基于物种COI基因的七种蓝舌病毒媒介库蠓物种鉴定方法与流程

本发明涉及蓝舌病毒主要传播媒介库蠓物种鉴定领域。

背景技术：

库蠓属culicoides昆虫隶属于双翅目diptera、长角亚目nematocera、蠓科ceratopogonidae，是吸血蠓中种类最多、数量最大的一类昆虫。目前全世界已发现1400多种，广泛分布于世界各地。迄今，我国已发现340余种。库蠓体型微小，可直接侵袭人和动物，造成过敏反应，或者间接传播人畜共患传染病。当吸血蠓吸食到受病毒感染的宿主血液后，通过其唾液将病原体带至其他宿主体内，可传播包括蓝舌病毒（btv）、流行性出血热病毒（ehdv）、schmallenberg病毒（sbv）等在内的多种病原，其中蓝舌病毒所引发的蓝舌病在世界范围内广泛传播和流行，已在欧洲等地爆发给当地畜牧业带来巨大的经济损失，对农业的发展构成了严重的威胁。目前，世界范围内已经明确的蓝舌病传播媒介包括不显库蠓复组obsoletuscomplex(culicoidesobsoletus,culicoidesscoticus,culicoidesdewulfi和culicoideschiopterus)、灰黑库蠓种团pulicarisgroup(culicoidespulicaris和culicoidespunctatus)和残肢库蠓culicoidesimicola等，这些库蠓作为蓝舌病毒的重要载体，与医疗卫生和兽医等领域息息相关。因此，库蠓在医学研究及疾病传播领域中具有不可忽视的地位，媒介库蠓的准确鉴定是流行病传播环节中控制媒介的重要基础，是蠓传疾病监测、防治的关键。

目前，鉴定库蠓物种的方法主要是传统形态分类和分子鉴定方法。传统形态分类通过对库蠓形态特征进行检索鉴定，但由于库蠓体型微小，形态鉴定步骤繁琐以及近似物种特征难以界定等，尤其是复组(complex)或种团(group)内的物种。同时，形态鉴定是建立在完整成体的基础上，对肢体残缺或幼期虫态的个体鉴定困难。此外，鉴定人员需具备非常专业的鉴定知识和足够丰富的鉴定经验，才能有效的鉴定库蠓物种。随着分子生物学的发展，分子鉴定技术已逐渐成为物种鉴定的常用方法。分子鉴定技术通过对特定基因扩增、测序以及与genbank等公共数据库进行序列比对来鉴定物种，但此方法需要测序，对于大样本量进行鉴定时经济成本较高。因此，亟需寻求一种快速、简便、准确且成本较低的方法，以弥补常规鉴定方法的不足。

coi基因是线粒体基因组中编码细胞色素c氧化酶亚基i的基因，是目前分子研究领域较为常用的分子标记。该基因与线粒体其他基因相比，具有较为保守的结构和大小，包含大量的遗传信息，并且在同一物种不同个体之间只有2%以下差异，coi基因已用于多种生物类群的分子鉴定。本发明提供了蓝舌病毒7种主要的媒介库蠓（culicoidesobsoletus,culicoidesscoticus,culicoidesdewulfi,culicoideschiopterus,culicoidespulicaris,culicoidespunctatus和culicoidesimicola）的coi基因特异性引物及其物种鉴定方法，有利于实现上述七种库蠓的快速、准确鉴定。

技术实现要素：
：

本发明目的在于提供基于物种coi基因序列的七种蓝舌病毒媒介库蠓物种鉴定方法。通过提取待鉴定蠓组织基因组dna，利用不同库蠓的特异性引物进行pcr扩增其coi基因，再比对pcr产物条带大小，实现七种蓝舌病毒媒介库蠓的快速、准确鉴定。

为实现上述目标，所采用的技术方案如下：

1、一种基于物种coi基因的七种蓝舌病毒媒介库蠓鉴定方法，含有七种库蠓的coi基因特异性扩增引物，引物序列及产物大小如下：

a、c.obsoletuscoi基因的特异性扩增引物，上游引物：5’gcccccgatatagcctttcc3；下游引物：5’tcggtcggttaagagcatgg3’；扩增片段长度为：375bp；

b、c.scoticuscoi基因的特异性扩增引物，上游引物：5’cctttaatactaggtgccccaga3’；下游引物：5’cctgcatgggagacatttgc3’；扩增片段长度为：170bp；

c、c.imicolacoi基因的特异性扩增引物，上游引物：5’ccctcctgctgggtcaaaaa3’；下游引物：5’gtcacccgggttctttaattgg3’；扩增片段长度为：551bp；

d、c.dewulficoi基因的特异性扩增引物上游引物：5’gccggaacaggttgaacagt3’；下游引物：5’aattgccaggtctaccgagg3’；扩增片段长度为：78bp；

e、c.punctatusoi基因的特异性扩增引物，上游引物：coi5’taggggccccagacatagc3’；下游引物：5’aaaatagggtctccgcctcc3’；扩增片段长度为：430bp；

f、c.chiopteruscoi基因的特异性扩增引物，上游引物：5’tttggagtatgggccggaat3’；下游引物：5’acagttcatccagtccctgc3’；扩增片段长度为：320bp；

g、c.pulicariscoi基因的特异性扩增引物，上游引物：5’catgccggagcatccgtag3’；下游引物：5’ctcctccagcagggtcaaaa3’；扩增片段长度为：260bp；

含有上述七种库蠓的基因组dna，作为检测过程中的阳性对照；

所述鉴定库蠓物种的方法如下：

步骤1：提取待鉴定蠓种的基因组dna，同时准备作为阳性对照的七种库蠓基因组dna和阴性、空白对照dna；

步骤2：以上述dna为模板，配制pcr反应体系，即将步骤1中各种基因组dna加入到pcr反应体系中，在待鉴定蠓种管中分别加入七种不同库蠓的特异性引物进行pcr扩增；

步骤3：取5-10μlpcr扩增产物，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，凝胶成像仪照相分析，其中空白和阴性对照若未出现条带，说明检测过程无实验偏差；最后，将待测样品目的条带与阳性对照或dnamarker电泳条带进行比对判断出扩增条带的大小，即可判断出该待测样本属于相应阳性对照的库蠓物种。

pcr反应体系如下：

2×estaqmastermix4.5μl

引物p1（100pmol/l）0.2μl

引物p2（100pmol/l）0.2μl

模板dna1μl

ddh2o6.6μl

总体积12.5μl。

pcr反应条件如下：

95℃预变性15min，1个循环；94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环；72℃延伸10min，1个循环；最后16℃，保存。

采用上述技术方案的有益效果是：

1、本发明采用分子技术的方法，对库蠓dna进行pcr鉴定，由于引物的特异性，可确保鉴定的准确性和可靠性；

2、本发明操作简单，有效缩短物种鉴定时间，重复性好，适宜推广；

3、与形态学鉴定相比，本发明涉及的方法只需进行pcr扩增和琼脂糖凝胶电泳，不仅弥补了形态鉴定需专业检测人员以及受诸多因素影响的缺陷，还提高了库蠓鉴定的准确性。

4、本发明直接以基因组dna为模板进行pcr，流程少，检测成本低，无需要求个体的完整性即可鉴定，具有更强的实用性。

附图说明

图1为本发明基于物种coi基因的七种蓝舌病毒媒介库蠓物种鉴定方法的技术流程图。

具体实施方式

1、库蠓的采集和保存

库蠓标本采用灯诱法和网扫法采集于野外，用无水乙醇保存。在体视镜下用解剖针将胸部分离，标记后进行分子鉴定，其余部分制成永久玻片，进行形态学鉴定，以备复鉴。

2、胸部组织dna提取

将待测蠓的胸部组织浸泡蒸馏水后，利用tianampgenomicdnakit试剂盒并按照其操作说明提取组织基因组dna，置于-20℃保存备用。

3、pcr扩增

将待鉴定蠓种的基因组dna以及阳性对照（七种库蠓dna）、阴性对照、空白对照dna作为模板，加入pcr反应体系，在待鉴定蠓种管中分别加入七种不同库蠓的特异性引物进行pcr扩增；

pcr反应体系如下：

2×estaqmastermix4.5μl

引物p1（100pmol/l）0.2μl

引物p2（100pmol/l）0.2μl

模板dna1μl

ddh2o6.6μl

总体积12.5μl。

pcr反应条件如下：

95℃预变性15min，1个循环；94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环；72℃延伸10min，1个循环；最后16℃，保存。

4、库蠓物种鉴定

取5-10μlpcr扩增产物，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，凝胶成像系统照相分析，其中空白和阴性对照若未出现条带，说明检测过程无实验偏差；再将待测样品目的条带与阳性对照或dnamarker电泳条带进行比对，其中阳性对照dna条带大小分别是c.obsoletus：375bp，c.scoticus：170bp，c.imicola：551bp，c.dewulfi：78bp，c.punctatus：430bp，c.chiopterus：320bp，c.pulicaris：265bp；最后，根据待测样品扩增条带的大小即可判断出该待测样本属于何种库蠓物种。

序列表

<120>基于物种coi基因的七种蓝舌病毒媒介库蠓物种鉴定方法

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