成的培养基(例如不含本文描述的培养基成分和/或成分量的培养基)中产生的多肽产品，使用本文描述的细胞培养基还可以减少多肽产品的有色形式。相比于在具有不同组成的培养基(例如，不含本文描述的培养基成分和/或成分量的培养基)中产生的多肽产品，使用本文描述的细胞培养基还可以减少多肽产品与细胞培养容器中其它物质(例如加成物)的结合。本发明考虑增加多肽组合物的稳定性的方法，还考虑减少多肽产品的有色形式的存在和/或量以及减少多肽产品与细胞培养容器中其它物质(例如加成物)的结合的方法。
本发明还提供制备包含多肽(例如抗体)的制剂的方法，包括步骤：通过本文描述的任何方法产生多肽，和将该多肽与一种或多种制剂成分，例如可药用载体或赋形剂组合。
本发明还提供包含通过本文描述的任何方法产生的多肽(例如抗体)的制剂。制剂可以包含多肽和可药用载体或赋形剂。可以适于施用给个体的多肽制剂可以包含分离的和/或纯化的抗体，并具有一种或多种期望的产品品质属性，例如可接受的颜色。在一个方面，含有通过本文提供的任何方法获得的多肽产品的制剂包含浓度至少100mg/ml或至少150mg/ml的多肽。含有至少100mg/ml或至少150mg/ml多肽产品(例如抗体，例如igg1抗体)的制剂也可以具有可接受的颜色。该制剂可以适于注射，例如皮下注射入个体，所述个体在一方面是人。在一方面，适于注射的多肽药物产品具有大于至少100mg/ml、至少125mg/ml或至少150mg/ml的浓度，并按照coc试验的测量，具有大于b3,b4,b5,b6,b7,b8或b9的颜色强度。可以理解，通过coc试验确定的颜色强度值可以是，但不限于，棕色(b)、棕黄色(by)、黄色(y)、绿黄色(gy)、或红色(r)中的任意一种，其中较高的值指示较浅的颜色强度。在一些方面，适于注射的多肽药物产品具有大于至少100mg/ml、至少125mg/ml或至少150mg/ml的浓度，并且按照颜色试验(例如总颜色试验或nifty试验)测量，具有小于参考溶液的颜色强度值的颜色强度值。本文提供的制剂可以包含多肽产品，其中不超过25％或20％或18％或15％或10％的多肽产品是多肽电荷变体(其在一方面是酸性电荷变体)。本文描述的制剂也可以包含多肽产品，其中至少75％或80％或85％或90％或95％或更多的多肽产品是主要种类蛋白质。在一个特定变体方案中，提供包含多肽(例如抗体)产品的制剂，其中制剂包含浓度大于100mg/ml或大于125mg/ml或大于150mg/ml的多肽产品，且其中制剂具有可接受的颜色，其中不超过25％或20％或18％或15％或10％的多肽产品是多肽电荷变体(其在一方面是酸性电荷变体)。
本发明还提供包含细胞培养基和一种或多种其它成分，例如细胞和/或期望的多肽(例如抗体)的组合物。组合物涵盖细胞培养物的任何和所有阶段，例如接种、细胞生长、和细胞生产/维持。在一个变体方案中，提供组合物，其包含(a)含有编码多肽的分离核酸的细胞，和(b)本文提供的细胞培养基。在一个变体方案中，提供组合物，其包含：(a)多肽；和(b)本文提供的细胞培养基，其中在一方面多肽由包含编码多肽的分离核酸的细胞分泌至培养基，或通过裂解包含编码多肽的分离核酸的细胞而释放到培养基中。组合物的细胞可以是本文描述的任何细胞(例如cho细胞)，且组合物的细胞培养基可以是本文描述的任何培养基，就如同具体且单个地列出了细胞和培养基的每一种和所有组合一样。同样地，组合物的多肽可以是本文描述的任何多肽，组合物的培养基可以是本文描述的任何培养基，就如同具体且单个地列出了多肽和培养基的每一种和所有组合一样。
本发明提供通过使细胞与本文描述的培养基接触来生长细胞(即，培养细胞)的方法。在生长细胞(即，培养细胞)的方法的一个特定变体方案中，细胞培养基是cdm。在一个变体方案中，生长细胞(即，培养细胞)的方法包括步骤：使细胞与细胞培养基接触，所述细胞培养基包含：(a)约300mg/l(在一些实施方案中,200mg/l)至约1200mg/l胱氨酸；(b)约0.05mg/l至约1.0mg/l维生素b2；(c)约0.05mg/l至约10.0mg/l维生素b6；(d)约0.05mg/l至约12.0mg/l维生素b9；和(e)约0.05mg/l至约2.5mg/l维生素b12,其中细胞培养基可以进一步包含一种或多种下述成分：(1)铁源，例如柠檬酸铁或硫酸亚铁(其在一个方面以约2μm至约80μm浓度存在)和(2)氢化可的松(其在一个方面以约0.05μm至约0.25μm浓度存在)。在另一变体方案中，提供生长细胞(即，培养细胞)的方法，所述方法包括步骤：使细胞与细胞培养基接触，所述细胞培养基包含：(a)约300mg/l(在一些实施方案中,200mg/l)至约1200mg/l胱氨酸；(b)约2μm至约80μm柠檬酸铁；和(c)约0.05μm至约0.5μm氢化可的松，其中细胞培养基可以进一步包含一种或多种下述成分：(1)维生素b2(其在一方面以约0.05mg/l至约1.0mg/l浓度存在)；(2)维生素b6(其在一方面以约0.05mg/l至约10.0mg/l浓度存在)；(3)维生素b9(其在一方面以约0.05mg/l至约12.0mg/l浓度存在)；和(4)维生素b12(其在一方面以约0.05mg/l至约2.5mg/l浓度存在)。在本文提供的生长细胞(即，培养细胞)的任何方法中，细胞可以与细胞培养基在细胞生长阶段和/或生产阶段中接触。本发明考虑细胞与本文描述的培养基在任何细胞培养阶段接触，例如在细胞生长、生产和维持过程中。本领域技术人员明了，在促进细胞维持和/或生长(包括多肽生产)的条件(例如温度、ph、渗透压等)下，使细胞与本文描述的培养基接触。
在本发明另一变体方案中，生长细胞(即，培养细胞)的方法包括步骤：使细胞与细胞培养基接触，所述细胞培养基包含：(a)约0.8mm(在一些实施方案中,0.7mm)至约2.5mm胱氨酸；(b)约0.11μm至约0.72μm维生素b2；(c)约4.5μm至约30.0μm维生素b6；(c)约3.4μm至约22.0μm维生素b9；和(d)约0.2μm至约1.5μm维生素b12,且其中细胞培养基可以进一步包含一种或多种下述成分：(1)铁源,例如柠檬酸铁或硫酸亚铁(其在一个方面以约11.0μm至约36.0μm浓度存在),(2)维生素b1(其在一个方面以约2.0μm至约14.0μm浓度存在),(3)维生素b3(其在一个方面以约11.0μm至约72.0μm浓度存在),(4)维生素b5(其在一个方面以约6.8μm至约44.0μm浓度存在)和(5)维生素b7(其在一个方面以约0.02μm至约0.24μm浓度存在)。
在本发明再一变体方案中，生长细胞(即培养细胞)的方法包括步骤：使细胞与细胞培养基接触，所述细胞培养基包含：约0.7mm至约2.5mm胱氨酸；约2μm至约80μm柠檬酸铁；约0.05μm至约0.5μm氢化可的松；约0.11μm至约0.72μm维生素b2；约4.5μm至约30.0μm维生素b6；约3.4μm至约22.0μm维生素b9；和约0.2μm至约1.5μm维生素b12,且其中细胞培养基可以进一步包含一种或多种下述成分:(1)维生素b1(其在一个方面以约2.0μm至约14.0μm浓度存在),(2)维生素b3(其在一个方面以约11.0μm至约72.0μm浓度存在),(3)维生素b5(其在一个方面以约6.8μm至约44.0μm浓度存在)和(4)维生素b7(其在一个方面以约0.02μm至约0.24μm浓度存在)。
本发明还提供通过在细胞培养基中生长细胞(即，在细胞培养基中培养细胞)以生产多肽的方法，所述细胞包含编码多肽的分离核酸，其中：(a)细胞表达多肽，(b)细胞培养基包含:(1)约300mg/l(在一些实施方案中,200mg/l)至约1200mg/l胱氨酸；(2)约0.05mg/l至约1.0mg/l维生素b2；(3)约0.05mg/l至约10.0mg/l维生素b6；(4)约0.05mg/l至约12.0mg/l维生素b9；和(5)约0.05mg/l至约2.5mg/l维生素b12,且其中细胞培养基可以进一步包含一种或多种下述成分：(a)铁源，例如柠檬酸铁或硫酸亚铁(其在一个方面以约2μm至约80μm浓度存在)和(b)氢化可的松(其在一个方面以约0.05μm至约0.25μm浓度存在)。在另一变体方案中，提供通过在细胞培养基中生长细胞(即，在细胞培养基中培养细胞)以生产多肽的方法，所述细胞包含编码多肽的分离核酸，其中：(a)细胞表达多肽，(b)细胞培养基包含:(1)约300mg/l(在一些实施方案中,200mg/l)至约1200mg/l胱氨酸；(2)约2μm至约80μm柠檬酸铁；和(3)约0.05μm至约0.5μm氢化可的松,其中细胞培养基可以进一步包含一种或多种下述成分:(a)维生素b2(其在一个方面以约0.05mg/l至约1.0mg/l浓度存在)；(b)维生素b6(其在一个方面以约0.05mg/l至约10.0mg/l浓度存在)；(c)维生素b9(其在一个方面以约0.05mg/l至约12.0mg/l浓度存在)；和(d)维生素b12(其在一个方面以约0.05mg/l至约2.5mg/l浓度存在)。
在本发明另一变体方案中，本发明还提供通过在细胞培养基中生长细胞(即，在细胞培养基中培养细胞)以生产多肽的方法，所述细胞包含编码多肽的分离核酸，其中：(a)细胞表达多肽，(b)细胞培养基包含:(a)约0.8mm(在一些实施方案中,0.7mm)至约2.5mm胱氨酸；(b)约0.11μm至约0.72μm维生素b2；(c)约4.5μm至约30.0μm维生素b6；(c)约3.4μm至约22.0μm维生素b9；和(d)约0.2μm至约1.5μm维生素b12,且其中细胞培养基可以进一步包含一种或多种下述成分：(1)铁源，例如柠檬酸铁或硫酸亚铁(其在一个方面以约11.0μm至约36.0μm浓度存在),(2)维生素b1(其在一个方面以约2.0μm至约14.0μm浓度存在),(3)维生素b3(其在一个方面以约11.0μm至约72.0μm浓度存在),(4)维生素b5(其在一个方面以约6.8μm至约44.0μm浓度存在)和(5)维生素b7(其在一个方面以约0.02μm至约0.24μm浓度存在)。
在本发明再一变体方案中，本发明还提供通过在细胞培养基中生长细胞(即，在细胞培养基中培养细胞)以生产多肽的方法，所述细胞包含编码多肽的分离核酸，其中：(a)细胞表达多肽，(b)细胞培养基包含:约0.7mm至约2.5mm胱氨酸；约2μm至约80μm柠檬酸铁；约0.05μm至约0.5μm氢化可的松；约0.11μm至约0.72μm维生素b2；约4.5μm至约30.0μm维生素b6；约3.4μm至约22.0μm维生素b9；和约0.2μm至约1.5μm维生素b12,且其中细胞培养基可以进一步包含一种或多种下述成分:(1)维生素b1(其在一个方面以约2.0μm至约14.0μm浓度存在),(2)维生素b3(其在一个方面以约11.0μm至约72.0μm浓度存在),(3)维生素b5(其在一个方面以约6.8μm至约44.0μm浓度存在)和(4)维生素b7(其在一个方面以约0.02μm至约0.24μm浓度存在)。
通过本文描述的方法产生的或存在于本文描述的组合物中的多肽可以在一个变体方案中是抗体，例如igg1抗体。在一个方面，通过本文描述的方法产生的或存在于本文描述的组合物中的多肽是抗vegf抗体、抗间皮素(mesothelin)抗体、抗pcsk9抗体或抗β7抗体。根据本文提供的方法产生的或存在于本文描述的组合物中的多肽可以从细胞培养基中分离且可以进一步纯化。还可以浓缩多肽(例如抗体)以达到期望的浓度。浓缩多肽的方法是本领域熟知的，例如，可以通过施用超滤增加多肽或蛋白质的浓度。在一个特定变体方案中，多肽以至少100mg/ml或150mg/ml的浓度分离，和/或呈现为无色或带轻微颜色的液体。在一个特定变体方案中，组合物包含浓度至少100mg/ml的分离多肽，和/或呈现为无色或带轻微颜色的液体。在一个变体方案中，组合物包含浓度至少1mg/ml或10mg/ml或50mg/ml或75mg/ml的分离多肽，和/或呈现为无色或带轻微颜色的液体。在另一变体方案中，组合物包含至少约1mg/ml或10mg/ml或50mg/ml或75mg/ml中的任一个浓度的分离多肽，和/或呈现为无色或带轻微颜色的液体。在另一变体方案中，组合物包含至少约1mg/ml或10mg/ml或50mg/ml或75mg/ml至约125mg/ml或至约150mg/ml中的任一个浓度的分离多肽，和/或呈现为无色或带轻微颜色的液体。本发明还描述包含通过本文描述的方法获得的多肽和可药用载体的组合物。
本发明还描述试剂盒，所述试剂盒用于向细胞培养基补充化学确定的成分，所述试剂盒包含：(a)胱氨酸，其量可以在细胞培养基中提供约300mg/l(在一些实施方案中,200mg/l)至约1200mg/l胱氨酸；(b)维生素b2，其量可以在细胞培养基中提供约0.05mg/l至约1.0mg/l维生素b2；(c)维生素b6，其量可以在细胞培养基中提供约0.05mg/l至约10.0mg/l维生素b6；(d)维生素b9，其量可以在细胞培养基中提供约0.05mg/l至约12.0mg/l维生素b9；和(e)维生素b12，其量可以在细胞培养基中提供约0.05mg/l至约2.5mg/l维生素b12,其中试剂盒还可以包含一种或多种下述成分：(1)铁源，例如柠檬酸铁或硫酸亚铁(在一方面其量可以提供浓度约2μm至约80μm的铁源)和(2)氢化可的松(在一方面其量可以提供浓度约0.05μm至约0.25μm的氢化可的松)。在另一变体方案中，本发明描述试剂盒，所述试剂盒用于向细胞培养基补充化学确定的成分，所述试剂盒包含：(a)胱氨酸，其量可以在细胞培养基中提供约300mg/l(在一些实施方案中,200mg/l)至约1200mg/l胱氨酸；(b)柠檬酸铁，其量可以在细胞培养基中提供约2μm至约80μm柠檬酸铁；和(c)氢化可的松，其量可以在细胞生长(即，细胞培养)培养基中提供约0.05μm至约0.5μm的氢化可的松，其中试剂盒还可以包含一种或多种下述成分：(1)维生素b2(一方面其量可以在细胞培养基中提供约0.05mg/l至约1.0mg/l维生素b2)；(2)维生素b6(一方面其量可以在细胞培养基中提供约0.05mg/l至约10.0mg/l维生素b6)；(3)维生素b9(一方面其量可以在细胞培养基中提供约0.05mg/l至约12.0mg/l维生素b9)；和(4)维生素b12(一方面其量可以在细胞培养基中提供约0.05mg/l至约2.5mg/l维生素b12)。本文还提供用向细胞培养基补充化学确定的成分的试剂盒，其中所述试剂盒包含：(a)胱氨酸，其量可以在细胞培养基中提供约0.8mm(在一些实施方案中,0.7mm)至约2.5mm胱氨酸；(b)维生素b2，其量可以在细胞培养基中提供约0.11μm至约0.72μm维生素b2；(c)维生素b6，其量可以在细胞培养基中提供约4.5μm至约30.0μm维生素b6；(d)维生素b9，其量可以在细胞培养基中提供约3.4μm至约22.0μm维生素b9；(e)维生素b12，其量可以在细胞培养基中提供约0.2μm至约1.5μm维生素b12,且其中所述试剂盒还可以进一步包含一种或多种下述成分:(1)铁源，例如柠檬酸铁或硫酸亚铁(一方面其量可以在细胞培养基中提供约11.0μm至约36.0μm),(2)维生素b1(一方面其量可以在细胞培养基中提供约2.0μm至约14.0μm),(3)维生素b3(一方面其量可以在细胞培养基中提供约11.0μm至约72.0μm),(4)维生素b5(一方面其量可以在细胞培养基中提供约6.8μm至约44.0μm)和(5)维生素b7(一方面其量可以在细胞培养基中提供约0.02μm至约0.24μm)。试剂盒还可以包含使用说明书，例如制备培养基(例如cdm)和/或从细胞培养系统生产多肽(包括抗体)的说明书。
附图简述
图1说明对分离自培养在不同细胞培养条件下的细胞系的抗体样品的coc试验。从左到右，小瓶含有分离自细胞的抗体的制剂，所述细胞培养在如下条件下:i)化学不确定的培养基；ii)基础培养基1和补料培养基2；iii)基础培养基1和补料培养基2；iv)基础培养基5和补料培养基4；v)基础培养基5和补料培养基2；vi)含有半胱氨酸替代胱氨酸的改良的基础培养基3和补料培养基4；vii)基础培养基3和补料培养基4和(viii)含有半胱氨酸替代胱氨酸的改良的基础培养基3和补料培养基4。coc值描述在瓶子上方。所有小瓶含有大约150g/l蛋白质。通过nifty试验测定，制剂iii、iv和vi分别具有1.59、1.47和0.71的颜色强度值。通过总颜色试验测定，制剂iii、iv和vi分别具有2.62、2.04和1.00的颜色强度值。
图2的一系列图显示，相比于基础培养基1和补料培养基2，在以基础培养基3和补料培养基4孵育的细胞培养物中细胞数量和抗体生产有轻微减少。a和c)通过收集细胞体积(pcv)测定的在孵育持续过程中培养物中的细胞数量，表达为总培养物体积的百分数。b和d)通过高效液相色谱测定的在孵育持续过程中培养物中的抗体生产，表达为抗体滴度。
图3的一系列图说明生长在化学确定的培养基(cdm)中的细胞培养物对生产性细胞生物量和抗体产量的影响，其中所述培养基包含不同水平的维生素b2、维生素b6和维生素b9以及维生素b12。a)通过收集细胞体积(pcv)测量的培养物中的生产性生物量，表达为总培养物体积的百分数。b)通过高效液相色谱测量的细胞的抗体产量，表达为抗体滴度。对于维生素b2,-1指示0.25mg/l基础和0mg/l补料，1指示1.41mg/l基础和10mg/l补料；对于维生素b6,-1指示5.35mg/l基础(吡哆醇)和0mg/l补料，1指示15.42mg/l基础和7mg/l补料的吡哆醇组合0mg/l基础和60mg/l补料的吡哆醛；对于维生素b9,-1指示8.61mg/l基础和0mg/l补料，1指示9.93mg/l基础和197mg/l补料；对于维生素b12,-1指示1.76mg/l基础和0mg/l补料，1指示3.05mg/l基础和48mg/l补料。中线指示自来源于数据的线性模型计算的预测值。上线和下线指示该预测的95％置信区间。
图4的一系列图显示从细胞培养物中分离的抗体的颜色强度，所述细胞培养物生长在含有不同水平的维生素b2、维生素b6、和维生素b9以及维生素b12的cdm中。使用颜色试验确定颜色强度，其中较高的数值指示较高的颜色强度，较低的数值指示较低的颜色强度。对于维生素b2,-1指示0.25mg/l基础和0mg/l补料，1指示1.41mg/l基础和10mg/l补料；对于维生素b6,-1指示5.35mg/l基础(吡哆醇)和0mg/l补料，1指示15.42mg/l基础和7mg/l补料的吡哆醇组合0mg/l基础和60mg/l补料的吡哆醛；对于维生素b9,-1指示8.61mg/l基础和0mg/l补料，1指示9.93mg/l基础和197mg/l补料；对于维生素b12,-1指示1.76mg/l基础和0mg/l补料，1指示3.05mg/l基础和48mg/l补料。
图5a-c)的一系列图显示来自生长在含有递增浓度的硫酸亚铁的cdm中的细胞培养物的生产性细胞生物量、抗体产量、和分离的抗体的颜色强度。a)随着时间，通过收集细胞体积测量的培养物中的生产性生物量(ivpcv)。b)通过高效液相色谱测量的细胞的抗体产量。c)通过颜色试验测量的分离自细胞的抗体的颜色强度，其中较高的数值指示较高的颜色强度，较低的数值指示较低的颜色强度。棒指示数据的上限和下限以及平均值。d)图显示体外实验中在含有递增浓度的硫酸亚铁的培养基中孵育的抗体的颜色强度。
图6的一系列图显示来自细胞培养物的生产性细胞生物量、抗体产量、和分离的抗体的颜色强度，其中所述细胞培养物生长在含有递增浓度的铁和不同铁源的cdm中。a)随着时间，通过收集细胞体积测量的培养物中的生产性生物量(ivpcv)。b)通过高效液相色谱测量的细胞的抗体产量。c)通过颜色试验测量的从细胞分离的抗体的颜色强度，其中较高的数值指示较高的颜色强度，较低的数值指示较低的颜色强度。棒指示数据的上限和下限以及平均值。d-e)显示来自细胞培养物的抗体产量和分离的抗体的颜色强度，其中细胞培养物生长在含有不同浓度的不同铁源和降低水平的维生素b的cdm中。加号表示低维生素条件，空心圆表示高维生素条件。d)通过高效液相色谱测量的细胞的抗体产量。e)通过nifty试验测量的从细胞分离的抗体的颜色强度，其中较高的数值表示较高的颜色强度，较低的数值表示较低的颜色强度。
图7的一系列图显示在体外实验中在过氧化氢酶不存在或存在下孵育在cdm中的抗体的颜色强度，所述cdm含有不同浓度的硫酸亚铁和维生素b2。a)在过氧化氢酶不存在下抗体的颜色强度。b)在过氧化氢酶存在下抗体的颜色强度。颜色强度通过颜色试验测量，其中较高的数值指示较高的颜色强度，较低的数值指示较低的颜色强度。对于硫酸亚铁,-1指示18μm基础和0μm补料，1指示75μm基础和0μm补料；对于维生素b2,-1指示0.25mg/l基础和0mg/l补料，1指示1.41mg/l和10mg/l补料。中线指示从来源于数据的线性模型计算的预测值。上线和下线指示该预测的95％置信区间。
图8中a)图显示，与改良的基础培养基1和补料培养基2(空心圆)相比，在获自如下细胞培养物的抗体溶液中降低的颜色强度与降低的酸性电荷变体的存在之间的相关性，所述细胞培养物生长在改良的基础培养基3和补料培养基4(加号)中。改良的培养基1含有10μm、18μm或75μm硫酸亚铁。改良的培养基3含有10μm或18μm柠檬酸铁。b)图显示，相对于75μm硫酸亚铁(加号)，在获自如下细胞培养物的抗体溶液中降低的颜色强度与降低的酸性电荷变体的存在之间的相关性，所述细胞培养物生长在含有18μm硫酸亚铁的培养基中(空心圆)。c)图显示，在获自如下细胞培养物的抗体溶液中降低的颜色强度与降低的酸性电荷变体的存在之间没有相关性，所述细胞培养物生长在含有不同水平的维生素b2、b6、b9和b12的培养基中。维生素b水平同时变化为低浓度(空心圆)、中等浓度(加号)或高浓度(空心菱形)。通过颜色试验测量颜色强度，其中较高的数值指示较高的颜色强度，较低的数值指示较低的颜色强度。抗体溶液中酸性电荷变体的百分数通过离子交换色谱确定。
图9的一系列图显示在获自如下细胞培养物的抗体溶液中降低的颜色强度与降低的酸性电荷变体的存在之间的相关性，所述细胞培养物生长在含有降低浓度的维生素b2和维生素b6的培养基中。a)通过颜色试验测量的从细胞分离的抗体的颜色强度，其中较高的数值指示较高的颜色强度而较低的数值指示较低的颜色强度。b)通过离子交换色谱测定的抗体溶液中酸性电荷变体的百分数。对于维生素b2，-1指示0.25mg/l基础和0mg/l补料，1指示1.41mg/l基础和10mg/l补料；对于维生素b6,-1指示5.35mg/l基础(吡哆醇)和0mg/l补料，1指示15.42mg/l基础和7mg/l补料的吡哆醇组合0mg/l基础和60mg/l补料的吡哆醛。
图10的一系列图显示在获自如下细胞培养物的抗体溶液中降低的颜色强度和降低的酸性电荷变体的存在，所述细胞培养物生长在含有柠檬酸铁(与含有硫酸亚铁相比)并具有不同浓度的吡哆醛的基础培养基中。a)通过颜色试验测量的从细胞分离的抗体的颜色强度，其中较高的数值指示较高的颜色强度而较低的数值指示较低的颜色强度。b)通过离子交换色谱测量的抗体溶液中的酸性电荷变体的百分数。对于吡哆醛，-1指示0mg/l基础和0mg/l补料，1指示0mg/l基础和60mg/l补料。柠檬酸铁或硫酸亚铁以18μm存在于基础培养基中。
图11的一系列图显示从如下细胞培养物获得的抗体溶液中降低的颜色强度和酸性电荷变体的水平，所述细胞培养物生长在含有柠檬酸铁(与含有硫酸亚铁相比)的基础培养基中且补料培养基中具有不同浓度的维生素b2,b6,b9和b12。a)通过颜色试验测量的从细胞分离的抗体的颜色强度，其中较高的数值指示较高的颜色强度而较低的数值指示较低的颜色强度。b)通过离子交换色谱测量的抗体溶液中的酸性电荷变体的百分数。水平1指示不含维生素b2,b6,b9和b12的补料培养基。水平2指示含有10mg/l维生素b2、7mg/l吡哆醇、60mg/l吡哆醛、197mg/l维生素b9和48mg/l维生素b12的补料培养基。水平3指示含有5mg/l维生素b2、3.5mg/l吡哆醇、30mg/l吡哆醛、98.5mg/l维生素b9和24mg/l维生素b12的补料培养基。柠檬酸铁或硫酸亚铁以18μm存在于基础培养基中。
图12的一系列图显示在获自如下细胞培养物的抗体溶液中降低的颜色强度和降低水平的酸性电荷变体，所述细胞培养物生长在含有降低浓度的铁的基础培养基中，其中优选柠檬酸铁代替硫酸亚铁作为铁源。a)通过颜色试验测量的从细胞分离的抗体的颜色强度，其中较高的数值指示较高的颜色强度而较低的数值指示较低的颜色强度。b)通过离子交换色谱测量的抗体溶液中酸性电荷变体的百分数。
图13的一系列图显示在获自如下细胞培养物的抗体溶液中降低的颜色强度和降低水平的酸性电荷变体，所述细胞培养物生长在含有降低浓度的柠檬酸铁的基础培养基中。a)通过颜色试验测定的从细胞分离的抗体的颜色强度，其中较高的数值指示较高的颜色强度而较低的数值指示较低的颜色强度。b)通过离子交换色谱测量的抗体溶液中酸性电荷变体的百分数。*表示经改良含有所示浓度的柠檬酸铁的基础培养基1。
图14的一系列图显示在获自下述细胞培养物的抗体溶液中降低的颜色强度和降低水平的酸性电荷变体，所述细胞培养物生长在含有降低浓度的维生素b2,b6,b9和b12的基础培养基中，其中加入胱氨酸而非半胱氨酸、且存在氢化可的松。a)通过颜色试验测量的从细胞分离的抗体的颜色强度，其中较大的数值指示较高的颜色强度而较小的数值指示较低的颜色强度。b)通过离子交换色谱测量的抗体溶液中酸性电荷变体的百分数。*表示含有1.41mg/l维生素b2,15.42mg/l吡哆醇,0mg/l吡哆醛,9.93mg/l维生素b9和3.05mg/l维生素b12的基础培养基。
图15的一系列图显示，与用于颜色强度的coc试验测量结果相比，总颜色试验和nifty试验测量结果之间的相关性。a)对总颜色和nifty值作图，其中符号表示coc值。b)对在蛋白a池中和在相应的药物物质制剂中通过nifty试验得到的颜色测量值作图，其中符号表示coc值。c)对在蛋白a池中和在相应的药物物质制剂中通过总颜色试验得到的颜色测量值作图，其中符号表示coc值。空心圆表示≤b3的coc值；空心菱形表示≤b4或by4的coc值；加号表示≤b5或by5的coc值；dsnifty和ds总颜色表示在最终药物物质制剂中相应的试验测定值；proanifty和proa总颜色表示在蛋白a池中相应的试验测定值。
发明详述
本发明描述细胞培养基和将该培养基用于细胞生长(即，细胞培养)和多肽生产的方法。本发明还提供通过所描述的方法产生的多肽，包括抗体。本发明还提供用于制备培养基的试剂盒和含有培养基的组合物、以及含有细胞和/或通过所述方法产生的多肽的组合物。本发明描述药物组合物，其包含浓度大于至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml的多肽，并具有通过颜色、乳光和着色(coc)试验测量的、大于b3,b4,b5,b6,b7,b8或b9的颜色强度值。本发明还描述药物组合物，其含有大于至少1mg/ml、至少10mg/ml、至少25mg/ml、至少50mg/ml、或至少75mg/ml浓度的多肽，且具有通过coc试验测量的大于b3,b4,b5,b6,b7,b8或b9的颜色强度值。可以理解，coc试验的参考标准可以是，但不限于，b、by、y、gy或r中的任一个，其中较大的值指示较浅的颜色强度。本发明还提供药物组合物，其包含大于至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml浓度的多肽，且具有通过颜色试验(例如，总颜色试验或nifty试验)测量的、小于参考溶液的颜色强度值的颜色强度值。本发明还提供药物组合物，其包含大于至少1mg/ml、至少10mg/ml、至少25mg/ml、至少50mg/ml、或至少75mg/ml浓度的多肽，且具有通过颜色试验(例如，总颜色试验或nifty试验)测量的、小于参考溶液的颜色强度值的颜色强度值。本发明还提供在含多肽的溶液(例如含抗体的溶液)中评价颜色的方法。在特定变体方案中，所述培养基、方法、试剂盒和组合物包含cdm。
用于多肽生产的某些细胞培养基(例如cdm)已经被发现可以提供具有可接受品质属性的多肽药物产品。例如，某些cdm已经被发现可以调节多肽药物产品的颜色强度，其中在该cdm中产生的多肽提供可接受的颜色(例如，用作注射药物产品)，而同时保持与使用cdm相关的益处。这些cdm，当用于多肽生产方法中时，已经被发现，相比于在不同培养基(例如，不含本文所述培养基成分和/或成分量的培养基)中产生的多肽，可以降低多肽药物产品的颜色强度。该细胞培养基可以是化学确定的或化学的不确定的。
不希望受理论的束缚，据信以一定浓度使用特定培养基成分(例如胱氨酸和/或半胱氨酸、某些维生素b、氢化可的松和/或铁源)可以产生具有可接受品质属性，尤其是可接受颜色的多肽药物产品。尽管认为在用于细胞生长的基础培养基中使用这些培养基成分尤其影响多肽药物产品的品质属性，但是本文提供的培养基可以考虑用于细胞生长、维持和多肽生产过程的任何阶段，包括在基础培养基和补料培养基中。本文提供的培养基可以用于生长细胞(即，培养细胞)的方法中和生产多肽的方法中，并且可以用于含有编码期望多肽的分离核酸的细胞的生长、维持和/或生产阶段中。本文描述的培养基可以用于实现多肽药物产品的一种或多种性质(例如，颜色、组成、纯度等)的改善、或多肽生产方法的一个或多个方面(例如，批与批之间的重复性、生产的易行性、生产成本等)的改善。本文描述通过使用本文提供的细胞基的细胞培养方法生产的多肽(例如抗体)。在一个方面，多肽具有大于至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml的浓度，具有通过coc试验测定的、大于b3,b4,b5,b6,b7,b8或b9的颜色强度值。在另一方面，多肽具有大于至少1mg/ml、至少10mg/ml、至少25mg/ml、至少50mg/ml或至少75mg/ml的浓度，并具有通过coc试验测定的、大于b3,b4,b5,b6,b7,b8或b9的颜色强度值。在一些方面，通过coc试验测定的颜色强度值可以是，但不限于，b,by,y,gy或r中的任一个，其中较大值指示较浅的颜色强度。本发明还描述施用本文描述的多肽产品的方法、以及包含本文生产的多肽产品的制品。
定义
对于本文中的使用，除非另行明确指出，否则术语"a"、"an"等用于指一个或多个。
本文中提及“大约”一个数值或参数包括(和描述)涉及该数值或参数本身的实施方案。例如，述及“大约x”包括述及“x”。数值范围涵盖定义该范围的数字。
“电荷变体”是主要种类蛋白质(例如抗体)的变体，其与主要种类蛋白质具有不同的电荷。
“酸性电荷变体”是主要种类蛋白质(例如抗体)的变体，其比主要种类蛋白质(例如抗体)具有更大的酸性。相对于主要种类蛋白质(例如抗体)，酸性变体获得了负电荷或丧失了正电荷。使用根据电荷分离蛋白质的分离方法，例如离子交换色谱，可以分离(resolved)酸性电荷变体。
本文中术语“主要种类蛋白质”指组合物中蛋白质(例如抗体)氨基酸序列结构，其是组合物中在量上占优势的蛋白质(例如抗体)分子。
“培养”细胞指在适于细胞生存和/或生长的条件下使细胞接触细胞培养基。
“分批培养”指这样的培养，其中用于细胞培养的所有成分(包括细胞和所有培养营养物)均在该培养过程的开头加入培养容器。
在本文中，短语“补料分批细胞培养”指这样的分批培养，其中在开始时向培养容器提供细胞和培养基，在培养过程中向培养物中连续地或以不连续增加的方式补料其它的培养营养物，在培养终止前可以有或无周期性的细胞和/或产物收获。
“灌流培养”是这样的培养，其中通过例如过滤、囊化、锚着在微载体上等方式，将细胞限制在培养基中，并连续地或间歇地向培养容器中引入和移出培养基。
“培养容器”指用于培养细胞的容器。培养容器可以是任何尺寸，只要其可以用于培养细胞即可。
“滴度”：术语“滴度”在本文中用于指，细胞培养物产生的重组表达多肽的总量除以给定量的培养基体积。滴度典型地以mg多肽/ml培养基的单位表达。
术语“培养基”和“细胞培养基”指用于生长或维持细胞的营养源。本领域技术人员明了，该营养源可以含有细胞生长和/或生存所必需的成分，或可以含有帮助细胞生长和/或生存的成分。维生素、必需或非必需氨基酸、和痕量元素是培养基成分的例子。
“化学确定的细胞培养基”或“cdm”是具有规定成分的培养基，其不含动物来源的产品，例如动物血清和蛋白胨。该术语还涵盖具有规定组成、不含不明确的或部分明确的成分(例如诸如动物血清、动物蛋白胨、和植物蛋白胨之类的成分)的培养基。本领域技术人员明了，cdm可以用于多肽生产过程中，其中细胞与cdm接触并将多肽分泌至cdm中。因此，可以理解，组合物可以含有cdm和多肽产品，多肽产品的存在并不造成cdm是化学不确定的。
“化学不确定的细胞培养基”指这样的培养基，该培养基的化学组成不能被明确说明，其可含有一种或多种动物来源的产品例如动物血清和蛋白胨。正如本领域技术人员可以理解的，化学不确定的细胞培养基可含有动物来源的产品作为营养源。该术语也可以涵盖包含不明确的或部分不明确的成分(例如诸如动物血清、动物蛋白胨和植物蛋白胨之类的成分)的细胞培养基。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指任何长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线性或分支的，其可以包含修饰的氨基酸，并且其可以被非氨基酸中断。该术语也涵盖已经经过天然修饰或人为干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化、或任何其它操作或修饰，例如与标记性成分缀合。该定义也包括例如，含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)、以及本领域已知的其它修饰的多肽。涵盖在本文该定义中的多肽的例子包括：哺乳动物蛋白质，例如肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1抗胰蛋白酶；胰岛素a链；胰岛素b链；胰岛素原；促滤泡激素；降钙素；促黄体生成激素；胰高血糖素；凝血因子，例如因子viiic、因子ix、组织因子、和冯·维勒布兰德因子；抗凝血因子，例如蛋白c；心房钠尿肽；肺表面活性物质；纤溶酶原激活物，例如脲激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-pa)；铃蟾肤；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子α和β；脑啡肽酶；rantes(正常t细胞表达分泌的活化调节因子)；人巨噬细胞炎性蛋白(mip-1α)；血清白蛋白、例如人血清白蛋白；缪勒管抑制物质；松弛素a链；松弛素b链；松弛素原(prorelaxin)；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白，例如β内酰胺酶；dna酶；ige；细胞毒性t淋巴细胞相关抗原(ctla)，例如ctla-4；抑制素；活化素；血管内皮生长因子(vegf)；激素受体或生长因子受体；蛋白a或d；类风湿因子；神经营养因子例如骨源神经营养因子(bdnf)、神经营养因子3、4、5、或6(nt-3、nt-4、nt-5或nt-6)、或神经生长因子例如ngf-b；血小板来源的生长因子(pdgf)；成纤维细胞生长因子例如afgf和bfgf；表皮生长因子(egf)；转化生长因子(tgf)，例如tgf-α和tgf-β,包括tgf-β1,tgf-β2,tgf-β3,tgf-β4或tgf-β5；胰岛素样生长因子-i和-ii(igf-i和igf-ii)；des(1-3)-igf-i(脑igf-i),胰岛素样生长因子结合蛋白(igfbps)；cd蛋白例如cd3,cd4,cd8,cd19和cd20；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(bmp)；干扰素例如干扰素α、β和γ；集落刺激因子(csf)，例如m-csf,gm-csf和g-csf；白介素(ils),例如il-1至il-10；超氧化物歧化酶；t细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原例如aids包膜的部分；转运蛋白；归巢蛋白；地址素；调节性蛋白；整联蛋白，例如cd11a,cd11b,cd11c,cd18,icam,vla-4和vcam；肿瘤相关抗原，例如ca125(卵巢癌抗原)或her2,her3或her4受体；免疫粘附素；以及上述任何蛋白质的片段和/或变体、以及与蛋白质(包括例如上述任何蛋白质)结合的抗体，包括抗体片段。
“分离的多肽”指多肽已经从表达它的细胞或细胞培养物中回收。
“核酸”，在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，包括dna和rna。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基、和/或它们的类似物、或可以通过dna或rna聚合物或通过合成反应而掺入聚合物中的任何底物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸及其类似物。如果存在修饰的话，对核苷酸结构的修饰可以发生在聚合物组装之前或之后。
“分离的核酸”指并涵盖非天然发生的、重组的或天然发生的序列，该序列不处于其通常的环境中或者从其通常的环境中得到分离。
“纯化的”多肽指，该多肽的纯度已经增加，由此与其在天然环境中时相比，和/或与其在实验室条件下最初产生和/或合成和/或扩增时相比，其以更纯的形式存在。纯度是一个相对术语，不一定指绝对纯度。
术语“抗体”以最宽的含义使用，尤其包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段。
“抗体片段”包括全长抗体的部分，一般是其抗原结合区域或可变区。抗体片段的实例包括fab,fab’,f(ab’)2和fv片段；单链抗体分子；双体抗体(diabodies)；线性抗体；和从抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“单克隆抗体”在本文中用于指，从基本均质的抗体群体中获得的抗体，即，包含在该群体中的各单个抗体，除了可能的天然突变(可以以微小数量存在)外，是相同的。单克隆抗体高度特异，指向单个抗原性位点。此外，与典型地包括指向不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制品不同，每个单克隆抗体均指向抗原上的单一一个决定簇。修饰语“单克隆”指抗体从基本上均质的抗体群体获得的特性，而不应理解为要求该抗体以任何特定的方法制备。例如，根据本发明公开使用的单克隆抗体可以通过杂交瘤方法(最先由kohleretal,nature256:495(1975)描述)制备；或可以通过重组dna方法(见例如美国专利号4,816,567)制备。“单克隆抗体”也可以使用例如clackson等,nature352:624-628(1991)和marks等,j.mol.biol.222:581-597(1991)描述的技术，从噬菌体抗体文库分离。
“人源化”抗体是非人(例如啮齿动物)抗体的嵌合抗体形式，其含有来源于该非人抗体的最少序列。对于大部分而言，人源化抗体是人免疫球蛋白质(受体抗体)，其中来自受体高变区的残基替换为来自非人物种(供体抗体)例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的高变区的残基，其中所述非人物种具有期望的抗体特异性、亲和力和能力。在一些情况下，人免疫球蛋白的构架区(fr)残基替换为相应的非人残基。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中不存在的残基。可以进行这些修饰以进一步完善抗体性能。一般，人源化抗体包含至少一个，典型地两个，可变区的基本上全部，其中高变环的所有或基本上所有均相应于非人免疫球蛋白的，而fr的所有或基本上所有是人免疫球蛋白序列的fr。人源化抗体任选地还可以包含免疫球蛋白恒定区(fc)的至少一部分，典型地，人免疫球蛋白的一部分。对于进一步的细节，可以参见jones等,nature321:522-525(1986)；riechmann等,nature332:323-329(1988)；和presta,curr.op.struct.biol.2:593-596(1992)。
“物种依赖性抗体”是这样的抗体，其对来自第一哺乳动物物种的抗原，比对来自第二哺乳动物物种的该抗原的同源物，具有更强的结合亲和力。通常，物种依赖性抗体与人抗原“特异性结合”(即，具有不超过大约1x10-7m、不超过大约1x10-8m、或不超过大约1x10-9m的结合亲和力(kd)值)，但是与其对该人抗原的结合亲和力相比，该抗体对来自第二非人哺乳动物物种的该抗原的同源物的结合亲和力弱至少大约50倍、或至少大约500倍、或至少大约1000倍。物种依赖性抗体可以是以上定义的任何类型的抗体，但优选是人源化或人抗体。
“杂质”指不同于期望多肽产品的物质。杂质包括，但不限于：宿主细胞物质，例如chop；沥滤的蛋白a；核酸；期望多肽的变体、片段、聚集物或衍生物；其它多肽；内毒素；病毒污染物；细胞培养基成分等。
术语“药物制剂”指这样的制品，其形式允许活性成分的生物活性有效，且其不含有对制剂施用对象具有不可接受毒性的其它成分。此类制剂是无菌的。
“无菌”制剂是消毒的，或不含或基本上不含所有活微生物和其孢子。
“无色或带轻微颜色的”液体指，通过定性和/或定量分析测量的包含多肽的液体组合物。定性分析包括目视检查，例如将包含多肽的组合物与参考标准进行比较。
可以理解，无论何时本文使用表述“包含”描述实施方案，都提供以术语“由......组成”和/或“基本上由......组成”描述的类似实施方案。
当本发明的实施方案的方面以马库什组或其它可选择要素组描述时，本发明不仅涵盖作为一个整体列出的整个组、以及单独地该组的每个成员和该主要组中所有可能的亚组，还涵盖缺失一个或多个组成分的该主要组。本发明还考虑在要求保护的本发明中明确排除组成员中的任何一个或多个。
细胞培养基
本文提供的细胞培养基可以用于本文描述的方法(例如，生长细胞(即，培养细胞)和生产多肽的方法)和组合物中。培养基成分已经被确定为能够提供具有可接受品质属性，例如可接受颜色(例如，用作注射药物产品)的多肽药物产品。与在不同培养基中生产的多肽相比，某些培养基成分降低多肽药物产品的颜色强度，对于以大于100mg/ml或125mg/ml或150mg/ml之任一的浓度配制的多肽产品，这可能尤其有意义。在一些方面，多肽药物产品具有大于至少100mg/ml、至少125mg/ml或至少150mg/ml的浓度，并具有通过coc试验测量的、大于b3,b4,b5,b6,b7,b8或b9的颜色强度值。在一些方面，多肽药物产品具有大于至少1mg/ml、至少10mg/ml、至少25mg/ml、至少50mg/ml或至少75mg/ml的浓度，且具有通过coc试验测量的、大于b3,b4,b5,b6,b7,b8或b9的颜色强度值。在一些方面，通过coc试验确定的颜色强度值可以是，但不限于，b,by,y,gy或r中的任一个，其中较高的值指示较浅的颜色强度。在一些方面，多肽药物产品具有大于至少100mg/ml,至少125mg/ml或至少150mg/ml的浓度，并具有通过颜色试验(例如，总颜色试验或nifty试验)测量的、小于参考溶液的颜色强度值的颜色强度值。在一些方面，多肽药物产品具有大于至少1mg/ml、至少10mg/ml、至少25mg/ml、至少50mg/ml、或至少75mg/ml的浓度，并具有通过颜色试验(例如，总颜色试验或nifty试验)测量的、小于参考溶液的颜色强度值的颜色强度值。合适的细胞培养基详述在整个说明书中，包括发明概述部分和其它地方。本文描述的任何培养基都可以用于细胞生长、维持和多肽生产的任何阶段，并可以用于基础培养基和/或补料培养基中。本文描述的培养基在一个变体方案中导致可接受的细胞生存力和抗体滴度水平，并导致从生长在该培养基中的细胞培养物分离的多肽(例如抗体)具有可接受的颜色强度。
本发明提供含有一种或多种下述成分的细胞培养基：(a)胱氨酸和/或半胱氨酸；(b)维生素b2,(c)维生素b6(吡哆醇和/或吡哆醛),(d)维生素b9,(e)维生素b12,(f)铁源例如柠檬酸铁，和(g)氢化可的松。在一个变体方案中，细胞培养基包含成分(a),(b),(c),(d),(e),(f)和(g)中的2种或3种或4种或5种或6种或每一种。可以理解，本文提供的细胞培养基可以含有成分(a),(b),(c),(d),(e),(f)和(g)的任何组合，就如同具体地单独列出了每一种和所有组合一样。例如，可以理解，包含成分(a),(b),(c),(d),(e),(f)和(g)中的4种的细胞培养基可以包含这些成分的任何组合，只要存在这些成分中的至少4种即可。一方面，细胞培养基是cdm。另一方面，细胞培养基是化学不确定的细胞培养基。
培养基成分可以以本领域已知的形式加入组合物中。例如，维生素b2可以以核黄素粉末的形式提供，维生素b6可以以吡哆醇hcl的形式或以吡哆醛hcl的形式提供，维生素b9可以以叶酸粉末的形式提供，维生素b12可以以氰钴胺粉末的形式提供，半胱氨酸可以以l-半胱氨酸一盐酸盐一水合物粉末的形式提供，胱氨酸可以以二钠盐一水合物粉末的形式提供。在一些实施方案中，维生素b6不以吡哆醛hcl的形式提供。在另外的非限制例子中，维生素b1可以以硫胺一盐酸盐的形式提供，维生素b3可以以烟酰胺的形式提供，维生素b5可以以d-泛酸钙的形式提供，维生素b7可以以生物素的形式提供。作为另一非限制性例子，铁可以以不同铁形式或铁源添加。在一些实施方案中，铁源是柠檬酸铁或硫酸亚铁。本文描述的培养基成分可以以盐、水合物、盐水合物的形式，或以溶液、提取物的形式、或以固体形式提供。
在一个变体方案中，培养基包含胱氨酸以及维生素b2,b6,b9和b12之每一种。在一个变体方案中，培养基包含胱氨酸、维生素b2,b6,b9,b12、以及铁源例如柠檬酸铁。在另一变体方案中，胱氨酸、维生素b2,b6,b9,b12、铁源例如柠檬酸铁、以及氢化可的松均包含在培养基中。在再一变体方案中，培养基包含胱氨酸、氢化可的松和铁源例如柠檬酸铁。在再一变体方案中，培养基包含胱氨酸、氢化可的松、铁源例如柠檬酸铁、和维生素b2,b6,b9及b12中的至少1种。在再一变体方案中，培养基包含胱氨酸、氢化可的松、铁源例如柠檬酸铁、和维生素b2,b6,b9及b12中的至少2种。在再一变体方案中，培养基包含胱氨酸、氢化可的松、铁源例如柠檬酸铁、和维生素b2,b6,b9及b12中的至少3种。在本文描述的任何培养基种，一方面，培养基是cdm。一方面，细胞培养基包含半胱氨酸。另一变体方案中，细胞培养基包含胱氨酸但不含半胱氨酸。另一变体方案中，细胞培养基包含胱氨酸和半胱氨酸两者。
在一个变体方案中，培养基是包含如下成分的细胞培养基：约300mg/l(在一些实施方案中,200mg/l)至约1200mg/l胱氨酸,约0.05mg/l至约1.0mg/l维生素b2,约0.05mg/l至约10.0mg/l维生素b6,约0.05mg/l至约12.0mg/l维生素b9，和约0.05mg/l至约2.5mg/l维生素b12。在一个变体方案中，维生素b2的浓度为约0.05mg/l至约0.50mg/l。在另一变体方案中,维生素b2的浓度为约0.05mg/l至约0.40mg/l。在另一变体方案中,维生素b2的浓度为约0.05mg/l至约0.30mg/l。在一个变体方案中,维生素b6的浓度为约0.05mg/l至约8.0mg/l。在另一变体方案中,维生素b6的浓度为约0.05mg/l至约7.0mg/l。在另一变体方案中,维生素b6的浓度为约0.05mg/l至约6.0mg/l。在一个变体方案中,细胞培养基包含铁源。在一个变体方案中，铁源是柠檬酸铁或硫酸亚铁。在一个变体方案中，细胞培养基包含约2μm至约80μm浓度的柠檬酸铁。在本文的任何变体方案中，细胞培养基还可以包含氢化可的松。在一个变体方案中，氢化可的松的浓度为约0.05μm至约0.25μm。
在另一变体方案中,细胞培养基包含下述一种或多种:(a)约300mg/l(在一些实施方案中,200mg/l)至约1200mg/l胱氨酸和/或半胱氨酸(其在一方面是胱氨酸)；(b)约0.05mg/l至约1.0mg/l维生素b2；(c)约0.05mg/l至约10.0mg/l维生素b6(其在一方面是吡哆醇)；(d)约0.05mg/l至约12.0mg/l维生素b9；(e)约0.05mg/l至约2.5mg/l维生素b12；(f)约2μm至约80μm铁源,例如硝酸铁、柠檬酸铁或硫酸铁(其在一方面是柠檬酸铁和/或硫酸亚铁)；和(g)约0.05μm至约0.25μm氢化可的松。在另一变体方案中,细胞培养基包含下述一种或多种:(a)约300mg/l(在一些实施方案中,200mg/l)至约600mg/l胱氨酸和/或半胱氨酸(其在一方面是胱氨酸)；(b)约0.05mg/l至约0.5mg/l维生素b2；(c)约2.0mg/l至约8.0mg/l维生素b6(其在一方面是吡哆醇)；(d)约4.0mg/l至约12.0mg/l维生素b9；(e)约1.0至约2.0mg/l维生素b12；(f)约5μm至约25μm铁源,例如硝酸铁、柠檬酸铁或硫酸铁(其在一方面是柠檬酸铁和/或硫酸铁)；和(g)约0.1μm至约0.2μm氢化可的松。在再一变体方案中，细胞培养基包含下述一种或多种:(a)约400mg/l至约500mg/l胱氨酸和/或半胱氨酸(其在一方面是胱氨酸)；(b)约0.1mg/l至约0.3mg/l维生素b2；(c)约4.0mg/l至约6.0mg/l维生素b6(其在一方面是吡哆醇)；(d)约7.0mg/l至约10.0mg/l维生素b9；(e)约1.5至约2.0mg/l维生素b12；(f)约12μm至约20μm铁源,例如硝酸铁、柠檬酸铁或硫酸铁(其在一方面是柠檬酸铁和/或硫酸铁)；和(g)约0.125μm至约0.175μm氢化可的松。在一个变体方案中，细胞培养基以上面述及的浓度包含成分(a),(b),(c),(d),(e),(f)和(g)中的2或3或4或5或6种或每一种。可以理解，细胞培养基可以含有在本文提供的浓度范围中的成分(a),(b),(c),(d),(e),(f)和(g)的任何组合，就如同具体地单独地列出了每一种和所有组合。例如，可以理解，培养基在一个变体方案中可以包含成分(a),(b),(c),(d)和(e)，并可以任选地包含成分(f)和/或(g)。也可以理解，在另一变体方案中，培养基可以包含成分(a),(f)和(g)，并可以任选地包含成分(b),(c),(d)和(e)中的任何一种或多种。在培养基包含胱氨酸或半胱氨酸的任何变体方案中，在一方面，培养基可以包含胱氨酸(在一个进一步变体方案中不含半胱氨酸)。在培养基包含维生素b6的任何变体方案中，在一方面，培养基可以包含吡哆醇(pyridoxane)。在培养基包含铁源的任何变体方案中，在一方面，铁源可以是柠檬酸铁。因此，可以理解，在某些变体方案中，培养基可以包含胱氨酸、吡哆醇和柠檬酸铁。在一方面，细胞培养基是cdm。
在一个变体方案中,培养基包含(a)约300mg/l(在一些实施方案中,200mg/l)至约1200mg/l胱氨酸；(b)约0.05mg/l至约1.0mg/l维生素b2；(c)约0.05mg/l至约10.0mg/l维生素b6；(d)约0.05mg/l至约12.0mg/l维生素b9；和(e)约0.05mg/l至约2.5mg/l维生素b12。在一个变体方案中,培养基包含(a)约300mg/l(在一些实施方案中,200mg/l)至约1200mg/l胱氨酸；(b)约0.05mg/l至约1.0mg/l维生素b2；(c)约0.05mg/l至约10.0mg/l维生素b6；(d)约0.05mg/l至约12.0mg/l维生素b9；(e)约0.05mg/l至约2.5mg/l维生素b12；和(f)约2μm至约80μm铁源,例如柠檬酸铁或硫酸亚铁。在另一变体方案中,培养基包含如下成分之每一个：(a)约300mg/l(在一些实施方案中,200mg/l)至约1200mg/l胱氨酸；(b)约0.05mg/l至约1.0mg/l维生素b2；(c)约0.05mg/l至约10.0mg/l维生素b6；(d)约0.05mg/l至约12.0mg/l维生素b9；(e)约0.05mg/l至约2.5mg/l维生素b12；(f)约2μm至约80μm铁源,例如柠檬酸铁或硫酸亚铁；和(g)约0.05μm至约0.25μm氢化可的松。在再一实施方案中，培养基包含:约300mg/l(在一些实施方案中,200mg/l)至约1200mg/l胱氨酸；约2μm至约80μm铁源,例如柠檬酸铁或硫酸亚铁；和约0.05μm至约0.25μm氢化可的松。在再一变体方案中，培养基包含:约300mg/l(在一些实施方案中,200mg/l)至约1200mg/l胱氨酸；约2μm至约80μm铁源,例如柠檬酸铁或硫酸亚铁；约0.05μm至约0.25μm氢化可的松；和如下成分中的至少一种或两种或三种:约0.05mg/l至约1.0mg/l维生素b2；约0.05mg/l至约10.0mg/l维生素b6；约0.05mg/l至约12.0mg/l维生素b9；和约0.05mg/l至约2.5mg/l维生素b12。在本文描述的任何培养基中，在一方面，培养基是cdm。在本文描述的任何培养基中，在一方面，培养基是化学不确定的细胞培养基。
在一些其它变体方案中，细胞培养基进一步包含表1所述量的半胱氨酸。例如，可以理解，包含(a)约300mg/l(在一些实施方案中,200mg/l)至约1200mg/l胱氨酸；(b)约0.05mg/l至约1.0mg/l维生素b2；(c)约0.05mg/l至约10.0mg/l维生素b6；(d)约0.05mg/l至约12.0mg/l维生素b9；和(e)约0.05mg/l至约2.5mg/l维生素b12的细胞培养基，可以进一步包含约80mg/l至约1500mg/l半胱氨酸。在一个变体方案中,包含(a)约300mg/l(在一些实施方案中,200mg/l)至约1200mg/l胱氨酸；(b)约0.05mg/l至约1.0mg/l维生素b2；(c)约0.05mg/l至约10.0mg/l维生素b6；(d)约0.05mg/l至约12.0mg/l维生素b9；(e)约0.05mg/l至约2.5mg/l维生素b12；和(f)约2μm至约80μm铁源,例如柠檬酸铁或硫酸亚铁的细胞培养基，可以进一步包含约80mg/l至约1500mg/l半胱氨酸。在一些变体方案中,包含(a)约300mg/l(在一些实施方案中,200mg/l)至约1200mg/l胱氨酸；(b)约0.05mg/l至约1.0mg/l维生素b2；(c)约0.05mg/l至约10.0mg/l维生素b6；(d)约0.05mg/l至约12.0mg/l维生素b9；(e)约0.05mg/l至约2.5mg/l维生素b12；(f)约2μm至约80μm铁源,例如柠檬酸铁或硫酸亚铁；和(g)约0.05μm至约0.25μm氢化可的松的细胞培养基，可以进一步包含约80mg/l至约1500mg/l半胱氨酸。在再一变体方案，包含约300mg/l(在一些实施方案中,200mg/l)至约1200mg/l胱氨酸；约2μm至约80μm铁源,例如柠檬酸铁或硫酸亚铁；约0.05μm至约0.25μm氢化可的松；和如下成分中的至少一种或两种或三种:约0.05mg/l至约1.0mg/l维生素b2；约0.05mg/l至约10.0mg/l维生素b6；约0.05mg/l至约12.0mg/l维生素b9；和约0.05mg/l至约2.5mg/l维生素b12的细胞培养基，可以进一步包含约80mg/l至约1500mg/l半胱氨酸。
各培养基成分可以以导致一种或多种有益性质(例如一种或多种可接受的产品品质属性)的量存在。在一个变体方案中，本文提供的细胞培养基包含表1中所述量的培养基成分。可以理解，培养基可以以表1中所列的任何量包含表1中的任何一种或多种培养基成分(例如，成分(a)-(g)中的任何一种或多种，例如包含成分(a),(b),(c),(d)和(e)的培养基、或包含成分(a),(f)和(g)的培养基、或包含成分(a)-(g)之每一种的培养基)，就如同具体地单独地列出了成分及量的每一种和所有组合。在一个特定变体方案中，培养基是cdm。在另一特定变体方案中，培养基是化学不确定的细胞培养基。本文提供的培养基(例如cdm)在一个变体方案中包含吡哆醇，且不含吡哆醛。不含吡哆醛的培养基可以用于基础培养基和/或补料培养基中。在一个变体方案中，基础培养基不含吡哆醛，含有吡哆醇。
表1.培养基成分的示例性量
在一些方面，本发明提供细胞培养基，其包含选自下组的如下成分中的一种或多种：(a)维生素b1；(b)维生素b2；(c)维生素b3；(d)维生素b5；(e)维生素b6；(f)维生素b7；(g)维生素b9；(h)维生素b12；(i)铁源例如柠檬酸铁；和(j)胱氨酸。在一些实施方案中，细胞培养基包含成分(a),(b),(c),(d),(e),(f),(g),(h),(i)和(j)中的2或3或4或5或6或7或8或9种或每一种。可以理解，本文提供的细胞培养基可以含有成分(a),(b),(c),(d),(e),(f),(g),(h),(i)和(j)的任何组合，就如同具体地单独地列出了每一种和所有的组合。例如，可以理解，包含成分(a),(b),(c),(d),(e),(f),(g)和(h)中的8种的细胞培养基可以包含这些成分的任何组合，只要存在这些成分中的至少8种即可。在一些实施方案中，本文提供的细胞培养基包含成分(b),(e),(g),(h)和(j)。在本文的一些实施方案中，包含成分(b),(e),(g),(h)和(j)的本文提供的细胞培养物还包含(a),(c),(d)和(f)。在本文的一些实施方案中，包含成分(a),(b),(c),(d),(e),(f),(g),(h)和(j)的本文提供的细胞培养物还包含(i)。
在一些方面，本文提供的细胞培养基以表1a所述的量含有选自下组的一种或多种培养基成分：(a)维生素b1；(b)维生素b2；(c)维生素b3；(d)维生素b5；(e)维生素b6；(f)维生素b7；(g)维生素b9；(h)维生素b12；(i)铁源例如柠檬酸铁；和(j)胱氨酸。可以理解，培养基可以以表1a中所列的任何量包含表1a的培养基成分中的任一种或多种(例如，成分(a)-(j)中的任一或多种，例如包含成分(a),(b),(c),(d),(e),(f),(g),(h)和(i)的培养基，或包含成分(b),(e),(g),(h)和(j)的培养基，或包含成分(a)-(j)中的仅一种的培养基)，就如同具体地单独地列出了成分和量的每一种和所有组合。在一些方面，细胞培养基包含成分(a),(b),(c),(d),(e),(f),(g),(h)和(i),其中(a)是约2μm至约14μm维生素b1,(b)是约0.11μm至约0.72μm维生素b2,(c)是约11μm至约72μm维生素b3,(d)是约6.8μm至约44μm维生素b5,(e)是约4.5μm至约30μm维生素b6,(f)是约0.02μm至约0.14μm维生素b7,(g)是约3.4μm至约22μm维生素b9,(h)是约0.2μm至约1.5μm维生素b12,(i)是约11μm至约36μm柠檬酸铁,且(j)是约0.9mm至约1.5mm胱氨酸。
在一些其它方面，细胞培养基还包含表1a所述量的半胱氨酸。例如，可以理解，包含(a)从约约2μm至约14μm维生素b1,(b)从约0.11μm至约0.72μm维生素b2,(c)从约11μm至约72μm维生素b3,(d)从约6.8μm至约44μm维生素b5,(e)从约4.5μm至约30μm维生素b6,(f)从约0.02μm至约0.14μm维生素b7,(g)从约3.4μm至约22μm维生素b9,(h)从约0.2μm至约1.5μm维生素b12,(i)从约11μm至约36μm柠檬酸铁和(j)从约0.7mm至约2.0mm胱氨酸的细胞培养基，还可以包含(k)从约0.5mm至约2.0mm半胱氨酸。
表1a.培养基成分的示例性量
本文提供的培养基(例如cdm或化学不确定的培养基)在一个变体方案中包含胱氨酸且不含半胱氨酸。不含半胱氨酸的培养基可以用于基础培养基或补料培养基中。在一个变体方案中，基础培养基不含半胱氨酸，但含有胱氨酸。在一个变体方案中，含有从约300mg/l(在一些实施方案中,200mg/l)至约1200mg/l胱氨酸；从约0.05mg/l至约1.0mg/l维生素b2；从约0.05mg/l至约10.0mg/l维生素b6(其在一方面是吡哆醇)；从约0.05mg/l至约12.0mg/l维生素b9；和从约0.05mg/l至约2.5mg/l维生素b12的基础培养基,其在一方面可以进一步包含以下之任一种或多种:(1)维生素b1(其在一方面以从约2.0μm至约14.0μm的浓度存在),(2)维生素b3(其在一方面以从约11.0μm至约72.0μm的浓度存在),(3)维生素b5(其在一方面以从约6.8μm至约44.0μm的浓度存在),和(4)维生素b7(其在一方面以从约0.02μm至约0.24μm的浓度存在)，该基础培养基不含半胱氨酸。在另一变体方案中，包含从约0.8mm(在一些实施方案中,0.7mm)至约2.5mm胱氨酸；从约0.11μm至约0.72μm维生素b2；从约4.5μm至约30μm维生素b6(其在一方面是吡哆醇)；从约3.4μm至约22μm维生素b9；和从约0.2μm至约1.5μm维生素b12的基础培养基,其在一方面可以进一步包含以下之任一种或多种:(1)维生素b1(其在一方面以从约2.0μm至约14.0μm的浓度存在),(2)维生素b3(其在一方面以从约11.0μm至约72.0μm的浓度存在),(3)维生素b5(其在一方面以从约6.8μm至约44.0μm的浓度存在),和(4)维生素b7(其在一方面以从约0.02μm至约0.24μm的浓度存在)，该基础培养基不含半胱氨酸。在本文的任何变体方案中，基础培养基可以进一步包含铁源，例如柠檬酸铁或硫酸亚铁(其在一方面以从约11.0μm至约36.0μm的浓度存在)。在本文任何变体方案中，基础培养基还可以包含氢化可的松(其在一方面以从约0.05μm至约0.5μm的浓度存在)。
本文提供的培养基(例如cdm或化学不确定的培养基)在一个变体方案中包含半胱氨酸，不含胱氨酸。不含胱氨酸的培养基可以用于基础培养基或补料培养基中。在一个变体方案中，补料培养基不含胱氨酸，包含半胱氨酸。在一个变体方案中，补料培养基包含从约80mg/l至约1500mg/l半胱氨酸。在另一变体方案中，补料培养基包含从约0.5mm至约2.0mm半胱氨酸。例如，含有从约300mg/l(在一些方面,200mg/l)至约1200mg/l胱氨酸；从约0.05mg/l至约1.0mg/l维生素b2；从约0.05mg/l至约10.0mg/l维生素b6(其在一方面是吡哆醇)；从约0.05mg/l至约12.0mg/l维生素b9；和从约0.05mg/l至约2.5mg/l维生素b12的基础培养基,其在一方面可以进一步包含以下之任一或多种：(1)维生素b1(其在一方面以从约2.0μm至约14.0μm的浓度存在),(2)维生素b3(其在一方面以从约11.0μm至约72.0μm的浓度存在),(3)维生素b5(其在一方面以从约6.8μm至约44.0μm的浓度存在),和(4)维生素b7(其在一方面以从约0.02μm至约0.24μm的浓度存在)，该基础培养基可以补充补料培养基，所述补料培养基包含从约80mg/l至约1500mg/l半胱氨酸(在一些方面,0.5mm至约2.0mm半胱氨酸)。在另一变体方案中，包含从约0.8mm(在一些方面,0.7mm)至约2.5mm胱氨酸；从约0.11μm至约0.72μm维生素b2；从约4.5μm至约30μm维生素b6(其在一方面是吡哆醇)；从约3.4μm至约22μm维生素b9；和从约0.2μm至约1.5μm维生素b12的基础培养基，其在一方面可以进一步包含以下之任一或多种:(1)维生素b1(其在一方面以从约2.0μm至约14.0μm的浓度存在),(2)维生素b3(其在一方面以从约11.0μm至约72.0μm的浓度存在),(3)维生素b5(其在一方面以从约6.8μm至约44.0μm的浓度存在),和(4)维生素b7(其在一方面以从约0.02μm至约0.24μm的浓度存在)，该基础培养基可以补充补料培养基，所述补料培养基包含从约80mg/l至约1500mg/l半胱氨酸(在一些方面,0.5mm至约2.0mm半胱氨酸)。在本文任何变体方案中，基础培养基还可以包含铁源，例如柠檬酸铁或硫酸亚铁(其在一方面以从约11.0μm至约36.0μm的浓度存在)。在本文任何变体方案中，基础培养基还可以包含氢化可的松(其在一方面以从约0.05μm至约0.5μm的浓度存在)。
本文提供的培养基(例如cdm或化学不确定的培养基)在一个变体方案中包含柠檬酸铁，不含硫酸亚铁。不含硫酸亚铁的培养基可以用于基础培养基或补料培养基。在一个变体方案中，基础培养基不含硫酸亚铁，含有柠檬酸铁。
在一个特定变体方案中，本文提供的培养基不含半胱氨酸和硫酸亚铁。在一个这样的变体方案中，培养基不含半胱氨酸和硫酸亚铁，而包含胱氨酸和/或柠檬酸铁。
本文提供的培养基在一个变体方案中不含氢化可的松。在另一变体方案中,培养基包含氢化可的松。在一方面,培养基包含氢化可的松，不含半胱氨酸和/或硫酸亚铁。在另一方面，培养基包含氢化可的松和胱氨酸及柠檬酸铁。在一个特定变体方案中，包含氢化可的松的培养基是基础培养基。在一个变体方案中,基础培养基包含从约0.8mm(在一些方面,0.7mm)至约2.5mm胱氨酸；从约2μm至约80μm柠檬酸铁；从约0.05μm至约0.5μm氢化可的松,其中该基础培养基可以进一步包含一种或多种下述成分:(1)维生素b2(其在一方面以从约0.05mg/l至约1.0mg/l的浓度存在)；(2)维生素b6(其在一方面以从约0.05mg/l至约10.0mg/l的浓度存在)；(3)维生素b9(其在一方面以从约0.05mg/l至约12.0mg/l的浓度存在)；和(4)维生素b12(其在一方面以从约0.05mg/l至约2.5mg/l的浓度存在)。在另一变体方案中,基础培养基包含从约300mg/l(在一些方面,200mg/l)至约1200mg/l胱氨酸；从约2μm至约80μm柠檬酸铁；和从约0.05μm至约0.5μm氢化可的松,且其中该基础培养基可以进一步包含一种或多种下述成分:(1)维生素b2(其在一方面以从约0.05mg/l至约1.0mg/l的浓度存在)；(2)维生素b6(其在一方面以从约0.05mg/l至约10.0mg/l的浓度存在)；(3)维生素b9(其在一方面以从约0.05mg/l至约12.0mg/l的浓度存在)；和(4)维生素b12(其在一方面以从约0.05mg/l至约2.5mg/l的浓度存在)。在本文的任何变体方案中，基础培养基可以进一步包含以下之任一或多种:(1)维生素b1(其在一方面以从约2.0μm至约14.0μm的浓度存在),(2)维生素b3(其在一方面以从约11.0μm至约72.0μm的浓度存在),(3)维生素b5(其在一方面以从约6.8μm至约44.0μm的浓度存在),和(4)维生素b7(其在一方面以从约0.02μm至约0.24μm的浓度存在)。
本发明还提供制备用于培养细胞的细胞培养基的方法，其中该方法包括：将选自下组的任一种或多种培养基成分混合：(a)胱氨酸和/或半胱氨酸；(b)维生素b2,(c)维生素b6(吡哆醇和/或吡哆醛),(d)维生素b9,(e)维生素b12,(f)铁源例如柠檬酸铁和(g)氢化可的松,其中(a)-(g)均以表1中所述量提供。本发明还提供制备用于培养细胞的细胞培养基的方法，其中该方法包括将选自下组的任一种或多种培养基成分以表1a中所述的量组合：(a)维生素b1；(b)维生素b2；(c)维生素b3；(d)维生素b5；(e)维生素b6；(f)维生素b7；(g)维生素b9；(h)维生素b12；(i)铁源例如柠檬酸铁；(j)胱氨酸；和(k)半胱氨酸。在一个变体方案中，该方法包括将本文描述任一或多种培养基成分(例如表1或表1a)加入适于细胞培养的组合物中，其中该一种或多种培养基成分可以相继地或同时地加入组合物中。在再一变体方案中，该方法包括在第一时间段将本文描述的任一种或多种培养基成分(例如表1或表1a)组合在适于细胞培养的组合物中，其中该方法还包括在第二时间段添加一定量的一种或多种培养基成分，例如在细胞培养周期中至少一次、至少二次、至少三次、至少四次、至少五次、至少六次、至少七次等。在一些实施方案中，细胞培养周期是至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、或任何天数，其中细胞可以保持在细胞培养物中而仍保持存活。在制备用于培养细胞的细胞培养基的方法的一个变体方案中，胱氨酸以在细胞培养基中提供大约300mg/l(在一些方面，200mg/l)至约1200mg/l胱氨酸的量添加,维生素b2以在细胞培养基中提供大约0.05mg/l至约1.0mg/l维生素b2的量添加,维生素b6以在细胞培养基中提供大约0.05mg/l至约10.0mg/l维生素b6的量添加,维生素b9以在细胞培养基中提供大约0.05mg/l至约12.0mg/l维生素b9的量添加,和维生素b12以在细胞培养基中提供大约0.05mg/l至约2.5mg/l维生素b12的量添加。在制备用于培养细胞的细胞培养基的方法的另一变体方案中，胱氨酸以在细胞培养基中提供大约0.8mm在一些方法,0.7mm)至约2.5mm胱氨酸的量添加,维生素b2以在细胞培养基中提供大约0.11μm至约0.72μm维生素b2的量添加,维生素b6以在细胞培养基中提供大约4.5μm至约30.0μm维生素b6的量添加,维生素b9以在细胞培养基中提供大约3.4μm至约22.0μm维生素b9的量添加,和维生素b12以在细胞培养基中提供大约0.2μm至约1.5μm维生素b12的量添加。
在本文的一些变体方案中，细胞培养基是基础细胞培养基。在本文其它变体方案中，细胞培养基是补料细胞培养基。在本文一些变体方案中，细胞培养基是基础细胞培养基，其以表1所述量包含选自下组的任一或多种培养基成分：(a)胱氨酸；(b)维生素b2,(c)维生素b6(吡哆醇和/或吡哆醛),(d)维生素b9,(e)维生素b12,(f)铁源例如柠檬酸铁，和(g)氢化可的松，其中该基础培养基补充(例如，在细胞培养周期开始后的时间段，例如细胞培养周期中至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次之任一等)补料细胞培养基，所述补料细胞培养基包含表1所述量的(a)半胱氨酸。在本文的一些变体方案中，细胞培养基是基础细胞培养基，所述基础细胞培养基以表1a所述的量包含选自下组的任一或多种培养基成分：(a)维生素b1；(b)维生素b2；(c)维生素b3；(d)维生素b5；(e)维生素b6；(f)维生素b7；(g)维生素b9；(h)维生素b12；(i)铁源例如柠檬酸铁；和(j)胱氨酸，其中该基础细胞培养基补充(例如，在细胞培养周期开始后的时间段，例如细胞培养周期中至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次之任一等)补料细胞培养基，所述补料细胞培养基包含表1a所述量的(k)半胱氨酸。
本领域技术人员将明了，本文描述的细胞培养基可以(例如，除了胱氨酸、维生素b1、维生素b2、维生素b3、维生素b5、维生素b6、维生素b7、维生素b9、和维生素b12、铁、以及任选地氢化可的松中的一种或多种外还)包含可用于细胞培养的其它成分。例如，可以理解，细胞培养基可以包含其它成分，例如氨基酸(例如，谷氨酰胺、精氨酸、或天冬酰胺)、维生素(包括但不限于抗坏血酸)、痕量元素、过渡金属(包括但不限于镍、铜或锌)、以及其它培养基成分，例如但不限于，源于动物和/或植物的水解物。本文提供的任何培养基也可以补充激素和/或其它生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白、或表皮生长因子)、离子(例如，钠、氯、钙、镁、和磷酸根)、缓冲液(例如hepes)、核苷(例如腺苷和胸苷)、以及葡萄糖或等同能源。其它细胞培养基成分，例如本文所列的那些，可以以合适的浓度在细胞培养基周期中于不同的时间包括在细胞培养基中，这是本领域技术人员明了的。
与在不同培养基中生产的多肽的品质属性相比，本文提供的培养基当用于多肽生产方法中时在一方面导致一种或多种有利的产品品质属性。生产具有改变的电荷变体分布的蛋白质产品(例如抗体产品)可以影响蛋白质产品的品质属性，例如蛋白质产品的颜色。此外，在使用某些培养基成分时形成的活性氧(ros)可以氧化特定的氨基酸，产生氧化产物。这些产物变体的存在也可能改变蛋白质产品的品质属性，例如颜色。包含使用本文描述的培养基产生的多肽的组合物(包括含有至少100mg/ml、或125mg/ml、或150mg/ml多肽如抗体的组合物)的颜色，在一方面，具有表2所述的颜色参考标准值。在特定变体方案中，包含使用本文描述的培养基产生的多肽的组合物(包括含有至少100mg/ml、或125mg/ml、或150mg/ml多肽如抗体的组合物)的颜色，在一方面，具有选自以下的颜色参考标准值：b3,b4,b5,b6,b7,b8,b9,by3,by4,by5,by6,by7,y3,y4,y5,y6,y7,gy3,gy4,gy5,gy6,gy7,r3,r4,r5,r6和r7。在另一方面，包含使用本文描述的培养基产生的多肽的组合物(包括含有至少1mg/ml、或25mg/ml、或50mg/ml或75mg/ml多肽如抗体的组合物)的颜色，在一方面，具有表2所述的颜色参考标准值。在一些变体方案中，包含使用本文描述的培养基产生的多肽的组合物(包括含有至少1mg/ml、或25mg/ml、或50mg/ml或75mg/ml多肽如抗体的组合物)的颜色，在一方面，具有选自以下的颜色参考标准值：b3,b4,b5,b6,b7,b8,b9,by3,by4,by5,by6,by7,y3,y4,y5,y6,y7,gy3,gy4,gy5,gy6,gy7,r3,r4,r5,r6和r7。关于颜色参考值棕色(b),棕黄色(by),黄色(y),绿黄色(gy)或红色(r)的描述，参见usp-24专论631colorandachromaticity.unitedstatespharmacopoeiainc.,2000,p.1926-1927，和councilofeurope.europeanpharmacopoeia,2008,7thed.p.22。在一个变体方案中，与在不同培养基中生产多肽时获得的电荷变体(例如酸性电荷变体)相比，本文提供的培养基当用于多肽生产方法中时减少电荷变体(例如酸性电荷变体)的存在。在另一变体方案中，与在不同培养基中生产多肽时获得的活性氧相比，本发明培养基当用于多肽生产方法中时减少活性氧的存在。在另一变体方案中，与在不同培养基中生产多肽时获得的杂质相比，本发明培养基当用于多肽生产方法中时减少杂质的存在。
如本文描述的，本发明提供各种方法(例如培养细胞的方法和生产多肽的方法)，所述方法使用本章节及其它地方描述的细胞培养基。
方法
本文描述的细胞培养基(包括本文描述的任何cdm或化学不确定培养基)可以用于培养细胞以生产多肽(包括特定抗体)的方法。培养基可以用于培养(无论是通过分批培养、补料分批培养或灌流培养)细胞的方法中，并可以用于生产抗体(包括本文描述的抗体的任何方面或变体方案或实施方案)的方法中。
本发明提供通过使细胞与本文描述的细胞培养基接触来生长细胞(即，培养细胞)的方法。在一个变体方案中，方法包括使细胞与细胞培养基接触，所述细胞培养基包含表1所述的一种或多种培养基成分(例如，以表1所列任何量，培养基包含成分(a),(b),(c),(d)和(e)，或培养基包含成分(a),(f)和(g)，或培养基包含成分(a)-(g)中的每一个)。在一个变体方案中，方法包括使细胞与细胞培养基接触，所述细胞培养基包含表1a所述的一种或多种培养基成分(例如，以表1a所列的任何量，培养基包含成分(a)-(j)或培养基包含成分(a),(b),(c),(d),(e),(f),(g),(h)和(i),或培养基包含成分(b),(e),(g),(h)和(j)，或培养基仅包含成分(a)-(j)中的一种)。在生长细胞(即，培养细胞)的方法的一个特定变体方案中，细胞培养基是cdm。在该方法的一个方面，细胞生长(即，培养)在cdm基础培养基中。在生长细胞(即，培养细胞)的方法的另一特定变体方案中，细胞培养基是化学不确定的细胞培养基。在该方法的一个方面，细胞生长(即，培养)在化学不确定的基础细胞培养基中。在一些方面，细胞与所述细胞培养基在细胞生长阶段接触。在一些方面，细胞与所述细胞培养基在细胞生产阶段接触。在一些方面，该方法进一步包括步骤：向细胞培养基添加半胱氨酸。在再一方面，半胱氨酸以在细胞培养基中提供大约80mg/l至大约1500mg/l半胱氨酸的量添加。在另一其它方面，半胱氨酸以在细胞培养基中提供大约1500mg/l半胱氨酸的量添加。在再其它方面，半胱氨酸以在细胞培养基中提供大约140mg/l半胱氨酸的量添加。在另一其它方面，半胱氨酸以在细胞培养基中提供大约0.5mm至大约2.0mm半胱氨酸的量添加。在再其它方面，半胱氨酸以在细胞培养基中提供大约0.8mm半胱氨酸的量添加。
本发明还提供通过在细胞培养基中生长(即，在细胞培养基中培养)细胞来生产多肽的方法，其中所述细胞包含编码多肽的分离核酸，其中：(a)细胞表达多肽，且(b)该化学确定的细胞培养基包含表1所述的一种或多种培养基成分(例如，以表1所列任何量，培养基包含成分(a),(b),(c),(d)和(e)，或培养基包含成分(a),(f)和(g)，或培养基包含成分(a)-(g)中的每一个)。在另一变体方案中，提供通过在细胞培养基中生长(即，在细胞培养基中培养)细胞来生产多肽的方法，其中所述细胞包含编码多肽的分离核酸，其中：(a)细胞表达多肽，且(b)该细胞培养基包含表1a所述的一种或多种培养基成分(例如，以表1a所列的任何量，培养基包含成分(a)-(j),或培养基包含成分(a),(b),(c),(d),(e),(f),(g),(h)和(i),或培养基包含成分(b),(e),(g),(h)和(j)，或培养基仅包含成分(a)-(j)中的一种)。通过在细胞培养基中生长(即，在细胞培养基中培养)含有编码多肽的分离核酸的细胞来生产多肽的方法的一个特定变体方案中，细胞培养基是cdm。在该方法的一个方面，细胞生长(即，培养)在cdm基础培养基中。通过在细胞培养基中生长(即，在细胞培养基中培养)含有编码多肽的分离核酸的细胞来生产多肽的方法的另一特定变体方案中，细胞培养基是化学不确定的细胞培养基。在该方法的一个方面，细胞生长(即，培养)在化学不确定的基础细胞培养基中。在一些方面，所述培养在细胞生长阶段进行。在一些方面，所述培养在细胞生产阶段进行。在一些变体方案中，该方法进一步包括步骤：向细胞培养基添加半胱氨酸。在进一步变体方案中，半胱氨酸以在细胞培养基中提供大约80mg/l至大约1500mg/l半胱氨酸的量添加。在另一进一步的变体方案中，半胱氨酸以在细胞培养基中提供大约1500mg/l半胱氨酸的量添加。在再一进一步的变体方案中，半胱氨酸以在细胞培养基中提供大约140mg/l半胱氨酸的量添加。在另一进一步变体方案中，半胱氨酸以在细胞培养基中提供大约0.5mm至大约2.0mm半胱氨酸的量添加。在再一进一步变体方案中，半胱氨酸以在细胞培养基中提供大约0.8mm半胱氨酸的量添加。
本发明还提供施用本文所述多肽的方法。例如，提供用于向个体施用包含多肽的制剂的方法，其中所述制剂具有浓度大于至少100mg/ml、至少125mg/ml或至少150mg/ml的多肽，并具有通过coc试验测定大于b3,b4,b5,b6,b7,b8或b9的颜色强度值。在一些方面，通过coc试验测定的颜色强度值可以是，但不限于，b,by,y,gy或r中的任一个，其中较高的值指示较浅的颜色强度。在另一例子中，提供用于向个体施用包含多肽的制剂的方法，其中所述制剂具有浓度大于至少100mg/ml、至少125mg/ml或至少150mg/ml的多肽，并具有通过颜色试验(例如总颜色试验或nifty试验)测定的小于参考溶液的颜色强度值的颜色强度值。多肽制剂可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内，以及如果期望局部处理的话，损伤内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下施用。给药可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射，这部分取决于施用是短暂的还是长期的。因此，本文提供的含多肽制剂可以适于注射，例如皮下注射至个体(例如，皮下注射至人体)。在一些方面，适于注射(例如适于皮下注射)的含多肽制剂具有大于至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml的浓度，且具有通过coc试验测定大于b3,b4,b5,b6,b7,b8或b9的颜色强度值。在一些方面，通过coc试验测定的颜色强度值可以是，但不限于，b,by,y,gy或r中的任一个，其中较高的值指示较浅的颜色强度。在一些方面，适于注射(例如适于皮下注射)的含多肽制剂具有大于至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml的浓度，且具有通过颜色试验(例如总颜色试验或nifty试验)测定的小于参考溶液的颜色强度值的颜色强度值。本发明考虑各种给药方案，包括但不限于，单次施用或经不同时间点多次施用、快速浓注施用、和脉冲输注。
其它方法在整个本说明书中，例如，发明概述部分及其它地方提供。
细胞
本文提供的方法和组合物可以使用适于在本文所述培养基中生长和/或生产多肽(例如抗体)的任何细胞，包括动物、酵母或昆虫细胞。在一方面，方法和组合物的细胞是任何哺乳动物细胞或适于细胞培养和表达多肽的细胞类型。本文提供的方法(例如生长细胞(即培养细胞)和/或生产多肽的方法)和组合物可以因此使用任何适宜的细胞类型，包括动物细胞。在一方面，方法和组合物使用哺乳动物细胞。方法和组合物还可以使用杂交瘤细胞。在一个变体方案中，哺乳动物细胞是非杂交瘤哺乳动物细胞，其已经转化了编码期望多肽的外来分离核酸，所述期望多肽为例如抗体、抗体片段(包括配体结合性片段)、和嵌合抗体。在一个变体方案中，方法和组合物使用哺乳动物细胞，其选自：人成视网膜细胞(per.c6(crucell,leiden,荷兰))；sv40转化的猴肾cv1细胞系(cos-7,atcccrl1651)；人胚肾细胞系(293细胞或经亚克隆用于在悬浮培养中生长的293细胞,graham等,j.genvirol.,36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(bhk,atccccl10)；中国仓鼠卵巢细胞/-dhfr(cho,urlaub和chasin,proc.natl.acad.sci.usa,77:4216(1980))；小鼠支持细胞(tm4,mather,biol.reprod.,23:243-251(1980))；猴肾细胞(cv1atccccl70)；非洲绿猴肾细胞(vero-76,atcccrl-1587)；人宫颈癌细胞(hela,atccccl2)；犬肾细胞(mdck,atccccl34)；布法罗大鼠肝细胞(brl3a,atcccrl1442)；人肺细胞(w138,atccccl75)；人肝细胞(hepg2,hb8065)；小鼠乳腺肿瘤(mmt060562,atccccl51)；tri细胞(mather等,annalsn.y.acad.sci.,383:44-68(1982))；mrc5细胞；fs4细胞；和人肝细胞瘤系(hepg2)。在一个特定变体方案中，方法和组合物使用cho细胞。在一个特定变体方案中，进行cho细胞系的培养和多肽(例如抗体)自cho细胞系的表达。多肽(例如抗体)可以分泌至培养基(例如cdm)中，从培养基可以分离和/或纯化多肽；或者可以通过裂解包含编码多肽的分离核酸的细胞，将多肽释放至培养基中。
适应在重组脊椎动物细胞培养物中合成目的多肽的合适方法、载体和宿主细胞是本领域已知的，并描述于例如gething等,nature,293:620-625(1981)；mantei等,nature,281:40-46(1979)；levinson等；ep117,060；和ep117,058。一个特别可以用于哺乳动物培养物表达多肽的质粒是prk5(欧洲专利公布号307,247)或psvi6b(pct公布号wo91/08291,1991年6月13日公布)。
宿主细胞以表达或克隆载体转化，培养在经修饰适于诱导启动子、选择转化体、或扩增编码期望序列的基因的营养培养基中。对于哺乳动物细胞，graham和vandererb,virology,52:456-457(1978)的磷酸钙沉淀方法、或hawley-nelson,focus15:73(1193)的lipofectamine.tm.(gibcobrl)方法是优选的。哺乳动物细胞宿主系统转化的一般方面是本领域已知的，已经描述在例如axel的美国专利号4,399,216(1983年8月16日授权)中。对于转化哺乳动物细胞的各种技术，可以参见例如keown等,methodsinenzymology(1989),keown等,methodsinenzymology,185:527-537(1990),和mansour等,nature,336:348-352(1988)。
方法和组合物还涵盖使用杂交瘤，所述杂交瘤向细胞培养物中分泌单克隆抗体。可以通过如下方式制备单克隆抗体：从经免疫的动物回收免疫细胞(典型地脾细胞或来自淋巴结组织的淋巴细胞)，以常规方式，例如与骨髓瘤细胞融合、或通过eb病毒转化，使免疫细胞永生化，筛选表达期望抗体的克隆。杂交瘤技术最初由kohler和milstein,eur.j.immunol.,6:511(1976)描述，也描述在hammerling等,《monoclonalantibodiesandt-cellhybridomas》,elsevier,n.y.,pp.563-681(1981)，该技术已经广泛地应用于生产可以分泌抗许多特定抗原的高水平单克隆抗体的杂交细胞系。
多肽
通过本文描述的组合物(细胞)和方法产生的和存在于本文提供的组合物中的多肽可以和宿主细胞是同源的，或优选地可以是外源的，即对于所用的宿主细胞而言，其是异源的(即，外来的)，例如通过中国仓鼠卵巢细胞生产的人蛋白、或通过哺乳动物细胞生产的酵母多肽。在一个变体方案中，多肽是被宿主细胞直接地分泌至培养基中的哺乳动物多肽(例如抗体)。在另一变体方案中，通过裂解包含编码多肽的分离核酸的细胞，将多肽释放到培养基中。
在一个变体方案中，多肽是链长足以产生高级的三级和/或四级结构的氨基酸序列。在一方面，多肽具有至少大约5-20kd、或者至少大约15-20kd、优选至少大约20kd的分子量。
可以在宿主细胞中表达的任何多肽均可以根据本公开进行生产，并且可以存在于本文提供的组合物中。多肽可以从对于宿主细胞而言内源的基因表达，或可以从通过遗传工程引入宿主细胞的基因表达。多肽可以是天然存在的多肽，或可以备选地具有经过工程化或经过人为选择的序列。工程化多肽可以从各自天然存在的其它多肽片段装备，或可以包括一个或多个非天然存在的片段。
常常可以基于感兴趣的生物学或化学活性，选择可能期望根据本发明表达的多肽。例如，本发明可以用于表达任何医药或商业相关的酶、受体、抗体、激素、调节因子、抗原、结合剂等。
多种多肽可以根据本文提供的方法生产，并存在于本文提供的组合物中。细菌多肽的实例包括例如碱性磷酸酶和β内酰胺酶。哺乳动物多肽的例子包括分子,例如肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1抗胰蛋白酶；胰岛素a链；胰岛素b链；胰岛素原；促滤泡激素；降钙素；促黄体生成激素；胰高血糖素；凝血因子，例如因子viiic、因子ix、组织因子、和冯·维勒布兰德因子；抗凝血因子，例如蛋白c；心房钠尿肽；肺表面活性物质；纤溶酶原激活物，例如脲激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-pa)；铃蟾肤；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子α和β；脑啡肽酶；rantes(正常t细胞表达分泌的活化调节因子)；人巨噬细胞炎性蛋白(mip-1α)；血清白蛋白、例如人血清白蛋白；缪勒管抑制物质；松弛素a链；松弛素b链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白，例如β内酰胺酶；dna酶；抑制素；活化素；血管内皮生长因子(vegf)；激素受体或生长因子受体；整联蛋白；蛋白a或d；类风湿因子；神经营养因子例如骨源神经营养因子(bdnf)、神经营养因子3、4、5、或6(nt-3、nt-4、nt-5或nt-6)、或神经生长因子例如ngf-b；血小板来源的生长因子(pdgf)；成纤维细胞生长因子例如afgf和bfgf；表皮生长因子(egf)；转化生长因子(tgf)，例如tgf-α和tgf-β,包括tgf-β1,tgf-β2,tgf-β3,tgf-β4或tgf-β5；胰岛素样生长因子-i和-ii(igf-i和igf-ii)；des(1-3)-igf-i(脑igf-i),胰岛素样生长因子结合蛋白；cd蛋白例如cd3,cd4,cd8,和cd19；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(bmp)；干扰素例如干扰素α、β和γ；集落刺激因子(csf)，例如m-csf,gm-csf和g-csf；白介素(ils),例如il-1至il-10；超氧化物歧化酶；t细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原例如aids包膜的部分；转运蛋白；归巢蛋白；地址素；调节性蛋白；抗体；以及上述任何多肽的片段。
抗体是根据本文提供的方法生产的、可以存在于本文提供的组合物中的哺乳动物多肽的实例。抗体是一类优选的多肽，其表现出对特定抗原的结合特异性。天然抗体通常是异源四聚体糖蛋白，大约150,000道尔顿，由两条相同轻链(l)和两条相同重链(h)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而不同免疫球蛋白同种型的重链之间存在不同数目的二硫键。每条重链和轻链也具有规律间隔的链内二硫键。每条重链在一端具有可变结构域(vh)，之后接数个恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(vl)，在另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，轻链的可变结构域与重链的可变结构域对齐。据信特定的氨基酸残基形成轻链和重链可变结构域之间的界面。
抗体可以是天然免疫球蛋白分子，具有均基于免疫球蛋白折叠的不同结构。例如，igg抗体具有两条“重”链和两条“轻”链，它们通过二硫键结合形成功能性抗体。每条重链和轻链本身包含“恒定”(c)和“可变”(v)区。v区决定抗体的抗原结合特异性，而c区提供结构支持，并具有和免疫效应物发生非抗原特异性相互作用的功能。抗体或抗体的抗原结合片段的抗原结合特异性是抗体特异性结合特定抗原的能力。
抗体的抗原结合特异性由v区的结构特征决定。该可变性并非均匀地分布在可变结构域的110个氨基酸跨度上。相反地，v区由称作构建区(fr)的15-30个氨基酸的相对不变的区段组成，这些构架区被每个长9-12个氨基酸的称作“高变区”的极端可变的较短区域分开。天然重链和轻链的可变区各包含4个fr，其主要采取β折叠构型，通过三个高变区连接，其中高变区形成环连接β折叠结构，并在一些情况下形成β折叠结构的一部分。在每条链中高变区通过fr而紧靠在一起，并与来自另一链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见kabat等,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第五版，publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应功能，例如参与抗体的抗体依赖性细胞毒性(adcc)。
每个v区典型地包含三个互补决定区(“cdrs”,各含有“高变环”)、和四个构架区。抗体的结合部位，即以实质性亲和力与特定的期望抗原结合所需的最小结构单位，因此典型地包括3个cdr、以及至少3个、优选4个构架区，其中构架区分散在cdr之间以使cdr保持和呈现合适的构象。经典的四链抗体具有通过vh和vl结构域协作定义的抗原结合位点。某些抗体，例如骆驼和鲨鱼抗体，缺失轻链，仅依赖于由重链形成的结合位点。可以制备单结构域工程化免疫球蛋白，其中结合位点由重链或轻链单独形成，不存在vh和vl之间的协作。
术语“可变”指，可变结构域的某些部分在抗体之间具有显著不同的序列，这些部分用于每个特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并非均匀地分布在抗体的整个可变结构域上。其在轻链和重链可变结构域中均集中在称作高变区的三个区段中。可变结构域中较为高度保守的区域称作构架区(frs)。天然重链和轻链的可变结构域各包含4个fr，其主要采取β折叠构型，通过三个高变区连接，其中高变区形成环连接β折叠结构，并在一些情况下形成β折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过fr而紧靠在一起，并且与来自另一链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见kabat等，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第五版，publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991))。恒定区不直接参与抗体对抗原的结合，但表现出多种效应功能，例如参与抗体的抗体依赖性细胞毒性(adcc)。
术语“高变区”在本文中使用时指，抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区可以包含来自“互补决定区”或“cdr”(例如,在vl中围绕大约残基24-34(l1),50-56(l2)和89-97(l3),在vh中围绕大约31-35b(h1),50-65(h2)和95-102(h3)(kabat等,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第五版publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991))的氨基酸残基和/或来自“高变环”(例如，vl中残基26-32(l1),50-52(l2)和91-96(l3),vh中26-32(h1),52a-55(h2)和96-101(h3)(chothia和leskj.mol.biol.196:901-917(1987))的那些残基。
“构架区”或“fr”残基是除本文中定义的高变区残基之外的可变结构域残基。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两条相同的抗原结合片段——称作“fab"片段(其各有一个抗原结合位点)和一个残留的“fc"片段——其名字反映了其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并仍能够与抗原交联的f(ab')2片段。
“fv”是含有完整的抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密非共价结合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体构成。其所采取的构型使得每个可变结构域的三个高变区可以相互作用以在vh-vl二聚体表面定义一个抗原结合位点。六个高变区共同地赋予抗体抗原结合特异性。然而，甚至单个可变结构域(或包含仅三个对抗原特异的高变区的fv的一半)也能够识别和结合抗原，只是其比完整结合位点具有较低的亲和力。
fab片段也含有轻链的恒定区和重链的第一恒定区(ch1)。fab'片段与fab片段的差异在于包含重链ch1结构域的羧基端的少许残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。fab'-sh在本文中用于指这样的fab'，其恒定结构域中的半胱氨酸残基带有至少一个游离的巯基基团。f(ab')2抗体片段最初作为fab'片段对产生，其中在该对fab'片段之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”都可以，基于其恒定结构域的氨基酸序列，归至两个明确不同类(称作κ和λ)中的一个。
基于抗体重链恒定结构域的氨基酸序列，抗体可以分为不同类。存在5大类完整抗体：iga,igd,ige,igg和igm，其中一些可以进一步分成亚类(同种型)，例如，igg1,igg2,igg3,igg4,iga和iga2。相应于不同类抗体的重链恒定结构域分别称为α,δ,ε,γ和μ。不同类免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的。
“单链fv"或“scfv”抗体片段包含抗体的vh和vl结构域，其中这些结构域存在于单一一条多肽链中。在一些实施方案中，fv多肽还包含vh和vl结构域之间的多肽接头，该接头使得scfv可以形成用于抗原结合的期望结构。关于scfv的综述，参见plückthun《thepharmacologyofmonoclonalantibodies》,vol.113,rosenburgandmooreeds.,springer-verlag,newyork,pp.269-315(1994)。
术语“双体抗体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含在同一条多肽链中与轻链可变结构域(vl)连接的重链可变结构域(vh)(vh-vl)。通过使用短到不允许同一链上的两个结构域之间发生配对的接头，可以迫使这些结构域与另一链上的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。双体抗体的更完全描述可以见于例如,ep404,097；wo93/11161；和hollinger等,proc.natl.acad.sci.usa,90:6444-6448(1993)。
为了本文目的，“完整抗体”是包含重链和轻链可变结构域以及fc区的抗体。这些恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。优选地，完整抗体具有一种或多种效应子功能。
“天然抗体”通常是异源四聚体糖蛋白，大约150,000道尔顿，由两条相同轻链(l)和两条相同重链(h)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而不同免疫球蛋白同种型的重链具有不同数目的二硫键。每条重链和每条轻链还具有规律间隔的链内二硫键。每条重链在一端具有可变结构域(vh)，之后接数个恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(vl)，在另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，轻链的可变结构域与重链的可变结构域对齐。据信特定的氨基酸残基形成轻链和重链可变结构域之间的界面。
“裸抗体”是未与异源分子例如细胞毒性结构部分或放射标记物缀合的抗体(如本文定义)。
抗体指向目的抗原。优选地，抗原是生物学重要的多肽，向患有疾病或病症的个体施用抗体可以在该哺乳动物中导致治疗益处。然而，也可以使用指向非多肽抗原(例如肿瘤相关糖脂抗原；参见美国专利号5,091,178)的抗体。
当抗原是多肽时，其可以是跨膜分子(例如受体)或配体例如生长因子。示例性抗原包括分子，例如肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺素；促甲状腺素；脂蛋白；α-1抗胰蛋白酶；胰岛素a链；胰岛素b链；胰岛素原；促滤泡激素；降钙素；促黄体生成激素；胰高血糖素；凝血因子，例如因子viiic、因子ix、组织因子、和冯·维勒布兰德因子；抗凝血因子，例如蛋白c；心房钠尿肽；肺表面活性物质；纤溶酶原激活物，例如脲激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-pa)；铃蟾肤；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子α和β；脑啡肽酶；rantes(正常t细胞表达分泌的活化调节因子)；人巨噬细胞炎性蛋白(mip-1α)；血清白蛋白、例如人血清白蛋白；缪勒管抑制物质；松弛素a链；松弛素b链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白，例如β内酰胺酶；dna酶；ige；细胞毒性t淋巴细胞相关抗原(ctla)，例如ctla-4；抑制素；活化素；血管内皮生长因子(vegf)；激素受体或生长因子受体；蛋白a或d；类风湿因子；神经营养因子例如骨源神经营养因子(bdnf)、神经营养因子3、4、5、或6(nt-3、nt-4、nt-5或nt-6)、或神经生长因子例如ngf-β；血小板来源的生长因子(pdgf)；成纤维细胞生长因子例如afgf和bfgf；表皮生长因子(egf)；转化生长因子(tgf)，例如tgf-α和tgf-β,包括tgf-β1,tgf-β2,tgf-β3,tgf-β4或tgf-β5；胰岛素样生长因子-i和-ii(igf-i和igf-ii)；des(1-3)-igf-i(脑igf-i),胰岛素样生长因子结合蛋白；cd蛋白例如cd3,cd4,cd8,cd18,cd19,cd20和cd40；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(bmp)；干扰素例如干扰素α、β和γ；集落刺激因子(csf)，例如m-csf,gm-csf和g-csf；白介素(ils),例如il-1至il-10；超氧化物歧化酶；t细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原例如aids包膜的部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节性蛋白；整联蛋白，例如cd11a,cd11b,cd11c,cd18,icam,vla-4和vcam；肿瘤相关抗原，例如her2,her3或her4受体；以及上述任何多肽的片段。
本文所述抗体的优选分子靶标包括cd蛋白，例如cd3,cd4,cd8,cd18,cd19,cd20,cd34和cd40；erbb受体家族成员，例如egf受体、her2,her3或her4受体；细胞粘着分子，例如lfa-1,mac1,p150.95,vla-4,icam-1,vcam,α4/β7整联蛋白和αv/β3整联蛋白，包括其α或β亚基(例如，抗cd11a、抗cd18或抗cd11b抗体)；生长因子如vegf；组织因子(tf)；α干扰素(α-ifn)；白介素例如il-8；ige；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(ob)受体；mpl受体；ctla-4；蛋白c等。
可以通过本文所述方法生产的抗体(包括其片段，又包括抗原结合片段)，包括但不限于，抗-her2,抗体2c4,抗-vegf,抗体c2b8,抗cd11a,抗组织因子,igg4b,抗-cd40,抗-cd20,抗-ige,e25,e26,抗-pcsk9和抗-β7。
细胞生长和多肽生产
一般，细胞与本文所述的任何细胞培养基在促进细胞生长、维持和/或多肽生产之任一的一种或多种条件下组合(接触)。生长细胞(即，培养细胞)和生长多肽的方法使用培养容器(生物反应器)以容纳细胞和细胞培养基。培养容器可以由任何适于培养细胞的材料组成，包括玻璃、塑料或金属。典型地，培养容器是至少1升，并可以是10,100,250,500,1000,2500,5000,8000,10,000升或更大。可以在培养过程中调节的培养条件包括但不限于ph和温度。
细胞培养物一般在初始生长阶段维持在利于细胞培养物生存、生长和存活(维持)的条件下。精确的条件随着细胞类型、细胞来源的生物、和所表达多肽的性质和特点而变。
在初始生长阶段中细胞培养的温度主要基于可以保持细胞培养物存活的温度范围进行选择。例如，在初始生长阶段，cho细胞在37℃生长良好。一般，大多数哺乳动物细胞在大约25℃至42℃的范围内生长良好。优选地，哺乳动物细胞在大约35℃至40℃的范围内生长良好。根据细胞的需要和生产要求，本领域技术人员能够选择用于生长细胞的一个或多个合适温度。
在本发明的一个实施方案中，初始生长阶段的温度维持在一个恒定温度。在另一实施方案中，初始生长阶段的温度维持在一个温度范围内。例如，在初始生长阶段中可以稳定地增加或降低温度。备选地，可以在初始生长阶段中在不同时间使温度增加或降低离散量。本领域普通技术人员能够确定是否应当使用单个还是多个温度、以及是否应当稳定地还是通过离散量调节温度。
细胞可以在初始生长阶段中生长或多或少的时间。在一个变体方案中，细胞生长足以达到如下存活细胞密度的时间长度，所述存活细胞密度为最大存活细胞密度的给定百分数，其中最大存活细胞密度是在允许细胞不被干扰地生长的条件下细胞将最终达到的密度。例如，可以生长细胞足以达到期望的存活细胞密度的时间长度，所述期望的存活细胞密度为最大存活细胞密度的百分之1,5,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95或99。
在另一实施方案中，允许细胞生长规定的一段时间。例如，取决于细胞培养物的起始浓度、细胞生长的温度、和细胞固有的生长速率，可以生长细胞0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20或更多天。在一些情况下，可以允许细胞生长一个月或更长。
在初始培养阶段可以搅拌或摇动细胞培养物以增加氧合和营养物至细胞的扩散。根据本发明，本领域普通技术人员明了，在初始生长阶段中控制或调节某些生物反应器内部条件可能是有利的，包括但不限于ph、温度、氧合等。例如，ph可以通过提供合适量的酸或碱来控制，氧合可以通过本领域熟知的鼓泡装置(spargingdevice)控制。
初始培养步骤是生长阶段，其中可以修饰分批细胞培养条件以增强重组细胞的生长，产生种子罐(seedtrain)。生长阶段通常指指数生长期，在该指数生长期细胞通常快速分裂，例如生长。在该阶段中，细胞在对细胞生长而言最佳的条件下培养一段时间，通常1-4天，例如1、2、3或4天。可以通过本领域技术人员已知的方法，针对具体宿主细胞，确定宿主细胞的生长周期。
在生长阶段，可以按批模式向培养容器供给基础细胞培养基和细胞。在一方面，培养基含有少于大约5％或少于1％或少于0.1％血清和其它动物源蛋白。然而，如果期望的话，可以使用血清和动物源蛋白质。在一个特定变体方案中，基础培养基是cdm。可以使用一或两倍于欧洲专利ep307,247或美国专利号6,180,401中所述范围的氨基酸、维生素、痕量元素和其它培养基成分，这些文献特此完整并入作为参考。
备选地，商业可获得的培养基例如ham氏f10(sigma),最低必需培养基([mem],sigma),rpmi-1640(sigma),和dulbecco氏改良的eagle氏培养基([dmem],sigma)适于培养动物细胞，可以补充本文所述的化学确定的培养基成分(例如，通过使用本文提供的试剂盒)。此外，在ham和wallace,meth.enz.,58:44(1979),barnes和sato,anal.biochem.,102:255(1980),u.s.pat.nos.4,767,704；4,657,866；4,927,762；或4,560,655；wo90/03430；wo87/00195；u.s.pat.no.re.30,985；或u.s.pat.no.5,122,469(所有这些文献的公开均特此完整并入作为参考)中描述的任何培养基都可以用作宿主细胞的培养基，其每一种均可以补充本文所述的化学确定的培养基成分(例如，通过使用本文提供的试剂盒)。在一方面，如果培养基含有动物基产品，培养基可以补充cdm。
本文提供的任何培养基也可以按需补充激素和/或其它生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白、或表皮生长因子)、离子(例如钠、氯、钙、镁、和磷酸根)、缓冲液(例如hepes)、核苷(例如腺苷和胸苷)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的最终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等同能源。也可以以合适的浓度包括任何其它必需补充物，这将是本领域技术人员知道的。
在细胞生长的特定点，细胞可以形成接种物以在生产阶段于培养开始时接种培养基。备选地，生产阶段可以与生长阶段是连续的。多肽生产阶段一般接在细胞生长阶段后面。
在多肽生产阶段中，细胞培养物可以维持在利于细胞培养物存活和生存力并适于表达期望多肽的第二组培养条件(相对于生长阶段而言)下。例如，在后续的生产阶段，cho细胞在25℃至35℃的范围中良好地表达重组多肽和蛋白质。可以通过多个离散的温度迁移以增加细胞密度或生存力或增加重组多肽或蛋白质的表达。在一方面，相比于在不同培养基中生产多肽时获得的杂质，本文提供的培养基当用于增加多肽产量的方法中时可以减少杂质的存在。在一个变体方案中，杂质是电荷变体或活性氧。在一方面，相比于在不同培养基中生产多肽时获得颜色强度，本文提供的培养基当用于增加多肽产量的方法中时减少多肽产品的颜色强度。在一个变体方案中，增加多肽产量的方法包括在多肽生产阶段中温度迁移步骤。在进一步变体方案中，温度迁移步骤包括从31℃到37℃,从32℃到37℃,从33℃到37℃,从34℃到37℃,从35℃到37℃,从36℃到37℃,从31℃到32℃,从31℃到33℃,从31℃到34℃,从31℃到35℃或从31℃到36℃的温度迁移。
细胞可以维持在后续的生产阶段直到达到期望的细胞密度或产量滴度。在一个实施方案中，细胞维持在后续生产阶段直至重组多肽的滴度达到最大。在其它实施方案中，可以在该点之前收获培养物。例如，细胞可以维持足够长的时间以使存活细胞密度达到最大存活细胞密度的百分之1,5,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95或99。在一些情况下，可能期望的是，允许存活细胞密度达到最大，然后在收获培养物之前允许存活细胞密度下降到某个水平。
在某些情况下，可能有利或必需的是，在后续生产阶段向细胞培养物补充已被细胞耗竭或代谢掉的营养物或其它培养基成分。例如，可能有利的是，向细胞培养物补充在监测细胞培养物期间观察到已经耗竭的营养物或其它培养基成分。备选地或额外地，可能有益或必需的是，在后续生产阶段之前补充细胞培养物。作为非限制性例子，可能有益或必需的是，向细胞培养物补充激素和/或其它生长因子、特定离子(例如钠、氯、钙、镁和磷酸根)、缓冲液、维生素、核苷或核苷酸、痕量元素(通常以非常低的最终浓度存在的无机化合物)、氨基酸、脂质、或葡萄糖或其它能源。
多肽纯化
目的多肽优选作为分泌的多肽从培养基中回收，但当多肽无分泌信号而直接表达时也可以从宿主细胞裂解物中回收。在一方面，生产的多肽是抗体，例如单克隆抗体。
可以离心培养基或裂解物以除去颗粒细胞碎片。之后多肽可以从杂质可溶性蛋白质和多肽中纯化出来，下面的方案是适宜的纯化方案的例子：在免疫亲和柱或离子交换柱上分级分离；乙醇沉淀；反相hplc；在硅胶上或在阳离子交换树脂例如deae上层析；层析聚焦；sds-page；硫酸铵沉淀；使用例如sephadexg-75进行凝胶过滤；和蛋白asepharose柱以除去诸如igg等杂质。蛋白酶抑制剂例如苯甲基磺酰氟(pmsf)可以用于抑制纯化过程中的蛋白质水解降解。本领域技术人员明了，适于目的多肽的纯化方法可能需要修改以适应在重组细胞培养物中表达时多肽的特性变化。抗体通常可以使用层析技术(例如蛋白a、亲和层析加低ph洗脱步骤和离子交换层析以除去工艺杂质)纯化。纯化的蛋白质可以浓缩以提供浓缩的蛋白质药物产品，例如具有至少100mg/ml或125mg/ml或150mg/ml的蛋白质浓度、或大约100mg/ml或125mg/ml或150mg/ml浓度的产品。纯化的蛋白质也可以浓缩以提供浓缩的蛋白质药物产品，例如具有至少1mg/ml或10mg/ml或25mg/ml或50mg/ml或75mg/ml的蛋白质浓度、或至少大约1mg/ml或10mg/ml或50mg/ml或75mg/ml之任一至大约125mg/ml或至大约150mg/ml的浓度的产品。可以理解，浓缩的多肽产品可以浓缩达到在浓缩条件下允许的水平，例如达到多肽在溶液中不再可溶的浓度。例如，多肽纯化方法可以包括步骤：从多肽生产细胞收获细胞培养液，通过蛋白a亲和层析纯化多肽，通过阴离子和阳离子交换层析进一步纯化，过滤除去病毒，和最后的超滤和渗滤步骤用于多肽的最终配制和浓度。生产和纯化多肽用于药物配制的方法的非限制实例描述于kelley,b.mabs.,2009,1(5):443-452，该文献特此完整地并入此处作为参考。
多肽颜色评价
通过本文所述方法生产的和存在于本文提供的组合物中的多肽可以在蛋白质纯化方法的任何步骤进行颜色评价。用于评价颜色的方法可以涉及：从生长在本文所述培养基中的细胞收获细胞培养液，从细胞培养液纯化多肽以获得包含多肽的组合物(例如溶液)，评价包含多肽的溶液的颜色。在一个变体方案中，在使用蛋白a亲和层析纯化后，评价包含多肽的组合物的颜色。在一个进一步变体方案中，在通过离子交换层析纯化后，评价包含多肽的组合物的颜色。在另一变体方案中，在通过高效液相色谱纯化后，评价包含多肽的组合物的颜色。在再一变体方案中，通过疏水相互作用层析纯化后，评价包含多肽的组合物的颜色。在再一变体方案中，通过大小排阻层析纯化后，评价包含多肽的组合物的颜色。在一个变体方案中，通过过滤(包括微滤或超滤)纯化后，评价包含多肽的组合物的颜色。在一个变体方案中，在评价颜色之前，浓缩包含多肽的组合物(例如，组合物可以包含至少100mg/ml,125mg/ml或150mg/ml多肽，例如抗体)。在一些变体方案中，在评价颜色之前，浓缩的组合物包含至少1mg/ml,25mg/ml,50mg/ml或75mg/ml多肽(例如抗体)。包含多肽的组合物可以通过离心、过滤装置、半透膜、透析、沉淀、离子交换层析、亲和层析、高效液相色谱、或疏水相互作用层析进行浓缩。在一个变体方案中，在评价颜色之前，多肽可以通过冻干和重悬进行浓缩。可以在使用本文所述一种或多种技术进行纯化后，对包含多肽的组合物进行颜色评价。本文考虑，在包含多肽的组合物经历一个或多个冻融循环后，进行组合物的颜色评价。本文还考虑，在纯化或浓缩多肽之前对包含多肽的细胞培养液进行颜色评价的方法。
使用本文所述培养基通过本文所述方法产生(或存在于本文提供的组合物中)的多肽可以使用一种或多种目视颜色标准进行颜色评价。用于包含多肽的组合物的颜色评价的方法包括使用国际或国内颜色标准，例如，但不限于，美国药典颜色标准和欧洲药典颜色标准。参见usp-24专论631colorandachromaticity.unitedstatespharmacopoeiainc.,2000,p.1926-1927和councilofeurope.europeanpharmacopoeia,2008,第7版，p.22,这些文献特此完整地并入此处作为参考。例如，可以使用颜色、乳光和着色(coc)试验评价包含多肽的溶液的颜色。在一个变体方案中，使用相同的12mm外径的无色透明中性玻璃管，比较2.0ml含多肽的组合物和2.0ml水或溶剂或专论中规定的参考溶液。在漫射日光中比较颜色，相对于白背景水平地观察以进行颜色确定、测量或评价。在另一变体方案中，使用相同的内径15mm至25mm的平底无色透明中性玻璃管，比较含多肽的组合物与水或溶剂或专论规定的参考溶液，其中层深度为40mm。在漫射日光中比较颜色，相对于白背景垂直观察用于颜色确定、测量或评价。在一个变体方案中，可以通过人目视观察，进行颜色确定、测量或评价。在另一变体方案中，可以使用自动化方法，进行颜色确定、测量或评价。例如，可以将管加载到机器中，机器对管进行成像，以便使用算法对图像进行处理以确定、测量或评价颜色。可以理解，coc试验的参考标准可以是，但不限于，棕色(b)、棕黄色(by)、黄色(y)、绿黄色(gy)或红色(r)中的任一个。与棕色参考标准比较的含多肽的组合物可以被给予b1(最深),b2,b3,b4,b5,b6,b7,b8或b9(最浅)的棕色参考标准值。与棕黄色参考标准比较的含多肽的组合物可以被给予by1(最深),by2,by3,by4,by5,by6或by7(最浅)的棕黄色参考标准值。与黄色参考标准比较的含多肽的组合物可以被给予y1(最深),y2,y3,y4,y5,y6或y7(最浅)的黄色参考标准值。与绿黄色参考标准比较的含多肽的组合物可以被给予gy1(最深),gy2,gy3,gy4,gy5,gy6或gy7(最浅)的绿黄色参考标准值。与红色参考标准比较的含多肽的组合物可以被给予r1(最深),r2,r3,r4,r5,r6或r7(最浅)的红色参考标准值。在一方面，可接受的颜色可以是除了在本文所给级别上测量为最深的颜色外的任何颜色(例如，对于红色参考标准值，除了r1)。在一个变体方案中，包含由培养在本文所述培养基中的细胞产生的多肽的组合物的颜色具有表2所述的参考标准值。如本文所述，可以理解，在一方面，可以用于本文方法和组合物中的培养基导致多肽组合物(其在一个变体方案中是包含至少100mg/ml或125mg/ml或150mg/ml多肽的组合物)，所述组合物具有选自如下的参考标准颜色值：b3,b4,b5,b6,b7,b8,b9,by3,by4,by5,by6,by7,y3,y4,y5,y6,y7,gy3,gy4,gy5,gy6,gy7,r3,r4,r5,r6和r7。在一方面，可以用于本文方法和组合物中的培养基导致多肽组合物(其在一个变体方案中是包含至少100mg/ml或125mg/ml或150mg/ml多肽的组合物)，所述组合物具有大于b4,b5,b6,b7,b8,by4,by5,by6,y4,y5,y6,gy4,gy5,gy6,gy7,r3,r4,r5和r6中任一个的参考标准颜色值。本领域技术人员明了，参考标准颜色值的描述适用于本文所述任何培养基、方法或组合物，并且可以进一步修饰对本文所述任何培养基、方法或组合物的描述。
表2.示例性参考标准值
在另一实例中，使用本文描述的培养基通过本文描述的方法产生的(或存在于本文提供的组合物中的)多肽可以使用定量试验进行颜色评价。在一个变体方案中，可以使用自动化方法进行定量试验。在一个变体方案中，定量试验是本文所述的标化荧光强度(normalizedfluoresceneintensity,nifty)试验或总颜色试验(totalcolorassy)。例如，可以通过nifty试验，对含有通过本文所述任何方法产生的多肽的溶液进行颜色强度评价，其中对含多肽的溶液实施如下步骤：1)对肽测试样品进行大小排阻层析(sec)，其中sec的流动相包含特定ph的缓冲液，柱子维持在特定温度；2)监测sec洗脱物在特定波长(例如280nm)的uv吸收以及在特定激发波长(例如350nm)和发射波长(例如425nm)下的荧光；3)使用本领域已知的软件(例如agilentchemstation软件)，在uv吸收和荧光发射色谱图上对sec的多肽峰进行积分，并通过主峰的荧光峰面积除以主峰的uv吸收峰面积，标化荧光；和4)计算多肽测试样品的标化荧光与多肽参考样品的标化荧光的比值，其中所述多肽参考样品包含基于本文所公开的参考标准之任一(例如棕色(b)、棕黄色(by)、黄色(y)、绿黄色(gy)、或红色(r))，的已知coc值，从而获得数值，其中较高的数值(例如较高的nifty值)指示较高的颜色强度，较低的数值(例如较低的nifty值)指示较低的颜色强度。在另一实例中，通过本文描述的总颜色试验，对包含通过本文所述任何方法产生的多肽的溶液进行颜色强度评价。例如，可以通过总颜色试验，对包含通过本文所述任何方法产生的多肽的溶液进行颜色强度评价，其中对包含多肽的溶液实施如下步骤：1)使用分光光度计在可见区(380-780nm)中测量样品，获得多肽测试样品的吸收光谱；2)按照standardpracticeforcalculationofcolortolerancesandcolordifferencesfrominstrumentallymeasuredcolorcoordinates,annualbookofastmstandards,vol.06.01,(2011)所述，将吸收光谱转换为ciel*a*b*色标度；3)获得总颜色测量值，其中测量值代表δe，其相应于在三维ciel*a*b*颜色空间中多肽测试样品与水之间的欧几里德距离；和4)通过计算多肽测试样品的“总颜色”测量值与多肽参考样品的“总颜色"测量值的比值，确定颜色强度值，其中所述多肽参考样品含有基于本文所公开参考标准之任一(例如棕色(b)、棕黄色(by)、黄色(y)、绿黄色(gy)、或红色(r))的已知coc值，其中较高的总颜色值指示较高的颜色强度，较低的总颜色值指示较低的颜色强度。
本文所述的颜色试验可以用于评价任何溶液(例如，含多肽的溶液)的颜色，包括但不限于，本文提供的多肽组合物的颜色。
多肽电荷变体评价
本发明提供减少电荷变体(例如酸性电荷变体)存在的方法，其中与在不同培养基(例如含有与本文所述不同的成分和/或成分浓度的培养基)中生产多肽时获得的电荷变体(例如酸性电荷变体)相比，包含本文所述浓度的成分的培养基当用于多肽生产方法中时，减少电荷变体(例如酸性电荷变体)的存在。本领域技术人员明了，对参考电荷变体的描述适用于本文所述的任何培养基、方法或组合物，并且可以进一步修饰对本文所述任何培养基、方法或组合物的描述。也可以理解，在本章节中提供的培养基的任何变体方案或实施方案同样适用于全文中对培养基的描述。在此，术语”减少电荷变体的存在”可以指减少任何类型的电荷变体(例如酸性电荷变体、碱性电荷变体、和中性电荷变体)的量或存在、或减少特定电荷变体例如酸性电荷变体的量或存在。
本发明提供减少电荷变体(例如酸性电荷变体)存在的方法，还提供包含减少水平的电荷变体(例如酸性电荷变体)的组合物，其中，与在不同培养基中生产多肽时获得的电荷变体相比，本文所述培养基当用于生产多肽的方法中时减少电荷变体的存在。在一个变体方案中，培养基是化学不确定的细胞培养基，其包含从大约300mg/l(在一些实施方案中,200mg/l)至大约1200mg/l胱氨酸,从大约0.05mg/l至大约1.0mg/l维生素b2,从大约0.05mg/l至大约10.0mg/l维生素b6,从大约0.05mg/l至大约12.0mg/l维生素b9和从大约0.05mg/l至大约2.5mg/l维生素b12。在一个变体方案中,维生素b2的浓度为从大约0.05mg/l至大约0.50mg/l。在另一变体方案中,维生素b2的浓度为从大约0.05mg/l至大约0.40mg/l。在另一变体方案中,维生素b2的浓度为从大约0.05mg/l至大约0.30mg/l。在一个变体方案中,维生素b6的浓度为从大约0.05mg/l至大约8.0mg/l。在另一变体方案中,维生素b6的浓度为从大约0.05mg/l至大约7.0mg/l。在另一变体方案中,维生素b6的浓度为从大约0.05mg/l至大约6.0mg/l。在一个变体方案中，化学不确定的细胞培养基进一步包含铁源。在一个变体方案中，铁源是柠檬酸铁或硫酸亚铁。在一个变体方案中，化学不确定的细胞培养基包含浓度从大约2μm至大约80μm的柠檬酸铁。在本文任何变体方案中，化学不确定的细胞培养基还可以包含氢化可的松。在一个变体方案中，氢化可的松的浓度为从大约0.05μm至大约0.25μm。
本发明提供减少电荷变体(例如酸性电荷变体)存在的方法，本发明还提供包含降低水平的电荷变体(例如酸性电荷变体)的组合物，其中与在不同培养基中生产多肽时获得的电荷变体相比，本文所述培养基当用于多肽生产方法中时降低电荷变体的存在。在一个变体方案中，培养基是化学确定的细胞培养基，包含从大约300mg/l(在一些实施方案中,200mg/l)至大约1200mg/l胱氨酸,从大约2μm至大约80μm柠檬酸铁和从大约0.05μm至大约0.5μm氢化可的松。在一个变体方案中，化学确定的培养基还包含维生素b2,维生素b6,维生素b9和维生素b12。在一个变体方案中，维生素b2的浓度为从大约0.05mg/l至大约1.0mg/l。在另一变体方案中,维生素b2的浓度为从大约0.05mg/l至大约0.50mg/l。在另一变体方案中,维生素b2的浓度为从大约0.05mg/l至大约0.40mg/l。在另一变体方案中,维生素b2的浓度为从大约0.05mg/l至大约0.30mg/l。在再一变体方案中，维生素b6的浓度为从大约0.05mg/l至大约10.0mg/l。在再一变体方案中,维生素b6的浓度为从大约0.05mg/l至大约8.0mg/l。在再一变体方案中,维生素b6的浓度为从大约0.05mg/l至大约7.0mg/l。在再一变体方案中,维生素b6的浓度为从大约0.05mg/l至大约6.0mg/l。在本文任何变体方案中，维生素b6的浓度为从大约0.05mg/l至大约10.0mg/l,从大约0.05mg/l至大约8.0mg/l,从大约0.05mg/l至大约7.0mg/l或从大约0.05mg/l至大约6.0mg/l。在再一变体方案中，维生素b9的浓度为从大约0.05mg/l至大约12.0mg/l。在本文所述任何变体方案中，维生素b9的浓度为从大约0.05mg/l至大约12.0mg/l。在再一变体方案中，维生素b12的浓度为从大约0.05mg/l至大约2.5mg/l。在本文所述任何变体方案中，维生素b12的浓度为从大约0.05mg/l至大约2.5mg/l。
本发明提供减少电荷变体(例如酸性电荷变体)存在的方法，本发明还提供包含降低水平的电荷变体(例如酸性电荷变体)的组合物，其中与在不同培养基中生产多肽时获得的电荷变体相比，本文所述培养基当用于多肽生产方法中时降低电荷变体的存在。在一个变体方案中，培养基是化学不确定的细胞培养基，包含从大约300mg/l(在一些实施方案中,200mg/l)至大约1200mg/l胱氨酸,从大约2μm至大约80μm柠檬酸铁和从大约0.05μm至大约0.5μm氢化可的松。在一个变体方案中,化学不确定的培养基还包含维生素b2,维生素b6,维生素b9和维生素b12。在一个变体方案中，维生素b2的浓度为从大约0.05mg/l至大约1.0mg/l。在另一变体方案中,维生素b2的浓度为从大约0.05mg/l至大约0.50mg/l。在另一变体方案中,维生素b2的浓度为从大约0.05mg/l至大约0.40mg/l。在另一变体方案中,维生素b2的浓度为从大约0.05mg/l至大约0.30mg/l。在再一变体方案中，维生素b6的浓度为从大约0.05mg/l至大约10.0mg/l。在再一变体方案中,维生素b6的浓度为从大约0.05mg/l至大约8.0mg/l。在再一变体方案中,维生素b6的浓度为从大约0.05mg/l至大约7.0mg/l。在再一变体方案中,维生素b6的浓度为从大约0.05mg/l至大约6.0mg/l。在本文所述任何变体方案中，维生素b6的浓度为从大约0.05mg/l至大约10.0mg/l,从大约0.05mg/l至大约8.0mg/l,从大约0.05mg/l至大约7.0mg/l或从大约0.05mg/l至大约6.0mg/l。在本文所述任何变体方案中，维生素b6的浓度为从大约0.05mg/l至大约10.0mg/l。在再一变体方案中，维生素b9的浓度为从大约0.05mg/l至大约12.0mg/l。在本文所述任何变体方案中，维生素b9的浓度为从大约0.05mg/l至大约12.0mg/l。在再一变体方案中，维生素b12的浓度为从大约0.05mg/l至大约2.5mg/l。在本文所述任何变体方案中，维生素b12的浓度为从大约0.05mg/l至大约2.5mg/l。
通过本文所述方法生产的多肽(包括包含多肽的组合物)可以在蛋白质纯化过程的任何步骤进行电荷变体存在的评价。用于评价电荷变体存在的方法可以涉及：从生长在本文所述培养基中的细胞收获细胞培养液；从细胞培养液纯化多肽以获得包含多肽的组合物；评价所述包含多肽的组合物，与包含在不同培养基中生产的多肽的组合物中的电荷变体存在相比，是否具有降低的电荷变体存在。在一个变体方案中，包含多肽的组合物可以含有酸性电荷变体或碱性电荷变体。在另一变体方案中，包含多肽的组合物包含酸性电荷变体。电荷变体的形成原因可以是，但不限于，脱酰胺化、唾液酸化、c端赖氨酸切割、糖化、c端赖氨酸酰胺化、c端甘氨酸酰胺化、琥珀酰胺形成、氨基酸氧化、唾液酸的去除、或其组合。本发明还考虑在纯化或浓缩多肽之前评价含多肽的细胞培养液中电荷变体存在的方法。在含多肽的溶液中检测电荷变体的方法包括：使用层析技术，例如但不限于，离子交换层析。参见khawli,l.a.,mabs.,2010,2(6):613-624，该文献特此完整并入此处作为参考。
在本文提供的组合物的一个变体方案中，电荷变体(其在一个方面是酸性电荷变体)占多肽产品的不到25％或20％或18％或15％或10％。在本文提供的组合物和方法的另一变体方案中，多肽产品中的至少75％或80％或85％或90％或95％或更多是主要种类蛋白质。在本文中，术语“主要种类蛋白质”可以进一步包括通过蛋白质的氨基酸序列、二级结构、和/或三级结构、以及任何翻译后修饰例如糖基化鉴定的、数量上占优势的蛋白质。
试剂盒
本发明描述用于向细胞培养基补充化学确定的组分的试剂盒。试剂盒可以含有待重构的干组分，也可以含有使用说明书(例如用于向培养基补充试剂盒组分)。试剂盒可以以适宜补充细胞培养基的量含有本文提供的培养基组分。在一个变体方案中，试剂盒包含表1的培养基成分。在另一变体方案中，试剂盒包含表1a的培养基成分。在“示例性实施方案”章节中提供各种示例性试剂盒实施方案。此外，本发明还包括这样的变体方案，其中用于补充细胞培养基的试剂盒包含一定量的表1或表1a的任何一种或多种培养基成分，其中所述量可以在细胞培养基中提供表1或表1a所示浓度的该一种或多种培养基成分。在一个变体方案中，用于补充细胞培养基的试剂盒包含：胱氨酸，其量可以在细胞培养基中提供大约0.8mm(一方面,0.7mm)至大约2.5mm胱氨酸；维生素b2，其量可以在细胞培养基中提供从大约0.11μm至大约0.72μm维生素b2；维生素b6，其量可以在细胞培养基中提供从大约4.5μm至大约30.0μm维生素b6；维生素b9，其量可以在细胞培养基中提供从大约3.4μm至大约22.0μm维生素b9；和维生素b12，其量可以在细胞培养基中提供从大约0.2μm至大约1.5μm维生素b12。在本文任何变体方案中，试剂盒可以还包含铁源，例如柠檬酸铁或硫酸亚铁，其量可以在细胞培养基中提供大约2μm至大约80μm(在一些方面,11.0μm至大约36.0μm)的铁源。
在另一变体方案，用于补充细胞培养基的试剂盒包含：胱氨酸，其量可以在细胞培养基中提供从大约0.8mm(在一些方面,0.7mm)至大约2.5mm胱氨酸；柠檬酸铁,其量可以在细胞培养基中提供从大约2μm至大约80μm柠檬酸铁；氢化可的松，其量可以在细胞培养基中提供从大约0.05μm至大约0.5μm氢化可的松；维生素b2，其量可以在细胞培养基中提供从大约0.11μm至大约0.72μm维生素b2；维生素b6，其量可以在细胞培养基中提供从大约4.5μm至大约30.0μm维生素b6；维生素b9，其量可以在细胞培养基中提供从大约3.4μm至大约22.0μm维生素b9；和维生素b12，其量可以在细胞培养基中提供从大约0.2μm至大约1.5μm维生素b12。
在本文的任何变体方案中，试剂盒可以进一步包含如下之任一或多种：维生素b1，其量可以在细胞培养基中提供从大约2.0μm至大约14.0μm维生素b1；维生素b3，其量可以在细胞培养基中提供从大约11.0μm至大约72.0μm维生素b3；维生素b5，其量可以在细胞培养基中提供从大约6.8μm至大约44.0μm维生素b5；和维生素b7，其量可以在细胞培养基中提供从大约0.02μm至大约0.24μm维生素b7。
在本文任何变体方案中，试剂盒可以进一步包含半胱氨酸，其量可以在细胞培养基中提供大约80mg/l至大约1500mg/l半胱氨酸(在一些方面，0.5mm至大约2.0mm)。
在本文任何变体方案中，细胞培养基可以是cdm或化学不确定的细胞培养基。
组合物
本发明还提供组合物，所述组合物包含细胞培养基和一种或多种其它成分，例如细胞或期望的多肽(例如抗体)。在一个变体方案中，提供组合物，所述组合物包含：(a)包含编码多肽的分离核酸的细胞；和(b)本文提供的细胞培养基。在另一变体方案中，提供组合物，所述组合物包含:(a)多肽；和(b)本文提供的细胞培养基，其中一方面所述多肽由包含编码多肽的分离核酸的细胞分泌至培养基中。在另一变体方案中，提供组合物，所述组合物包含:(a)多肽；和(b)本文提供的细胞培养基，其中通过裂解包含编码多肽的分离核酸的细胞，将多肽释放至培养基。组合物的细胞可以是任何本文所述细胞(例如cho细胞)，组合物的培养基可以是任何本文所述培养基，例如包含表1或表1a所述培养基成分的培养基(其可以是cdm)。同样地，组合物的多肽可以是任何本文所述多肽，例如抗体。
在一个变体方案中，组合物可以具有颜色。在一个变体方案中，通过使用一种或多种可视颜色标准，确定、测量或评价颜色。可视颜色标准可以是国际或国内颜色标准，例如，但不限于，美国药典颜色标准和欧洲药典颜色标准。参见usp-24专论631colorandachromaticity.unitedstatespharmacopoeiainc.,2000,p.1926-1927和councilofeurope.europeanpharmacopoeia,2008,第7版，p.22,这些文献特此完整地并入此处作为参考。例如，可以使用颜色、乳光和着色(coc)试验，确定、测量或评价组合物的颜色。可以理解，coc试验的参考标准可以是，但不限于，棕色(b)、棕黄色(by)、黄色(y)、绿黄色(gy)或红色(r)中的任一个。与棕色参考标准比较的含多肽的组合物可以被给予b1(最深),b2,b3,b4,b5,b6,b7,b8或b9(最浅)的棕色参考标准值。与棕黄色参考标准比较的含多肽的组合物可以被给予by1(最深),by2,by3,by4,by5,by6或by7(最浅)的棕黄色参考标准值。与黄色参考标准比较的含多肽的组合物可以被给予y1(最深),y2,y3,y4,y5,y6或y7(最浅)的黄色参考标准值。与绿黄色参考标准比较的含多肽的组合物可以被给予gy1(最深),gy2,gy3,gy4,gy5,gy6或gy7(最浅)的绿黄色参考标准值。与红色参考标准比较的含多肽的组合物可以被给予r1(最深),r2,r3,r4,r5,r6或r7(最浅)的红色参考标准值。本文所述组合物可以具有表2所述的或全文中所述的参考标准值。在一个特定变体方案中，本文提供的组合物包含至少100mg/ml或125mg/ml或150mg/ml浓度、或大约100mg/ml或125mg/ml或150mg/ml或175mg/ml或200mg/ml浓度的多肽。在另一变体方案中，本文提供的组合物包含至少1mg/ml或10mg/ml或25mg/ml或50mg/ml或75mg/ml浓度、或大约1mg/ml或10mg/ml或25mg/ml或50mg/ml或75mg/ml浓度的多肽。在另一变体方案中，本文提供的组合物包含至少大约1mg/ml或10mg/ml或50mg/ml或75mg/ml中的任一至大约125mg/ml或至大约150mg/ml浓度的多肽。本文提供的任何组合物都可以以高达多肽的溶解限的浓度，或以当施用给个体时可以提供治疗有效量的多肽的浓度，包含多肽。本文中，“治疗有效量”的多肽(例如抗体)指，对于多肽可以有效治疗的病症而言，对于预防或治疗该病症有效的量。在再一变体方案中，本文提供的组合物具有选自b4-b9,by4-by7,y4-y7,gy4-gy7和r4-r7中任一的颜色参考标准值。本发明还提供包含至少100mg/ml或125mg/ml或150mg/ml浓度、或大约100mg/ml或125mg/ml或150mg/ml或175mg/ml或200mg/ml浓度的多肽的组合物，其中组合物具有选自b4-b9,by4-by7,y4-y7,gy4-gy7和r4-r7中任一的颜色参考标准值。本文还提供包含至少1mg/ml或10mg/ml或25mg/ml或50mg/ml或75mg/ml浓度、或大约1mg/ml或10mg/ml或25mg/ml或50mg/ml或75mg/ml浓度、或至少大约1mg/ml或10mg/ml或50mg/ml或75mg/ml中的任一至大约125mg/ml或至大约150mg/ml浓度的多肽的组合物，其中组合物具有选自b4-b9,by4-by7,y4-y7,gy4-gy7和r4-r7中任一的颜色参考标准值。
在另一例子中，组合物的颜色可以通过使用定量试验例如nifty试验或总颜色试验确定、测量或评价。在一个变体方案中，通过定量试验获得的较高数值指示较高的颜色强度，较低的数值指示较低的颜色强度。
通过本文所述任何方法产生的多肽(例如抗体)的组合物(例如药物制剂)可以通过将具有期望纯度的多肽与一种或多种可选的可药用载体(remington'spharmaceuticalsciences16thedition,osol,a.ed.(1980))混合，配制为冻干制剂或水溶液的形式。可药用载体通常在所用剂量和浓度下对接受者是无毒的，其包括但不限于：缓冲液例如磷酸盐、柠檬酸盐、和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于大约10个残基)多肽；蛋白质例如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖、和其它糖类，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂例如edta；糖例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子例如钠；金属络合物(例如zn-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂例如聚乙二醇(peg)。本文中示例性可药用载体还包括间质药物分散剂例如可溶性中性-活性透明质酸酶糖蛋白(shasegp)，例如人可溶性ph-20透明质酸酶糖蛋白，例如rhuph20(
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示例性实施方案
1.培养细胞的方法,包括步骤：使细胞与细胞培养基接触，所述细胞培养基包含:
从大约200mg/l至大约1200mg/l胱氨酸；
从大约0.05mg/l至大约1.0mg/l维生素b2；
从大约0.05mg/l至大约10.0mg/l维生素b6；
从大约0.05mg/l至大约12.0mg/l维生素b9；和
从大约0.05mg/l至大约2.5mg/l维生素b12。
2.实施方案1的方法,包括步骤：使细胞与细胞培养基接触，所述细胞培养基包含:
从大约0.7mm至大约2.5mm胱氨酸；
从大约0.11μm至大约0.72μm维生素b2；
从大约4.5μm至大约30.0μm维生素b6；
从大约3.4μm至大约22.0μm维生素b9；和
从大约0.2μm至大约1.5μm维生素b12。
3.实施方案1或2的方法,其中细胞培养基还包含维生素b1,维生素b3,维生素b5和维生素b7中的任一或多种。
4.实施方案3的方法,其中细胞培养基还包含以下之任一或多种:
从大约2.0μm至大约14.0μm维生素b1；
从大约11.0μm至大约72.0μm维生素b3；
从大约6.8μm至大约44.0μm维生素b5；和
从大约0.02μm至大约0.14μm维生素b7。
5.实施方案1-4之任一的方法,其中细胞培养基还包含铁源。
6.实施方案5的方法,其中铁源是柠檬酸铁或硫酸亚铁。
7.实施方案1-6之任一的方法,其中细胞培养基包含从大约2μm至大约80μm浓度的柠檬酸铁。
8.实施方案1-7之任一的方法,其中细胞培养基包含从大约11.0μm至大约36.0μm浓度的柠檬酸铁。
9.实施方案1-8之任一的方法,其中细胞培养基还包含氢化可的松。
10.实施方案9的方法,其中氢化可的松在细胞培养基中的浓度为从大约0.05μm至大约0.25μm。
11.实施方案1-10之任一的方法,其中细胞培养基是化学确定的细胞培养基。
12.实施方案1-10之任一的方法,其中细胞培养基是化学不确定的细胞培养基。
13.实施方案1-12之任一的方法,其中使细胞在细胞生长阶段与所述细胞培养基接触。
14.实施方案1-13之任一的方法,其中使细胞在细胞生产阶段与所述细胞培养基接触。
15.实施方案14的方法,其中所述方法还包含步骤：向细胞培养基添加半胱氨酸。
16.实施方案15的方法,其中半胱氨酸以在细胞培养基中提供从大约80mg/l至大约1500mg/l半胱氨酸的量添加。
17.实施方案15的方法,其中半胱氨酸以在细胞培养基中提供大约1500mg/l半胱氨酸的量添加。
18.实施方案15的方法,其中半胱氨酸以在细胞培养基中提供大约140mg/l半胱氨酸的量添加。
19.生产多肽的方法，包括步骤：在细胞培养基中培养包含编码多肽的分离核酸的细胞，其中:
(a)细胞培养基包含:
从大约200mg/l至大约1200mg/l胱氨酸；
从大约0.05mg/l至大约1.0mg/l维生素b2；
从大约0.05mg/l至大约10.0mg/l维生素b6；
从大约0.05mg/l至大约12.0mg/l维生素b9；
从大约0.05mg/l至大约2.5mg/l维生素b12；和
(b)细胞表达多肽。
20.实施方案19的方法,其中细胞培养基包含:
从大约0.7mm至大约2.5mm胱氨酸；
从大约0.11μm至大约0.72μm维生素b2；
从大约4.5μm至大约30.0μm维生素b6；
从大约3.4μm至大约22.0μm维生素b9；和
从大约0.2μm至大约1.5μm维生素b12。
21.实施方案19或20的方法,其中细胞培养基还包含维生素b1,维生素b3,维生素b5和维生素b7中的任一或多种。
22.实施方案21的方法,其中细胞培养基还包含以下之任一或多种:
从大约2.0μm至大约14.0μm维生素b1；
从大约11.0μm至大约72.0μm维生素b3；
从大约6.8μm至大约44.0μm维生素b5；和
从大约0.02μm至大约0.14μm维生素b7。
23.实施方案19-22之任一的方法,其中细胞培养基还包含铁源。
24.实施方案23的方法,其中铁源是柠檬酸铁或硫酸亚铁。
25.实施方案19-24之任一的方法,其中细胞培养基包含从大约2μm至大约80μm浓度的柠檬酸铁。
26.实施方案19-25之任一的方法,其中细胞培养基包含从大约11.0μm至大约36.0μm浓度的柠檬酸铁。
27.实施方案19-26之任一的方法,其中细胞培养基还包含氢化可的松。
28.实施方案27的方法,其中氢化可的松在细胞培养基中的浓度是从大约0.05μm至大约0.25μm。
29.实施方案19-28之任一的方法,其中细胞培养基是化学确定的细胞培养基。
30.实施方案19-28之任一的方法,其中细胞培养基是化学不确定的细胞培养基。
31.实施方案19-30之任一的方法,其中所述培养在细胞生长阶段进行。
32.实施方案19-31之任一的方法,其中所述培养在细胞生产阶段进行。
33.实施方案32的方法,其中所述方法还包含步骤：向细胞培养基添加半胱氨酸。
34.实施方案33的方法,其中半胱氨酸以在细胞培养基中提供从大约80mg/l至大约1500mg/l半胱氨酸的量添加。
35.实施方案33的方法,其中半胱氨酸以在细胞培养基中提供大约1500mg/l半胱氨酸的量添加。
36.实施方案33的方法,其中半胱氨酸以在细胞培养基中提供大约140mg/l半胱氨酸的量添加。
37.实施方案19-36之任一的方法,其中多肽是抗体。
38.实施方案37的方法,其中抗体是igg1抗体。
39.实施方案37或38的方法,其中抗体是抗vegf,抗间皮素(anti-mesothelin),抗pcsk9或抗β7抗体。
40.实施方案19-39之任一的方法,还包括步骤：从细胞培养基分离多肽。
41.实施方案40的方法,其中包含分离多肽的组合物呈现为无色或带轻微颜色的液体。
42.实施方案41的方法,其中组合物包含浓度至少100mg/ml的分离的多肽。
43.通过实施方案19-42之任一的方法产生的多肽。
44.包含实施方案43的多肽和可药用载体的药物组合物。
45.用于向细胞培养基补充化学确定的组分的试剂盒，所述试剂盒包含：
胱氨酸，其量在细胞培养基中提供从大约200mg/l至大约1200mg/l胱氨酸；
维生素b2，其量在细胞培养基中提供从大约0.05mg/l至大约1.0mg/l维生素b2；
维生素b6，其量在细胞培养基中提供从大约0.05mg/l至大约10.0mg/l维生素b6；
维生素b9，其量在细胞培养基中提供从大约0.05mg/l至大约12.0mg/l维生素b9；和
维生素b12，其量在细胞培养基中提供从大约0.05mg/l至大约2.5mg/l维生素b12。
46.实施方案45的试剂盒,试剂盒包含:
胱氨酸,其量在细胞培养基中提供从大约0.7mm至大约2.5mm胱氨酸；
维生素b2,其量在细胞培养基中提供从大约0.11μm至大约0.72μm维生素b2；
维生素b6，其量在细胞培养基中提供从大约4.5μm至大约30.0μm维生素b6；
维生素b9，其量在细胞培养基中提供从大约3.4μm至大约22.0μm维生素b9；和
维生素b12，其量在细胞培养基中提供从大约0.2μm至大约1.5μm维生素b12。
47.实施方案45或46的试剂盒,其中试剂盒还包含维生素b1,维生素b3,维生素b5和维生素b7中的任一或多种。
48.实施方案47的试剂盒,其中试剂盒还包含以下之任一或多种:
维生素b1,其量在细胞培养基中提供从大约2.0μm至大约14.0μm维生素b1；
维生素b3，其量在细胞培养基中提供从大约11.0μm至大约72.0μm维生素b3；
维生素b5，其量在细胞培养基中提供从大约6.8μm至大约44.0μm维生素b5；和
维生素b7，其量在细胞培养基中提供从大约0.02μm至大约0.14μm维生素b7。
49.实施方案45-48之任一的试剂盒,其中试剂盒还包含铁源。
50.实施方案49的试剂盒,其中铁源是柠檬酸铁或硫酸亚铁。
51.实施方案45-50之任一的试剂盒,其中试剂盒还包含氢化可的松。
52.细胞培养基，包含:
从大约200mg/l至大约1200mg/l胱氨酸；
从大约0.05mg/l至大约1.0mg/l维生素b2；
从大约0.05mg/l至大约10.0mg/l维生素b6；
从大约0.05mg/l至大约12.0mg/l维生素b9；和
从大约0.05mg/l至大约2.5mg/l维生素b12。
53.实施方案52的培养基,包含:
从大约0.7mm至大约2.5mm胱氨酸；
从大约0.11μm至大约0.72μm维生素b2；
从大约4.5μm至大约30.0μm维生素b6；
从大约3.4μm至大约22.0μm维生素b9；和
从大约0.2μm至大约1.5μm维生素b12。
54.实施方案52或53的培养基,还包含维生素b1,维生素b3,维生素b5和维生素b7中的任一或多种。
55.实施方案54的培养基,还包含以下之任一或多种:
从大约2.0μm至大约14.0μm维生素b1；
从大约11.0μm至大约72.0μm维生素b3；
从大约6.8μm至大约44.0μm维生素b5；和
从大约0.02μm至大约0.14μm维生素b7。
56.实施方案52-55之任一的培养基,其中细胞培养基还包含铁源。
57.实施方案56的培养基,其中铁源是柠檬酸铁或硫酸亚铁。
58.实施方案57的培养基,其中细胞培养基包含从大约2μm至大约80μm浓度的柠檬酸铁。
59.实施方案58的培养基,其中细胞培养基包含从大约11.0μm至大约36.0μm浓度的柠檬酸铁。
60.实施方案52-59之任一的培养基,其中细胞培养基还包含氢化可的松。
61.实施方案60的培养基,其中细胞培养基包含从大约0.05μm至大约0.25μm浓度的氢化可的松。
62.培养细胞的方法,包括步骤：使细胞与细胞培养基接触，所述细胞培养基包含:
从大约200mg/l至大约1200mg/l胱氨酸；
从大约2μm至大约80μm柠檬酸铁；和
从大约0.05μm至大约0.5μm氢化可的松。
63.实施方案62的方法,其中细胞培养基还包含维生素b2,维生素b6,维生素b9和/或维生素b12。
64.实施方案62或63的方法,其中细胞培养基包含从大约0.05mg/l至大约1.0mg/l维生素b2。
65.实施方案62-64之任一的方法,其中细胞培养基包含从大约0.05mg/l至大约10.0mg/l维生素b6。
66.实施方案62-65之任一的方法,其中细胞培养基包含从大约0.05mg/l至大约12.0mg/l维生素b9。
67.实施方案62-66之任一的方法,其中细胞培养基包含从大约0.05mg/l至大约2.5mg/l维生素b12。
68.实施方案62-67之任一的方法,其中细胞培养基是化学确定的细胞培养基。
69.实施方案62-67之任一的方法,其中细胞培养基是化学不确定的细胞培养基。
70.实施方案62-69之任一的方法,其中使细胞在细胞生长阶段接触所述细胞培养基。
71.实施方案62-70之任一的方法,其中使细胞在细胞生产阶段接触所述细胞培养基。
72.实施方案71的方法,其中所述方法还包含步骤：向细胞培养基添加半胱氨酸。
73.实施方案72的方法,其中半胱氨酸以在细胞培养基中提供从大约80mg/l至大约1500mg/l半胱氨酸的量添加。
74.实施方案72的方法,其中半胱氨酸以在细胞培养基中提供大约1500mg/l半胱氨酸的量添加。
75.实施方案72的方法,其中半胱氨酸以在细胞培养基中提供大约140mg/l半胱氨酸的量添加。
76.生产多肽的方法，包括步骤：在细胞培养基中培养包含编码多肽的分离核酸的细胞，其中:
(a)细胞培养基包含:
从大约200mg/l至大约1200mg/l胱氨酸；
从大约2μm至大约80μm柠檬酸铁；和
从大约0.05μm至大约0.5μm氢化可的松；和
(b)细胞表达多肽。
77.实施方案76的方法,其中细胞培养基还包括维生素b2,维生素b6,维生素b9和/或维生素b12。
78.实施方案76或77的方法,其中细胞培养基包含从大约0.05mg/l至大约1.0mg/l维生素b2。
79.实施方案76-78之任一的方法,其中细胞培养基包含从大约0.05mg/l至大约10.0mg/l维生素b6。
80.实施方案76-79之任一的方法,其中细胞培养基包含从大约0.05mg/l至大约12.0mg/l维生素b9。
81.实施方案76-80之任一的方法,其中细胞培养基包含从大约0.05mg/l至大约2.5mg/l维生素b12。
82.实施方案76-81之任一的方法,其中细胞培养基是化学确定的细胞培养基。
83.实施方案76-81之任一的方法,其中细胞培养基是化学不确定的细胞培养基。
84.实施方案76-83之任一的方法,其中在细胞生长阶段进行所述培养。
85.实施方案76-84之任一的方法,其中在细胞生产阶段进行所述培养。
86.实施方案85的方法,其中所述方法还包含步骤：向细胞培养基添加半胱氨酸。
87.实施方案86的方法,其中半胱氨酸以在细胞培养基中提供从大约80mg/l至大约1500mg/l半胱氨酸的量添加。
88.实施方案86的方法,其中半胱氨酸以在细胞培养基中提供大约1500mg/l半胱氨酸的量添加。
89.实施方案86的方法,其中半胱氨酸以在细胞培养基中提供大约140mg/l半胱氨酸的量添加。
90.实施方案76-89之任一的方法,其中多肽是抗体。
91.实施方案90的方法,其中抗体是igg1抗体。
92.实施方案90或91的方法,其中抗体是抗-vegf,抗间皮素,抗-pcsk9或抗β7抗体。
93.实施方案76-92之任一的方法,还包括步骤：从细胞培养基分离多肽。
94.实施方案93的方法,其中包含分离的多肽的组合物呈现为无色或带轻微颜色的液体。
95.实施方案94的方法,其中组合物包含至少100mg/ml浓度的分离多肽。
96.通过实施方案76-95之任一的方法产生的多肽。
97.包含实施方案96的多肽和可药用载体的药物组合物。
98.用于向细胞培养基补充化学确定的组分的试剂盒，所述试剂盒包含:
胱氨酸,其量在细胞培养基中提供从大约200mg/l至大约1200mg/l胱氨酸；
柠檬酸铁,其量在细胞培养基中提供从大约2μm至大约80μm浓度的柠檬酸铁；和
氢化可的松，其量在细胞培养基中提供从大约0.05μm至大约0.5μm浓度的氢化可的松。
99.实施方案98的试剂盒,其中所述试剂盒还包含维生素b2,维生素b6,维生素b9和/或维生素b12。
100.实施方案98或99的试剂盒,其中所述试剂盒包含维生素b2，其量在细胞培养基中提供从大约0.05mg/l至大约1.0mg/l维生素b2。
101.实施方案98-100之任一的试剂盒,其中所述试剂盒包含维生素b6,其量在细胞培养基中提供从大约0.05mg/l至大约10.0mg/l维生素b6。
102.实施方案98-101之任一的试剂盒,其中所述试剂盒包含维生素b9，其量在细胞培养基中提供从大约0.05mg/l至大约12.0mg/l维生素b9。
103.实施方案98-102之任一的试剂盒,其中所述试剂盒包含维生素b12，其量在细胞培养基中提供从大约0.05mg/l至大约2.5mg/l维生素b12。
104.细胞培养基，包含:
从大约200mg/l至大约1200mg/l胱氨酸；
从大约2μm至大约80μm柠檬酸铁；和
从大约0.05μm至大约0.5μm氢化可的松。
105.实施方案104的培养基,其中培养基还包含维生素b2,维生素b6,维生素b9和/或维生素b12。
106.实施方案104或105的培养基,其中培养基包含从大约0.05mg/l至大约1.0mg/l维生素b2。
107.实施方案104-106之任一的培养基,其中培养基包含从大约0.05mg/l至大约10.0mg/l维生素b6。
108.实施方案104-107之任一的培养基,其中培养基包含从大约0.05mg/l至大约12.0mg/l维生素b9。
109.实施方案104-108之任一的培养基,其中培养基包含从大约0.05mg/l至大约2.5mg/l维生素b12。
110.组合物，其包含(a)含有编码多肽的分离核酸的细胞；和(b)根据实施方案52-61和104-109之任一的培养基。
111.组合物，其包含：(a)多肽；和(b)根据实施方案52-61和104-109之任一的培养基。
提供以下实施例以举例说明而非限制本发明。
实施例
已经鉴定了可以生产具有可接受品质属性例如颜色的蛋白质药物产品的培养基，尤其是生产蛋白质产品以浓缩溶液存在(例如浓度达到至少100mg/ml)时具有可接受品质属性的蛋白质药物产品的培养基。在一些方面，蛋白质产品以包含至少1mg/ml的组合物的形式存在。本文描述了在本文提供的培养基中培养细胞的方法、以及使用该培养基生产多肽的方法。培养基在一方面可以包含胱氨酸和/或半胱氨酸和维生素b2,b6,b9和b12，其中任选加入铁源和氢化可的松。培养基在另一方面可以包含胱氨酸和/或半胱氨酸、氢化可的松和铁源，其中任选加入维生素b2,b6,b9和b12。尤其考虑含胱氨酸的组合物。每种培养基成分可以以本文全篇提供的任何值存在。培养基可以是化学确定的或化学不确定的。与在不同培养基中生产的多肽相比，本发明培养基当用于多肽生产方法中时可以减少多肽电荷变体的存在和/或减少活性氧的存在。本发明培养基可以用于细胞培养和多肽生产的任何阶段，并可以用于基础培养基和/或补料培养基中。本发明提供通过本发明任何方法生产的多肽、以及包含本文详述的多肽产品的药物组合物。在一方面，药物组合物以至少或大约100mg/ml,125mg/ml和150mg/ml中任一的浓度包含多肽。在另一方面，药物组合物以至少或大约1mg/ml,10mg/ml,25mg/ml,50mg/ml和75mg/ml中任一的浓度包含多肽。尤其考虑生产抗体的方法和包含抗体的组合物。本发明还描述用于向细胞培养基补充化学确定的组分的试剂盒。
在药物物质(drugsubstances)的工艺开发的整个过程中，重要的是产品品质符合临床使用的某些工业标准。皮下递送单克隆抗体的近来趋势要求制剂中药物物质的浓度增加至≥100mg/ml。然而，在这些高浓度，药物物质的颜色更深，这就使得更难于符合确立的有关产品颜色的质量预期。如本文所述，已经鉴定了对培养基(无论是化学确定的还是化学不确定的)的几种修饰，这些修饰可以降低药物物质的颜色强度从而满足产品质量标准。
使用与kaufman等,mol.cell.biol.,2(11):1304-1319(1982)先前描述的方法相似的二氢叶酸还原酶(dhfr)/甲氨蝶呤选择方法，对实施例描述的cho细胞系进行遗传工程化改造，以分泌重组人源化抗体(在本文中称作igg1单克隆抗体)。最初的转染使用以甲硫氨酸亚砜亚胺作为选择剂的gs选择系统和不含谷氨酰胺的培养基。随后的超转染使用dhfr选择系统和甲氨蝶呤作为选择剂。在2升搅拌式悬浮生物反应器中起始生长阶段前，将该cho细胞系的低温冷冻安瓿融化，并在37℃于5％co2的加湿温箱中在化学确定的培养基中摇瓶培养至少两周，以获得具有良好生长和生存性质的细胞培养悬浮液。
实施例1：在含有从抗体生产细胞分离的抗体的制剂中显示的颜色强度
在含有蛋白胨的化学不确定的培养基中培养能够产生igg1单克隆抗体(抗β7)的cho细胞系。纯化分离的抗体，并使用标准的“澄清、乳光和着色”(clarity,opalescenceandcoloration,coc)试验(councilofeurope.europeanpharmacopoeia.,2008,第7版,p.22)，评价颜色。简言之，使用相同的内径15mm至25mm的平底无色透明中性玻璃管，进行coc试验。向管中加入150g/l蛋白质溶液至40mm深度，所述蛋白质溶液从含有分泌的igg1单克隆抗体的纯化的浓缩细胞培养液制备。通过在漫射日光中相对于白背景垂直地观察，将含有抗体溶液的管与9个参考管比较，其中每个参考管各装有从b1(最深)至b9(最浅)的参考溶液。该igg1单克隆抗体溶液测定为具有≤b5的coc值(图1：制剂i)。
在cdm中培养产生igg1单克隆抗体(抗β7)的cho细胞系。对于细胞培养基的制备，通过如下方式制备基础cdm(培养基1)和补料培养基cdm(培养基2)溶液：将成分组合成一个定制的混合粉末，将混合粉末溶解在水中，调节至确保最佳细胞生长的最终ph和渗透压。基础培养基1和补料培养基2各具有超过20种成分，其中感兴趣的成分列在表a中。一些培养基成分例如葡萄糖并没有组合在混合粉末中，而是在培养基配制过程中单独加入。为了起始细胞培养的生长阶段，在含有1l基础培养基1的2升搅拌式生物反应器(applikon,fostercity,ca)中以大约1.0x106个细胞/ml接种cho细胞。以分批补料模式进行细胞培养，其中在第3天、第6天和第9天加入每升细胞培养液100ml补料培养基2用于起始生产阶段。每天分析葡萄糖的浓度，如果葡萄糖浓度降低至3g/l以下，则从500g/l葡萄糖储备液补充以防止葡萄糖耗竭。反应器配备有校准的溶解氧、ph和温度探针。通过喷射空气和/或氧气，在线控制溶解氧。通过加入co2或na2co3控制ph，按需向培养物中加入消泡剂。细胞培养物维持在ph7.0并在第0天至第3天维持在37℃温度，然后在第3天后维持在33℃。以275rpm搅拌细胞培养物，溶解氧水平在30％空气饱和度。使用advancedinstruments(norwood,ma)的渗压剂，检测渗透压。此外，也使用novabioprofile400(novabiomedical,waltham,ma)，每日确定离线ph和代谢物浓度。存活细胞密度(vcc)和细胞存活力每日使用
表a.感兴趣的成分
实施例2：通过改变细胞培养基中特定成分，降低从抗体生产细胞系分离的抗体的颜色强度
重新配制基础培养基1和补料培养基2以含有降低浓度的几种营养物，在细胞培养实验中使用以确定是否该重新配制的培养基可以降低从cho细胞系生产的分离单克隆igg1抗体(抗β7)的颜色强度。简言之，基础cdm(培养基3)和补料cdm(培养基4)溶液通过如下方式制备：将成分组合成一个定制的混合粉末，将粉末溶解在水中，调节至确保最佳细胞生长的最终ph和渗透压。基础培养基3和补料培养基4各具有超过20种成分，其中感兴趣的成分列在表b中。一些培养基成分例如葡萄糖并不组合在混合粉末中，而是在培养基配制过程中单独地加入。类似地，针对本研究而改变的培养基成分不包括在混合粉末中，而是在培养基配制过程中以合适水平单独地加入(表b)。柠檬酸铁从5g/l柠檬酸铁储备液添加，维生素b2以核黄素粉末形式提供，维生素b6以吡哆醇hcl的形式或以吡哆醛hcl的形式提供，维生素b9以叶酸粉末提供，维生素b12以氰基钴胺粉末形式提供，半胱氨酸以l-半胱氨酸一盐酸盐一水合物粉末的形式提供，胱氨酸以二钠盐一水合物粉末形式提供，氢化可的松从150μm储备液添加。
表b.感兴趣的成分
a铁源是硫酸亚铁
b铁源是柠檬酸铁
为了起始细胞培养的生长阶段，在含有1升基础培养基3的2升搅拌式生物反应器(applikon,fostercity,ca)中，以大约1.0x106个细胞/ml，接种cho细胞。以补料分批模式培养细胞，其中在第3天、第6天和第9天添加每升细胞培养液100ml补料培养基4，用于起始生长阶段。每天分析葡萄糖浓度，如果葡萄糖浓度降低至3g/l以下，从500g/l葡萄糖储备液补充以防止葡萄糖耗竭。反应器配有校正的溶解氧、ph和温度探针。通过喷射空气和/或氧，在线控制溶解氧。通过添加co2或na2co3控制ph，按需向培养物中添加消泡剂。细胞培养物维持在ph7.0，并在第0天至第3天维持在37℃，然后在第3天后维持在35℃。以275rpm搅拌细胞培养物，溶解氧水平为30％空气饱和度。使用advancedinstruments(norwood,ma)的渗压计监测渗透压。此外，还使用novabioprofile400(novabiomedical,waltham,ma)，每日测定离线ph和代谢物浓度。使用
这些结果说明，相比于通过在基础培养基1和补料培养基2中培养细胞而产生的单克隆igg1抗体的颜色强度，通过使用基础培养基3和补料培养基4培养cho细胞而产生的单克隆igg1抗体的颜色强度降低。
实施例3：通过改变细胞培养基中的维生素b水平，降低从抗体生产细胞系分离的抗体的颜色强度
为了确定在基础培养基3和补料培养基4中改变的成分对分离抗体颜色强度的影响，变化维生素b2、b6、b9和b12的水平而保持其它培养基成分水平不变。按实施例2所述配制培养基。针对本研究而改变的培养基成分不包括在混合粉末中，而在培养基配制过程中以合适的水平单独地加入。配制基础培养基5以具有和基础培养基3相似的降低的维生素水平以及与基础培养基1相似的所有其它成分(表c)。为了从cho细胞生产单克隆igg1抗体(抗β7)，细胞培养物饲喂基础培养基5用于初始生长阶段，并在第3、6和9天以补料培养基2或补料培养基4进行培养。如实施例2所示，进行细胞存活力测量和单克隆igg1抗体分离。在抗体纯化后，也如实施例2所述测定颜色强度和抗体滴度。从使用基础培养基5和补料培养基2培养的细胞获得的igg1单克隆抗体溶液测量为≤b4的coc值(图1；制剂v)。从使用基础培养基5和补料培养基4培养的细胞获得的igg1单克隆抗体溶液测量为≤b4的coc值(图1；制剂iv)。
表c.具有降低的维生素b2,b6,b9和b12水平的培养基
进行全因子研究，以评价各维生素b成分(维生素b2、b6、b9和b12)对分离抗体的颜色强度的贡献。当维生素b2水平作为分离的因子处理时，吡哆醇和吡哆醛的水平组合成一个单因子作为维生素b6，由此同时变化这两个营养物的浓度。类似地，维生素b9和b12的水平作为一个单因子一起改变，由此同时变化这两个营养物的浓度。配制了几种培养基制剂，包括表d、e和f中列出的培养基。为了从cho细胞生产单克隆igg1抗体(抗β7)，以补料分批模式，向细胞培养物饲喂基础培养基5和补料培养基4、基础培养基6和补料培养基7、基础培养基8和补料培养液9、或基础培养基10和补料培养基11。其它细胞培养物饲喂含有1.41mg/l维生素b2和/或15.42mg/l维生素b6(以吡哆醇形式提供)的基础培养基和含有10mg/l维生素b2和/或76mg/l维生素b6(7mg/l吡哆醇和60mg/l吡哆醛)的补料培养基。如实施例2所述进行细胞存活力测量和单克隆igg1抗体分离。在抗体纯化后，如实施例2所述测定抗体滴度。使用颜色试验测定颜色强度，其中较高的数值指示较高的颜色强度，较低的数值指示较浅的颜色强度。对于此颜色试验(本文中称作标化的荧光强度(nifty)试验)，使用g3000swxl柱(tosoh)通过大小排阻层析(sec)分析大约50至125μg单克隆抗体样品，其中使用0.5ml/min的等度流速。sec的流动相是0.2m磷酸钾、0.25m氯化钾、ph6.2。柱温控制在15℃。监测sec洗脱物在280nm的uv吸收，以及在350nm激发波长和425nm发射波长的荧光。使用agilentchemstation软件在uv吸收和荧光发射色谱图上对单克隆抗体分子的sec峰进行积分。对于每个单克隆抗体样品，通过主峰的荧光峰面积除以主峰的uv吸收峰面积(这通过抗体质量贡献校正了荧光反应)，确定了标化的荧光。随后，通过计算测试的单克隆抗体样品的标化荧光与含有≤b5的coc读数的参考单克隆抗体样品的标化荧光的比值，确定颜色强度值。使用jmp8.0.2统计软件分析随时间变化的收集细胞体积(ivpcv)和抗体滴度水平，该分析显示尽管通过在基础和补料培养基中改变维生素b2和维生素b6水平仅轻微地影响细胞存活力和抗体滴度水平(图3a和b；中间趋势线)，但这两种维生素在细胞培养基中水平的增加却显著地增加了分离的抗体的颜色强度(图4；中间趋势线)。相反地，维生素b9和维生素b12的增加水平对细胞存活力、抗体滴度水平和颜色强度没有显著影响(图3和4；中间趋势线)。此外，从使用含有0.25mg/l维生素b2和5.35mg/l维生素b6(以吡哆醇供应)的基础培养基和不含维生素b2和维生素b6的补料培养基培养的细胞系分离的抗体中，观察到了低水平的颜色强度。
也研究了维生素b1、b3、b5和b7的影响；然而，这些营养物对含抗体溶液的颜色强度没有显著影响。
表d.具有维生素b2变化的培养基
表e.具有维生素b6变化的培养基
表f.具有维生素b9和b12变化的培养基
实施例4：通过改变细胞培养基中的铁源和水平，降低从抗体生产细胞系分离的抗体的颜色强度
为了评价铁水平对分离抗体的颜色强度的贡献，改变铁的水平而保持其它培养基成分水平不变。如实施例2所述制备培养基。针对该研究改变的培养基成分不包括在混合粉末中，而在培养基配制过程中以合适的水平单独地加入。重现配制基础培养基1以具有降低水平的硫酸亚铁，以产生含有18μm硫酸亚铁的基础培养基12和含有10μm硫酸亚铁的基础培养基13。为了从cho细胞生产单克隆igg1抗体(抗β7)，以补料分批模式，向细胞培养物饲喂基础培养基1和补料培养基2、基础培养基12和补料培养基2、或基础培养基13和补料培养基2。如实施例2所述，进行细胞存活力测量和单克隆igg1抗体分离。在抗体纯化后，如实施例2所述，确定抗体滴度。用颜色试验确定颜色强度，其中较高的数值指示较高的颜色强度，较低的数值指示较低的颜色强度。该颜色试验(也称作nifty试验)如实施例3中所述实施。使用jmp8.0.2统计学软件分析随时间变化的收集细胞体积(ivpcv)和抗体滴度水平，该分析显示，尽管相对于75μm浓度铁而言使用较低铁浓度降低了细胞存活力和抗体滴度水平(图5a和b)，但细胞培养基中较低的铁浓度显著地减少了分离抗体中的颜色强度(图5c)。
为了研究观察到的细胞培养基条件对颜色的影响是由于细胞内还是细胞外现象所致，进行了一系列体外孵育实验。将1g/l量的单克隆抗体掺入新鲜制备的细胞培养基中，33℃温育多达6天。用于体外孵育的细胞培养基具有10、18和75μm的硫酸亚铁浓度。维生素b浓度保持不变，具有0.25mg/l维生素b2,5.35mg/l维生素b6(5.35mg/l吡哆醇+0mg/l吡哆醛),8.61mg/l维生素b9和1.76mg/l维生素b12的降低水平。在第0、3和6天从温育的混合物取样，通过蛋白a层析纯化抗体。使用nifty试验，测量含分离抗体的溶液的颜色强度。在从生长在分别含有75、18或10μm硫酸亚铁的培养基中的细胞分离的含抗体溶液中，观察到颜色强度从第0天的1.0单位增加到第6天的1.8、1.44或1.27单位(图5d)。在较高铁浓度的增加颜色形成与细胞培养基试验获得的结果相映，说明细胞外机制在抗体着色上发挥作用。
为了进一步评价铁对分离抗体的颜色强度的贡献，改变铁的来源和水平，而保持其它培养基成分水平不变。如实施例2所述制备培养基。针对该研究改变的培养基成分不包括在混合粉末中，而在培养基配制过程中以合适的水平单独地加入。重现配制基础培养基1以具有降低水平的硫酸亚铁，以产生含有18μm硫酸亚铁的基础培养基12和含有10μm硫酸亚铁的基础培养基13。此外，重现配制基础培养基1以具有降低水平的铁和不同的铁源，以产生含有18μm硝酸铁的基础培养基14、含有18μm柠檬酸铁的基础培养基15、和含有10μm柠檬酸铁的基础培养基16。为了从cho细胞生产单克隆igg1抗体(抗β7)，以补料分批模式，向细胞培养物饲喂基础培养基1和补料培养基2、基础培养基12和补料培养基2、基础培养基13和补料培养基2、基础培养基14和补料培养基2、基础培养基15和补料培养基2、或基础培养基16和补料培养基2。如实施例2所述，进行细胞存活力测量和单克隆igg1抗体分离。在抗体纯化后，也如实施例2所述测量抗体滴度。使用颜色试验确定颜色强度，其中较高的数值指示较高的颜色强度，较低的数值指示较低的颜色强度。该颜色试验(也称作nifty试验)如实施例3所述进行。使用jmp8.0.2统计学软件分析随时间变化的收集细胞体积(ivpcv)和抗体滴度水平，该分析显示，相比于75μm浓度的硫酸亚铁，使用较低的硫酸亚铁浓度水平降低了细胞存活力和抗体滴度(图6a和b)。使用含有18μm柠檬酸铁的培养基从细胞培养物获得的细胞存活力和抗体滴度，与使用含75μm硫酸亚铁的培养基相当(图6a和b)。然而，与所有测试浓度的硫酸亚铁比，在细胞培养基中使用18μm柠檬酸铁显著地降低了分离抗体的颜色强度(图6c)。从生长在含18μm硝酸铁的培养基中的细胞培养物获得的细胞存活力、抗体滴度和分离抗体的颜色，与使用含10μm或18μm硫酸亚铁的培养基时的观察结果相当(图6a-c)。
将降低的维生素b水平和降低的铁浓度组合，以检查由于维生素和铁导致的颜色有益效应是否是加性的。重现配制基础培养基13、培养基14、培养基15和培养基16以具有降低水平的维生素b水平，从而分别产生基础培养基21、培养基22、培养基23和培养液25。此外，重现配制基础培养基1以具有降低的维生素b水平和10μm硝酸铁作为铁源，从而产生基础培养基24。培养基21至25中降低的维生素水平如下：0.25mg/l维生素b2,5.35mg/l维生素b6(5.35mg/l吡哆醇+0mg/l吡哆醛),8.61mg/l维生素b9和1.76mg/l维生素b12。为了从cho细胞生产单克隆igg1抗体，以补料分批模式，向细胞培养物饲喂基础培养基21、22、23、24或25和补料培养基2。如实施例2所述，进行单克隆igg1抗体分离和抗体滴度测量。使用nifty试验测量颜色强度。对抗体滴度水平和颜色强度的分析显示，当硫酸亚铁浓度从75μm降低至18μm并组合较低的维生素浓度时，与单独降低这些因素之一时相比，所得的颜色和滴度较低(图6d和e，加号)。然而，对于硝酸铁或硫酸亚铁，将铁浓度从18μm降低至10μm，似乎没有进一步益处(图6d和e，加号)。
为了研究活性氧(ros)对抗体颜色强度的贡献，进行了体外实验，其中将2g/l单克隆igg1抗体样品掺入含有补充了75μm或18μm硫酸亚铁的细胞培养基的小瓶中。还进行了其它体外实验，其中将2g/l单克隆igg1抗体(抗β7)样品掺入含有补充了1.41mg/l维生素b2或0.25mg/l维生素b2的细胞培养基的小瓶中。在没有任何细胞的情况下，在有或无203u/ml过氧化氢酶时，37℃温育样品5天。使用颜色试验测定颜色强度，其中较高的数值指示较高的颜色强度，较低的数值指示较低的颜色强度。该颜色试验，也称作nifty试验，如实施例3所述实施。用jmp8.0.2统计学软件分析颜色水平，该分析显示，尽管增加的铁水平导致增加颜色强度的抗体溶液(图7a)，但通过加入过氧化氢酶降低了该颜色的增加(图7b；中间趋势线)。相反地，尽管维生素b2的增加水平导致了增加颜色强度的抗体溶液，但通过加入过氧化氢酶没有降低该颜色强度(图7a和b；中间趋势线)。
实施例5：通过改变细胞培养基中的特定成分，减少从抗体生产细胞系分离的抗体的酸性电荷变体的形成
为了从cho细胞生产单克隆igg1抗体(抗β7)，将细胞培养在三种重新配制的基础培养基1溶液之一中，所述三种培养基溶液各含有10μm、18μm或75μm硫酸亚铁。用两种重新配制的基础培养基3溶液之一饲喂(即培养)其它的细胞培养物，其中所述两种培养基溶液各含有10μm或18μm柠檬酸铁。所有细胞培养物以补料分批模式饲喂不含铁的补料培养基。如实施例2所述，分离单克隆igg1抗体和确定抗体滴度。使用颜色试验测定颜色强度，其中较高的数值指示较高的颜色强度，较低的数值指示较低的颜色强度。该颜色试验，也称作nifty试验，如实施例3所述实施。为了在纯化的溶液中检查抗体的酸性电荷变体，通过离子交换层析(iec)，使用dionexpropacwcx-10(4x250mm)柱，分析单克隆抗体的电荷异质性。该分析在agilent1100hplc系统上进行，其中在280nm监测流出物。流动相a是25mm磷酸钠(ph6.6)，流动相b是在流动相a中的150mm硫酸钠。使用在45分钟内从0至37％b的线性梯度，流速0.5ml/min。柱温控制在40℃。在iec分析之前，通过羧肽酶b除去单克隆抗体重链上的c末端赖氨酸残基，以减少该碱性区域中电荷异质性的复杂性。使用jmp8.0.2统计学软件分析颜色强度与酸性电荷变体存在的关系，该分析说明抗体溶液中高颜色强度与增加水平的酸性电荷变体之间的强相关性(图8a)。而且，与使用修饰的培养基1和培养基2培养的细胞系相比，从使用修饰的培养基3和培养基4培养的细胞系分离的抗体具有显著减少的酸性电荷变体存在，其中在铁的最低浓度观察到最大减少(图8a)。
在含抗体溶液中检查颜色强度和酸性电荷变体形成之间的相关性，其中所述含抗体溶液从使用含不同铁或维生素b水平的培养基培养的细胞系获得。从cho细胞生产单克隆igg1抗体，其中所述cho细胞培养在含有18μm或75μm硫酸亚铁的基础培养基中、或含有低、中等或高水平维生素b水平而铁浓度维持在18μm的基础培养基中。低维生素水平是：0.25mg/l维生素b2,5.35mg/l维生素b6(5.35mg/l吡哆醇+0mg/l吡哆醛),8.61mg/l维生素b9和1.76mg/l维生素b12。中等维生素水平是：0.70mg/l维生素b2,7.7mg/l维生素b6(7.7mg/l吡哆醇+0mg/l吡哆醛),4.9mg/l维生素b9和1.5mg/l维生素b12。高维生素水平是：1.41mg/l维生素b2,15.42mg/l维生素b6(15.42mg/l吡哆醇+0mg/l吡哆醛),9.93mg/l维生素b9和3.05mg/l维生素b12。如实施例2所述，分离单克隆igg1抗体和确定抗体滴度。使用总颜色试验，确定颜色。对于总颜色试验，使用cie颜色测量系统，如berns等,billmeyerandsaltzman’sprinciplesofcolortechnology,第三版,纽约,ny,johnwiley&sons,inc.,(2000)所述，得到样品相对颜色的定量值。简而言之，在使用水进行空白处理后，使用hp8453a分光光度计(1cm路程小杯)，在可见区(380-780nm)测量净测试样品的吸收光谱。然后，按照standardpracticeforcalculationofcolortolerancesandcolordifferencesfrominstrumentallymeasuredcolorcoordinates,annualbookofastmstandards,vol.06.01,(2011)先前描述的，将吸收光谱转化为ciel*a*b*色标度。对于这些计算，使用在可见区中的人工平谱作为光源。"总颜色"代表δe，其相应于在三维ciel*a*b*颜色空间中测试样品和水之间的欧几里得距离。此外，"总颜色"代表测试单克隆抗体样品的总体颜色，不区分不同色调。随后通过计算测试单克隆抗体样品的“总颜色”测量值与参考单克隆抗体样品的“总颜色”测量值的比值，确定颜色强度值，其中所述参考样品包含≤b5的coc读数。在增加的铁浓度和增加的颜色强度之间观察到正相关性(图8b)。此外，增加的铁浓度导致增加水平的酸性电荷变体。相对地，在含有恒定铁浓度的培养基中同时改变维生素b2、b6、b9和b12的水平，显示出在酸性电荷变体和颜色强度之间没有相关性(图8c)。
从含有变化水平的b2和b6的细胞培养基培养的细胞系分离抗体，在分离的抗体中检查颜色强度和形成的酸性电荷变体的相关性。为了从cho细胞生产单克隆igg1抗体(抗β7)，以补料分批模式，向细胞培养物饲喂含有变化水平的维生素b2和b6的基础和补料培养基。随后，分离抗体并如实施例3所述使用nifty试验测量颜色强度、以及测量酸性电荷变体的存在。使用jmp8.0.2统计学软件分析颜色强度与酸性电荷变体存在的关系，分析显示，从含1.41mg/l维生素b2和/或15.42mg/l维生素b6(以吡哆醇供应)的基础培养基和含10mg/l维生素b2和/或76mg/l维生素b6(7mg/l吡哆醇和60mg/l吡哆醛)的补料培养基培养的细胞系分离的抗体中，高颜色强度和增加水平的酸性电荷变体之间存在强相关性(图9a和b)。从含0.25mg/l维生素b2和5.35mg/l维生素b6(以吡哆醇供应)的基础培养基和不含维生素b2和维生素b6的补料培养基培养的细胞系分离的抗体中，观察到了颜色强度和酸性电荷变体的最低水平(图9a和b)。
进行全因子研究，其中在不同铁源存在下用含有变化水平的吡哆醛的细胞培养基培养细胞系，从细胞系分离抗体，在抗体中确定颜色强度和酸性电荷变体形成之间的相关性。为了从cho细胞生产单克隆igg1抗体(抗β7)，用含有变化水平的吡哆醛的基础和补料培养基培养细胞。在基础培养基中提供柠檬酸铁或硫酸亚铁，以补料分批模式实施细胞培养过程。随后，分离抗体并使用总颜色试验测量颜色强度、并测量酸性电荷变体的存在。使用jmp8.0.2统计学软件分析颜色强度与酸性电荷变体存在之间的关系，分析显示，与从含有0mg/l吡哆醛和18μm柠檬酸铁的基础培养基和含有0mg/l或60mg/l吡哆醛的补料培养基培养的细胞系分离的抗体相比，从含有0mg/l吡哆醛和18μm硫酸亚铁的基础培养基和含有0mg/l或60mg/l吡哆醛的补料培养基培养的细胞系分离的抗体在较高的颜色强度和增加的酸性电荷变体水平之间存在强相关性(图10a和b)。
在不同铁源存在下使用含变化水平的维生素b2、b6、b9和b12的细胞培养基培养细胞系，在从所述细胞系分离的抗体中检查颜色强度和酸性电荷变体形成的相关性。为了从cho细胞生产单克隆igg1抗体(抗β7)，用含有1.41mg/l维生素b2,15.42mg/l吡哆醇,0mg/l吡哆醛,9.93mg/l维生素b9和3.05mg/l维生素b12的基础培养基、以及三种不同补料培养基之一培养细胞，其中所述三种补料培养基分别含有不同水平的维生素b2、b6、b9和b12。在基础培养基中提供柠檬酸铁或硫酸亚铁，以补料分批模式实施细胞培养过程。随后分离抗体，使用总颜色试验测量颜色强度、并测量酸性电荷变体的存在。使用jmp8.0.2统计学软件分析颜色强度与酸性电荷变体存在之间的关系，分析显示，在18μm硫酸亚铁或18μm柠檬酸铁存在下使用含5mg/l维生素b2,3.5mg/l吡哆醇,30mg/l吡哆醛,98.5mg/l维生素b9和24mg/l维生素b12的补料培养基培养细胞系，与含有10mg/l维生素b2,7mg/l吡哆醇,60mg/l吡哆醛,197mg/l维生素b9和48mg/l维生素b12的补料培养基相比，导致具有降低的颜色强度的分离抗体(图11a；分别是维生素水平2和维生素水平3)。在从缺乏维生素b2、b6、b9和b12的补料培养基培养的细胞分离的抗体中，观察到了颜色强度的最大降低(图11a；维生素水平1)。尽管伴随降低浓度的维生素b2、b6、b9和b12有显著的抗体颜色强度降低，但是初步的结果表明在酸性电荷变体的存在上没有显著改变(图11b)。
使用含有递增浓度的来自不同来源的铁的细胞培养基培养细胞系，在分离自细胞系的抗体中检查颜色强度和酸性电荷变体形成的相关性。为了从cho细胞生产单克隆igg1抗体(抗β7)，用含有75μm硫酸亚铁的基础培养基1、含有18μm硫酸亚铁的基础培养基12、或含有10μm硫酸亚铁的基础培养基13以补料分批模式培养细胞。其它细胞培养物饲喂含有18μm柠檬酸铁的基础培养基15或含有10μm柠檬酸铁的基础培养基16。所有细胞培养物均以补料分批模式饲喂不含铁的补料培养基。如实施例3所述，使用nifty试验测量颜色强度。在从含有降低水平的铁的基础培养基培养的细胞分离的抗体中，观察到了颜色强度的最大降低(图12a)。在分离的抗体溶液中，降低的颜色强度与减少的酸性电荷变体存在相关(图12b)。
使用含有递增浓度的柠檬酸铁的细胞培养基培养细胞系，在从细胞系分离的抗体中检查颜色强度和酸性电荷变体形成的相关性。为了从cho细胞生产单克隆igg1抗体(抗β7)，在含有18μm柠檬酸铁或36μm柠檬酸铁的修饰基础培养基1或修饰基础培养基3中培养细胞。所有细胞培养物以补料分批模式饲喂不含铁的补料培养基。从33℃或37℃孵育的细胞培养物分离单克隆igg1抗体。使用颜色试验，特别是总颜色试验，测量颜色强度，其中较高的数值指示较高的颜色强度，较低的数值指示较低的颜色强度。在从含有降低水平的柠檬酸铁的基础培养基培养的细胞分离的抗体中，观察到颜色强度的最大降低(图13a)。在分离的抗体溶液中，降低的颜色强度与存在的降低的酸性电荷变体相关。从33℃培养的细胞分离的抗体显示出酸性电荷变体的最大降低(图13b)。温度从33℃增加到37℃，对于在修饰的基础培养基1或修饰的基础培养基3中培养的抗体生产细胞，导致了其抗体产量的大约2500mg/l至4250mg/l的显著增加。
为了确定半胱氨酸对从cho细胞系生产的分离单克隆igg1抗体(抗β7)的颜色强度的贡献，重新配制了基础培养基3以替代480mg/l胱氨酸而含有525mg/l半胱氨酸用于细胞培养实验。为了从cho细胞生产单克隆igg1抗体，以补料分批模式，将细胞培养在含有525mg/l半胱氨酸的修饰基础培养基3和补料培养基4中。分离抗体，使用标准coc试验测量颜色。coc试验使用相同的内径15mm至25mm的平底无色透明中性玻璃管进行。两个管各装入深度40mm的150g/l蛋白质溶液，所述蛋白质溶液从含有分泌的igg1单克隆抗体的纯化浓缩细胞培养液制备。含有抗体溶液的每个管与分别装有从by1(最深)至by7(最浅)的参考溶液的7个参考小瓶相比、或与分别装有从b1(最深)至b9(最浅)的参考溶液的9个参考小瓶相比，其中通过在漫射日光中相对于白背景垂直观察进行所述比较。含抗体溶液的颜色分析显示≤b5或≤by5的coc值(图1；分别为制剂vi和viii)。抗体制剂vi进一步使用上述总颜色试验和实施例3所述nifty试验进行了颜色强度的分析。当用nifty试验和总颜色试验测量时，该抗体制剂的颜色分析分别显示了0.71和1.00的颜色强度值。该抗体制剂，与抗体制剂iii(描述在实施例1中)和抗体制剂iv(描述在实施例3中)的颜色强度相比，具有较浅的颜色。当用nifty试验和总颜色试验测量时，抗体制剂iii分别显示出1.59和2.61的颜色强度值。当用nifty试验和总颜色试验测量时，抗体制剂iv分别显示出1.47和2.04的颜色强度值。
进行多变量研究，其中在有或无胱氨酸或半胱氨酸存在下、以及在有或无氢化可的松存在下，使用含变化浓度的维生素b2、b6、b9和b12的细胞培养基培养细胞系，在分离自细胞系的抗体中确定颜色强度和酸性电荷变体形成的相关性。为了从cho细胞生产单克隆igg1抗体(抗β7)，将细胞培养在含1.41mg/l维生素b2,15.42mg/l吡哆醇,0mg/ml吡哆醛,9.93mg/l维生素b9和3.05mg/l维生素b12的基础培养基、或含有0.7mg/l维生素b2,7.7mg/l吡哆醇,0mg/l吡哆醛,4.9mg/l维生素b9和1.5mg/l维生素b12的基础培养基中。此外，所述基础培养基还含有525mg/l半胱氨酸或480mg/l胱氨酸(表g)。如表g所示制备其它基础培养基，并补充150nm氢化可的松。所有细胞培养物以补料分批模式饲喂不含铁的补料培养基。
表g.多变量成分实验
从细胞培养物分离单克隆igg1抗体，测量颜色强度和酸性电荷变体的存在。使用上述总颜色试验，测定颜色强度。使用jmp8.0.2统计学软件分析颜色强度与酸性电荷变体存在的关系，分析显示，与半胱氨酸相比，在从含胱氨酸的基础培养基培养的细胞系分离的抗体中，降低的颜色强度和降低的酸性电荷变体水平之间存在相关性(图14a和b)。此外，降低的维生素b水平还导致了降低的颜色强度和酸性电荷变体形成，而氢化可的松的加入增强了该降低(图14a和b)。
实施例6:通过改变细胞培养基中的特定成分，降低了从细胞系分离的单克隆igg1抗体的颜色强度
使用产生不同单克隆igg1抗体(mab10)的cho细胞系，进一步研究了胱氨酸在用于基础细胞培养基中时降低颜色强度的效应。该细胞系在化学不确定的基础培养基中培养，所述基础培养基具有2.6mm浓度的单体形式的半胱氨酸氨基酸(半胱氨酸)、或1.3mm浓度的二聚体形式的半胱氨酸氨基酸(胱氨酸)。通过在该化学不确定的基础培养基中接种细胞，在细胞培养物中起始mab10的生产，并在14天的细胞培养周期中在第3天向生物反应器中加入分批补料培养基。细胞在第1天培养在37℃，在细胞培养周期过程中起始温度迁移。收获培养基，以组合物形式回收mab10，之后使用coc试验评价颜色强度。从培养在含半胱氨酸的基础培养基中的细胞回收的含mab10的组合物呈现为无色或带轻微颜色的液体，具有coc试验测定的b7颜色强度值。当半胱氨酸替换为胱氨酸后，从培养在基础培养基中的细胞回收的包含mab10的组合物呈现为无色或带轻微颜色的液体，具有b8的改善的颜色强度coc值。
在多变量研究中，使用从cho细胞生产mab10的四种不同方案，评价某些培养基成分对从细胞培养物回收的含抗体组合物的颜色强度的影响(表h)。方案之间在化学不确定基础培养基中的铁水平和铁源不同。方案之间在化学不确定基础培养基中也具有不同的维生素b水平和氨基酸半胱氨酸——单体形式半胱氨酸氨基酸(半胱氨酸)或二聚体形式半胱氨酸氨基酸(胱氨酸)。通过在化学不确定基础培养基中接种细胞起始在细胞培养物中生产mab10，在14天细胞培养周期中于第3天向生物反应器中加入分批补料培养基。收获培养基，以组合物形式收获mab10，之后使用coc试验评价颜色强度。分析包含回收的mab的组合物的颜色强度，分析显示，与使用方案4获得的抗体组合物的颜色强度(b6的coc值)相比，方案1、2和3导致具有降低的颜色强度(b7的coc值)的抗体组合物。这些结果显示，在基础培养基中胱氨酸而非半胱氨酸的使用、维生素b水平的降低、和/或铁的降低以及铁源的改变导致了mab10组合物中颜色强度的降低(表h)。例如，相比方案4，在方案3中，降低维生素b水平和以较低浓度使用柠檬酸铁替代硫酸亚铁，降低了抗体组合物的颜色强度，而无需将半胱氨酸的使用改变为胱氨酸。相对于方案4，在方案2中，当柠檬酸铁以较低浓度替代硫酸亚铁并使用胱氨酸替代半胱氨酸而不改变维生素b水平，观察到了相同的颜色强度降低效应。与从方案4获得的mab10组合物相比，如在方案1中所见，维生素b水平的降低、铁水平的降低、和铁源的改变、以及胱氨酸替代半胱氨酸的使用，也导致了mab10组合物的颜色强度的降低(表h)。
表h.基础培养基成分一览
a指示柠檬酸铁为铁源；b指示硫酸亚铁为铁源实施例7：对于在含抗体溶液中测量颜色强度，nifty试验和总颜色试验与标准coc试验相当
近来对于高浓度制剂的强调普遍地增加了单克隆抗体液体制剂的颜色强度。颜色被视为产品的品质属性，因此，重要的是，在开发和实施方案改变时，紧密监测药物物质的颜色的一致性。在测量颜色时面临的挑战之一是使用合适的测试试验。尽管coc试验是工业标准，但coc试验不是完全定量的，并易受实施该试验的个体的主管判断的影响。为了克服此问题，开发了两种不同的颜色测量方法，总颜色试验和nifty试验，并将其用于实施例中测量颜色强度。
通过作图确定了这三种颜色测量试验之间的相关性，其中横坐标上是总颜色值、纵坐标上是nifty值，数据点基于在总颜色和nifty试验测量过的含抗体溶液上实施实际的coc测量(图15a)。在总颜色试验和nifty试验的定量测量值之间存在良好的相关性(r2＝0.75)。此外，可以看到，这些试验与实际的coc测量具有相当良好的相关性，说明从总颜色试验和nifty试验获得的结果可以用于预测样品的颜色强度。
通过两种不同方法从细胞培养物收获和纯化抗体，之后测量颜色强度。在一个方法中，使用蛋白a亲和层析纯化收获的细胞培养物中的单克隆抗体。在纯化后，洗脱的蛋白a池中蛋白质的浓度为大约5-10g/l。进一步使用amiconcentricon离心过滤装置，将蛋白a池浓缩至150g/l。在浓缩的蛋白a池中使用标准coc试验、总颜色试验或nifty试验测量颜色。在另一方法中，使用标准的抗体纯化方法，纯化收获的细胞培养液，所述标准方法包括：通过蛋白a亲和层析进行亲和纯化、通过阴离子和阳离子交换层析进一步纯化、过滤去除病毒、和最终的超滤和渗滤步骤用于抗体的最终配制和浓缩，之后使用标准coc试验、总颜色试验或nifty试验测量颜色。
由于实际考虑，决定在实施例描述的几个实验中使用蛋白a池的颜色作为最终药物物质的颜色的替代物。针对从最终完全纯化的抗体制剂获得的颜色强度评价了从蛋白a池制备的抗体制剂测量的颜色强度的预测价值。通过nifty试验(图15b)或总颜色试验(图15c)测量从蛋白a池获得的含抗体溶液的颜色强度，并与在最终完全纯化的抗体制剂中测量的颜色强度进行比较，该比较证实在总颜色测量值(r2＝0.73)和nifty测量值(r2＝0.98)上存在相当好的相关性。总颜色来自池的吸收光谱，因此可以预期在较早的尚在处理的池中由于非抗体杂质的存在或由于增加的光散射会有更高的颜色强度。相反地，nifty值从大小排阻层析的主峰测量，因此可以预期如果带颜色的或不带颜色的蛋白质分子不被优先纯化，则在该纯化过程中nifty值将保持恒定。总的来说，在蛋白a池和配制的药物物质之间观察到了颜色测量值的合理相关性。
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