一种玫红巨孢囊霉菌根真菌单孢扩繁方法与流程

本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及一种玫红巨孢囊霉菌根真菌单孢扩繁方法。

背景技术：

丛枝菌根真菌(amf)能显著促进宿主植物对土壤磷素营养的吸收,因而具有作为生物肥料开发的潜力。此外，丛枝菌根真菌与宿主植物相互作用研究还是当前生物学研究热点之一。当前有关丛枝菌根真菌基础及应用研究主要集中于球囊霉目(glomerales)少数物种，这主要与该目内物种较易培养和扩繁有关。事实上，丛枝菌根真菌种类繁多、各分支之间可能存在显著的生理生态学差异，因此其基础及相关应用研究还需加入更多处于其他进化分支的物种。

玫红巨孢囊霉(gigasporarosea)，隶属于多孢囊霉目(diversisporales)、巨孢囊霉科(gigasporaceae)，近年来已逐渐成为丛枝菌根真菌研究领域的新型模式物种。针对这一真菌，目前人们主要还是采用传统的以土沙为基础基质的盆栽法对其进行扩繁，而纯净的单孢扩繁方法还未见报道。传统的盆栽扩繁法涉及育苗、接种及后期的植物生长管理等过程，操作较为复杂。重要的是，接种后的整个培养过程无法实时监控，接种植物的菌根侵染状态在最后收样之前都无法知晓。当采用单孢接种方式且接种植株多、而真正发生侵染的植株比例不高时，盆栽法无疑会增加很多不必要的劳动成本。此外，传统的盆栽法大多采用开放或半开放温室环境，扩繁的菌剂易受到其他杂菌的污染。因此，如何提供一种效果好的玫红巨孢囊霉菌根真菌单孢扩繁方法，成为了我们的研究目标。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种效果好的玫红巨孢囊霉菌根真菌单孢扩繁方法，本发明提供的扩繁方法可由单个孢子快速获得其大量子代孢子，扩繁的孢子萌发及宿主侵染活力好，可为丛枝菌根真菌基础研究及相关应用研究提供理想菌剂材料。

为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案；

本发明提供了一种玫红巨孢囊霉菌根真菌单孢扩繁方法，包括以下步骤：(1)将玫红巨孢囊霉菌根真菌单孢子接种于无蔗糖m培养基培养，得到萌发的单孢子；(2)将所述萌发的单孢子接种于胡萝卜毛状根-m培养基体系，培养，筛选，得到高产孢的玫红巨孢囊霉菌根真菌单孢繁殖系；(3)将所述高产孢的玫红巨孢囊霉菌根真菌单孢繁殖系再次接种于胡萝卜毛状根-m培养基体系，扩大培养，得到固体培养物；(4)将所述固体培养物与凝胶溶解液混合温育，淋洗过筛，得到扩繁的玫红巨孢囊霉菌根真菌孢子悬液。

优选的，步骤(1)中所述玫红巨孢囊霉单孢子接种前还包括：对所述玫红巨孢囊霉菌根真菌单孢子进行表面消毒；所述表面消毒包括：对所述玫红巨孢囊霉菌根真菌单孢子依次进行氯铵t溶液处理和混合抗生素溶液浸泡；所述氯铵t溶液的浓度为0.02g/ml；

所述混合抗生素溶液包括链霉素和庆大霉素；所述链霉素的浓度为80～100ug/ml；所述庆大霉素的的浓度为40～50ug/ml。

优选的，步骤(2)或(3)中所述胡萝卜毛状根-m培养基体系以m培养基为基础培养基，还包括3～5个胡萝卜毛状根；

所述胡萝卜毛状根的长度为5～10cm。

优选的，步骤(4)中所述固体培养物与凝胶溶解液的体积比为0.8～1.2：0.8～1.2；所述凝胶溶解液包括柠檬酸溶液和柠檬酸钠溶液；所述柠檬酸溶液和柠檬酸钠溶液的浓度分别为1.7mm和8.3mm。

优选的，步骤(1)所述培养为暗培养；所述培养的温度为23～25℃；所述培养的时间为1～2周。

优选的，步骤(2)所述培养为暗培养；所述培养的温度为23～25℃，湿度为40～70％；所述培养的时间为3～5个月。

优选的，步骤(3)所述扩大培养为暗培养；所述扩大培养的温度为23～25℃，湿度为40～70％；所述扩大培养的时间为3～5个月。

优选的，步骤(4)所述混合温育的温度为35～40℃；时间为1～2h。

优选的，步骤(4)所述淋洗过筛为无菌水湿筛倾析法过筛。

优选的，步骤(4)所述玫红巨孢囊霉菌根真菌单孢子的直径为0.080～0.200mm。

本发明提供了一种玫红巨孢囊霉单孢扩繁方法，包括以下步骤：(1)将玫红巨孢囊霉菌根真菌单孢子接种于无蔗糖m培养基培养，得到萌发的单孢子；(2)将所述萌发的单孢子接种于胡萝卜毛状根-m培养基体系，培养，筛选，得到高产孢的玫红巨孢囊霉菌根真菌单孢繁殖系；(3)将所述高产孢的玫红巨孢囊霉菌根真菌单孢繁殖系再次接种于胡萝卜毛状根-m培养基体系，扩大培养，得到固体培养物；(4)将所述固体培养物与凝胶溶解液混合温育，淋洗过筛，得到扩繁的玫红巨孢囊霉菌根真菌孢子悬液。本发明提供的扩繁方法通过第一次将萌发的单孢子接种于胡萝卜毛状根-m培养基体系培养，能够得到具有不同产孢能力的玫红巨孢囊霉菌根真菌单孢繁殖系，依据产孢数量筛选获得具有高产孢能力的单孢繁殖系；通过第二次接种于胡萝卜毛状根-m培养基体系，继续扩大培养具有高产孢能力的单孢繁殖系，能够快速获得该单孢繁殖系大量子代孢子；本发明扩繁的孢子萌发及宿主侵染活力好，且各单孢繁殖系具有单一的遗传起源，可为丛枝菌根真菌遗传学、分子生物学等基础研究及相关应用研究提供理想菌剂材料。

附图说明

图1为实施例1和2所用扩大培养装置及培养效果；

图2为实施例1和2单孢繁殖系扩繁形成的子代孢子；

图3为实施例1和2单孢繁殖系子代孢子重新侵染胡萝卜毛状根情况；

图4为对比例2所采用的基于胡萝卜毛状根的无菌双室培养体系。

具体实施方式

本发明提供了一种玫红巨孢囊霉菌根真菌单孢扩繁方法，包括以下步骤：(1)将玫红巨孢囊霉菌根真菌单孢子接种于无蔗糖m培养基培养，得到萌发的单孢子；(2)将所述萌发的单孢子接种于胡萝卜毛状根-m培养基体系，培养，筛选，得到高产孢的玫红巨孢囊霉菌根真菌单孢繁殖系；(3)将所述高产孢的玫红巨孢囊霉菌根真菌单孢繁殖系再次接种于胡萝卜毛状根-m培养基体系，扩大培养，得到固体培养物；(4)将所述固体培养物与凝胶溶解液混合温育，淋洗过筛，得到扩繁的玫红巨孢囊霉菌根真菌孢子悬液。

本发明将玫红巨孢囊霉菌根真菌单孢子接种于无蔗糖m培养基培养，得到萌发的单孢子。在本发明中，所述玫红巨孢囊霉菌根真菌单孢子优选为常规土沙基质盆栽培养的多孢菌剂，经孢子分离后得到的单孢子，所述孢子分离优选采用湿筛倾析法；所述湿筛倾析法所用筛网优选为80目和180目标准分样筛，收集直径为0.080～0.200mm的玫红巨孢囊霉菌根真菌孢子。所述培养优选在透明、无菌的培养皿中进行，在培养皿中培养能够方便、实时监测孢子的萌发和污染情况。

在本发明中，所述接种时所有孢子优选独立摆放，同一培养皿摆放多个孢子时各孢子之间至少间隔2cm以上，以避免不同孢子之间的交叉污染；所述接种的方式具体为采用移液器将玫红巨孢囊霉菌根真菌单孢子吸取至无蔗糖m培养基表面。在本发明中，所述无蔗糖m培养基优选包括80mg/lkno3、731mg/lmgso4.7h2o、65mg/lkcl、4.8mg/lkh2po4、288mg/lca(no3)2.4h2o、6mg/lmncl2.4h2o、1.5mg/lh3bo3、2.65mg/lznso4.7h2o、0.0024mg/lnamoo4.2h2o、0.13mg/lcuso4.5h2o、0.75mg/lki、8mg/lna-fe-edta、3mg/l甘氨酸、50mg/l肌醇、0.5mg/l烟酸、0.1mg/l维生素b6、0.1mg/l维生素b1和4g/l植物凝胶，ph为5.5；无蔗糖m培养基可快速诱导玫红巨孢囊霉菌根真菌孢子的萌发。在本发明中，所述培养优选为暗培养；所述培养的温度优选为23～25℃；所述培养的时间优选为1～2周。

所述玫红巨孢囊霉单孢子接种前，本发明优选还包括：对所述玫红巨孢囊霉菌根真菌单孢子进行表面消毒；所述表面消毒优选包括对所述玫红巨孢囊霉菌根真菌单孢子依次进行的氯铵t溶液浸泡和混合抗生素溶液浸泡处理；所述氯铵t溶液的浓度优选为0.02g/ml，浸泡2次，每次10min；所述混合抗生素溶液优选包括链霉素和庆大霉素；所述链霉素的浓度为80～100ug/ml；所述庆大霉素的的浓度为40～50ug/ml。所述氯铵t溶液及混合抗生素溶液的作用是对所述玫红巨孢囊霉菌根真菌单孢子进行表面消毒，以去除外源微生物污染。

得到萌发单孢子后，本发明将所述萌发的单孢子接种于胡萝卜毛状根-m培养基体系，培养，筛选，得到高产孢的玫红巨孢囊霉菌根真菌单孢繁殖系。在本发明中，所述胡萝卜毛状根-m培养基体系优选以m培养基为基础培养基，还包括3～5个胡萝卜毛状根；所述胡萝卜毛状根的长度优选为5～10cm；所述胡萝卜毛状根优选为无分支的胡萝卜毛状根。本发明对所述胡萝卜毛状根的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的即可；在本发明的实施例中，所述胡萝卜毛根采用中国科学院昆明植物研究所李爱荣提供的胡萝卜毛状根。具体的，所述胡萝卜毛状根-m培养基体系优选包括80mg/lkno3、731mg/lmgso4.7h2o、65mg/lkcl、4.8mg/lkh2po4、288mg/lca(no3)2.4h2o、6mg/lmncl2.4h2o、1.5mg/lh3bo3、2.65mg/lznso4.7h2o、0.0024mg/lnamoo4.2h2o、0.13mg/lcuso4.5h2o、0.75mg/lki、8mg/lna-fe-edta、3mg/l甘氨酸、50mg/l肌醇、0.5mg/l烟酸、0.1mg/l维生素b6、0.1mg/l维生素b1、10g/l蔗糖、4g/l植物凝胶、3～5个胡萝卜毛状根，ph优选为5.5。在本发明中，所述高产孢玫红巨孢囊霉菌根真菌单孢繁殖系优选为产孢数量大于30个的玫红巨孢囊霉菌根真菌单孢繁殖系；本发明通过在m培养基中接种3～5根胡萝卜毛状根获得胡萝卜毛状根-m培养基体系，体系中的毛状根为萌发的单孢子扩繁提供宿主组织，供其菌丝侵染及产孢。每一个单孢形成的所有子代孢子构成一个单孢繁殖系。在本发明中，所述培养优选为暗培养；所述培养的温度优选为23～25℃，湿度优选为40～70％，培养时间优选为3～5个月。在本发明中，所述培养优选在透明、无菌的培养皿中进行，因而可随时在体式显微镜下进行观察，及时去除不侵染或污染的单孢子。另外，透明的无菌培养皿还便于统计产生的孢子数量，从而快速筛选出高产孢能的玫红巨孢囊霉菌根真菌单孢繁殖系。

得到高产孢的玫红巨孢囊霉菌根真菌单孢繁殖系后，本发明将所述单孢繁殖系再次接种于胡萝卜毛状根-m培养基体系，扩大培养，得到固体培养物。本发明再次接种用胡萝卜毛状根-m培养基体系的组成范围与前文所述胡萝卜毛状根-m培养基体系一致，在此不再赘述。所述培养优选为暗培养；所述培养的温度优选为23～25℃，湿度优选为40～70％；所述培养的时间优选为3～5个月。本发明将高产孢能力的单孢繁殖系再次接种于胡萝卜毛状根-m培养基体系，扩大培养能够得到含有大量子代孢子的固体培养物。在本发明中，所述扩大培养优选在透明、无菌的组培瓶中进行，组培瓶体积可根据需要自由选择；使用透明组培瓶便于及时发现并去除污染的单孢繁殖系。

得到固体培养物后，本发明将所述固体培养物与凝胶溶解液混合温育，淋洗过筛，得到扩繁的玫红巨孢囊霉菌根真菌孢子悬液。在本发明中，所述固体培养物与凝胶溶解液的体积比为0.8～1.2：0.8～1.2；所述凝胶溶解液优选包括柠檬酸溶液和柠檬酸钠溶液，能高效溶解m培养基中的植物胶凝固剂；所述柠檬酸溶液和柠檬酸钠溶液的浓度分别优选为1.7mm和8.3mm。所述混合温育的温度优选为35～40℃；时间优选为1～2h。在本发明中，所述淋洗过筛优选为无菌水淋洗湿筛倾析法过筛，所述过筛优选采用80目与180目标准分样筛组合；为保证获得的孢子悬液无杂菌污染，本发明所述湿筛倾析法过筛需在无菌超净台中实施。本发明将所述固体培养物与凝胶溶解液混合温育，能够溶解固体培养基，然后通过淋洗过筛去除溶解的培养基，获得干净的扩繁孢子。

所述淋洗过筛前，本发明优选还包括对混合温育所得培养物进行搅拌，搅拌能够切碎胡萝卜毛状根及菌丝，便于后续过筛时孢子与菌丝及毛状根分离、提高溶解培养物中孢子的回收率。

获得玫红巨孢囊霉孢子悬液后，本发明优选还包括对新生孢子进行萌发活力及宿主侵染活力检测。在本发明中，所述孢子萌发活力检测的方式具体为：采用移液器随机吸取100个孢子，置于无蔗糖液体m培养基中，25℃暗培养2周后统计其萌发率；所述孢子宿主侵染活力检测的方式具体为：采用移液器随机吸取20个孢子，接种于胡萝卜毛状根，培养2个月后检查侵染情况。

下面结合实施例对本发明提供的一种玫红巨孢囊霉菌根真菌单孢扩繁方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

准备：玫红巨孢囊霉(gigasporarosea)菌根真菌菌剂，采用常规盆栽法由多孢扩繁所得，为孢子、菌丝及侵染根段及土沙基质混合物，由法国国家科学研究中心christopheroux教授提供；胡萝卜毛状根，由中国科学院昆明植物研究所李爱荣老师提供，用m培养基继代保存于本课题组。

(1)玫红巨孢囊霉菌根真菌孢子的分离、筛选及表面消毒：称取5g菌剂，采用湿筛倾析法，收集80目与180目分样筛之间的孢子；体式显微镜下，用移液器吸取颜色、质地相对均一的孢子进行表面消毒；消毒方法为：冰上0.02g/ml氯铵t溶液浸泡处理两次，每次10min，然后浸泡于混合抗生素溶液中；所述混合抗生素溶液是以无菌超纯水配置终浓度为100ug/ml的链霉素与50ug/ml的庆大霉素混合溶液。

(2)将玫红巨孢囊霉菌根真菌单孢子接种于无蔗糖m培养基培养，得到无菌萌发的单孢子，具体如下：

借助体式显微镜，在超净台中用移液器吸取20个表面已消毒的孢子至无蔗糖m培养基表面，于25℃暗培养室萌发2周。为避免不同孢子之间的交叉污染，所有孢子均独立摆放，同一培养皿中的多个孢子相互之间留3cm的间隔；

所述无蔗糖m培养基包括80mg/lkno3、731mg/lmgso4.7h2o、65mg/lkcl、4.8mg/lkh2po4、288mg/lca(no3)2.4h2o、6mg/lmncl2.4h2o、1.5mg/lh3bo3、2.65mg/lznso4.7h2o、0.0024mg/lnamoo4.2h2o、0.13mg/lcuso4.5h2o、0.75mg/lki、8mg/lna-fe-edta、3mg/l甘氨酸、50mg/l肌醇、0.5mg/l烟酸、0.1mg/l维生素b6、0.1mg/l维生素b1和4g/l植物凝胶，ph为5.5。

(3)将无菌萌发的单孢子接种于胡萝卜毛状根-m培养基体系，培养得到多个具有不同产孢能力的玫红巨孢囊霉菌根真菌单孢繁殖系，具体如下：

于超净台中，借助体式显微镜选取5个萌发较早、萌发管较长的孢子，用无菌解剖刀将单个孢子连同其萌发管及其附近培养基块接种于胡萝卜毛状根-m培养基体系(边长为12.5cm培养皿)，然后置于温度为25℃、湿度为50％的暗培养室中共培养4个月，期间每周检测一次，4个月时能观察到4个单孢都形成了数量不等的子代孢子；每一个单孢形成的所有子代孢子构成一个单孢繁殖系；

(4)在步骤(3)所得单孢繁殖系中挑选一个产孢数量大于30的高产孢单孢繁殖系，记为grspore-2，将该高产孢单孢繁殖系再次接种于胡萝卜毛状根-m培养基体系，扩大培养得到含有大量子代孢子的固体培养物，(扩大培养效果如图1左侧所示)，接种培养方式具体如下：

将grspore-2单孢繁殖系的所有孢子连同其附近胡萝卜毛状根转移至一个预装有一半体积m培养基的500ml组培瓶(图1)，于25℃、50％湿度暗培养室中继续扩大培养5个月后观察到大量子代孢子的形成；

(5)将组培瓶中的扩大培养物与凝胶溶解液混合温育，溶解后淋洗过筛，得到扩繁的玫红巨孢囊霉菌根真菌孢子悬液，具体如下：

于超净台中将步骤(4)得到的组培瓶里扩大培养物转移至无菌搅拌杯中，加入等体积凝胶溶解液，于40℃恒温箱温育2h以溶解植物凝胶；将搅拌杯置于搅拌机上中速搅拌5s，切碎胡萝卜毛状根及菌丝，过无菌80目和180目不锈钢分样筛，然后再用1l无菌水淋洗筛网，最后倾析收集180目分样筛上的孢子，获得扩繁孢子悬液。

所用凝胶溶解液为17ml0.1m的柠檬酸(citricacid)水溶液和83ml0.1m的柠檬酸钠(sodiumcitrate)水溶液，混合后用超纯水定容至1l，高压蒸汽灭菌制得。

实施例2

按照实施例1的方法进行玫红巨孢囊霉菌根真菌扩繁，区别在于：步骤(4)选取了另外一个高产孢单孢繁殖系，编号为grspore-3进行扩大培养(扩大培养效果如图1右侧所示)。

扩繁孢子悬液中孢子数量检测：于超净台中用无菌滴管分别吸取1ml实施例1和实施例2的步骤(5)所得扩繁孢子悬液置于两个培养皿中，加适量蒸馏水稀释后于体式显微镜下统计孢子数量，结果如表1所示。其中，扩繁的总孢子数计算公式为：1ml悬液孢子数×总孢子悬液体积(ml)。

扩繁孢子萌发活力检测：于超净台中用移液器分别吸取100个实施例1和2步骤(5)所得的扩繁孢子，置于无蔗糖液体m培养基中，25℃暗培养2周，统计其萌发率，结果如表1所示。

扩繁孢子宿主侵染活力检测：于超净台中用移液器分别吸取20个实施例1和2步骤(5)所得的扩繁的真菌孢子，再次接种于胡萝卜毛状根-m培养基体系(边长为12.5cm培养皿)，培养2个月后检查侵染情况，结果如表1以及图3所示。

其中，图2左侧为实施例1扩繁孢子；图2右侧为实施例2扩繁孢子；图3左侧为实施例1扩繁孢子的侵染情况；图3右侧为实施例2扩繁孢子的侵染情况。由图2和图3可见，实施例1和2扩繁孢子的宿主侵染活力好；由表1可知，本发明扩繁的子代孢子数量较多，扩繁孢子萌发率较高。

表1实施例1～2扩繁所得孢子性能测试效果

对比例1

采用目前最常用的盆栽培养法。

(1)将与实施例1同一批的玫红巨孢囊霉菌根真菌单孢子接种于无蔗糖m培养基培养，得到萌发单孢子；

借助体式显微镜，在超净台中用移液器吸取20个表面已消毒的孢子至无蔗糖m培养基表面，于25℃暗培养室萌发2周。为避免不同孢子之间的交叉污染，所有孢子均独立摆放，相互之间留3cm的间隔；

(2)采用常规盆栽法，将5个所述萌发单孢子接种于韭葱宿主，5个月后检查侵染及新生孢子形成情况。

检查结果显示：仅有1个单孢接种盆栽出现明显侵染，形成了典型的丛枝菌根结构及17个新生孢子。由此可见，采用传统的盆栽培养方法玫红巨孢囊霉菌根真菌单孢扩繁成功率不高，这可能与接种过程中幼嫩萌发管易受到伤害有关。盆栽法尽管操作步骤较少，但接种宿主后的侵染及新生孢子的形成过程均无法实时监测，因而不能及时剔除那些侵染活力或产孢能力低下的单孢；此外，由于常规盆栽培养通常是在开放或半开放的人工温室环境中进行，其产生的孢子还存在着其他杂菌的污染。相对而言，本发明则可以有效地避免常规盆栽扩繁法存在的问题，即孢子的接种、共培养及后续扩繁产孢过程均在透明、无菌的培养皿或组培瓶中进行，扩繁过程可随时在体式显微镜下进行无损观察。一旦发现有不侵染、污染或产孢能力低下的单孢，可立即终止该单孢繁殖系建立或扩大培养过程，有效避免不必要的劳动付出，快速筛选出具有高产孢能力的单孢子；其次，本发明产生的孢子为无杂菌污染的孢子，可直接应用于无菌实验，为精细的菌根真菌遗传学、分子生物学等基础研究提供理想的菌剂。

对比例2

采用目前国际上最常用的无菌双室培养法。

(1)将与实施例1同一批的玫红巨孢囊霉菌根真菌单孢子接种于无蔗糖m培养基培养，得到萌发单孢子；

借助体式显微镜，在超净台中用移液器吸取20个表面已消毒的孢子至无蔗糖m培养基表面，于25℃暗培养室萌发2周。为避免不同孢子之间的交叉污染，所有孢子均独立摆放，相互之间留3cm的间隔；

(2)将萌发单孢子按照经典的双室培养法进行扩繁(st-arnaud,m.,etal."enhancedhyphalgrowthandsporeproductionofthearbuscularmycorrhizalfungusglomusintraradicesinaninvitrosystemintheabsenceofhostroots."mycologicalresearch100.3(1996):328-332.)；

对比例2所采用的基于胡萝卜毛状根的无菌双室培养体系培养结果如图4所示：玫红巨孢囊霉菌根真菌在菌丝室中菌丝生长缓慢、且没有新生孢子形成。实验证明该方法并不适合玫红巨孢囊霉菌根真菌。

由以上实施例可知，本发明提供的扩繁方法可由单个孢子快速获得其大量子代孢子，扩繁的孢子萌发及宿主侵染活力好，可为丛枝菌根真菌遗传学、基础分子生物学等基础研究及相关应用研究提供理想菌剂材料。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。