一种与鸭喙色性状相关的分子标记及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种与鸭喙色性状相关的分子标记及其应用。

背景技术：

鸭喙色属于质量性状，是肉鸭重要的外观性状。在肉鸭育种中，可将鸭喙色性状作为一种品种外在特征标记，以实现品种间的甄别，以及在配套系中应用喙色性状的遗传规律实现对种源的控制。此外，喙色也是消费者选购肉鸭的考虑因素之一，黄色喙的肉鸭，由于喙色颜色鲜艳，往往受消费者的青睐。因此，研究和开发利用鸭喙色的遗传机制，具有重要的经济价值和生产意义。

鸭粉色喙相对黄喙为显性，如果建立粉色喙纯系群体，根据遗传规律，要实现全部个体在喙色基因位点的基因型为纯合基因型。根据常规表型选种，选择粉色个体留种，会混入部分杂合基因型个体，导致纯繁后代会分离出黄色喙表型个体。如果想选育出粉喙的纯系群体，以往需要通过详细的系谱资料和后裔测定，推测出基因型后，才能通过选留达成目的。

鸭喙色有多种类型，由不同的基因位点所决定。我们前期研究通过全基因组关联分析(gwas)筛选到与鸭黄色喙和粉色喙相关的分子标记。经过分析，鸭粉色喙相对黄喙为显性，粉色喙个体的基因型为纯合或者杂合，而黄色喙个体的基因型为纯合。通过对鸭喙色分子标记的检测和应用，即可从分子水平快速、准确判断鸭黄色喙、粉色喙的基因型。

因此，从分子水平快速、准确判断鸭黄色喙、粉色喙的基因型的分子标记及其应用有待研究。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明旨在提供一种与鸭喙色性状相关的分子标记及其应用，本发明的分子标签，可快速对粉色喙个体基因型进行鉴定，区分开粉色喙中纯合和杂合个体，通过选留基因型纯合个体，可保证该群体留种的后代全部为粉色喙个体。

为了达到上述的目的，本发明所采用的技术方案是：

一种与鸭喙色性状相关的分子标记，所述分子标记位于与鸭喙色性状相关的核苷酸序列seqidno.1上；所述分子标记具体为位于seqidno.1所示的核苷酸序列的第23-26位点的长度为4bp的插入/缺失序列，所述分子标记为插入序列时，该分子标记的核苷酸序列如seqidno.2。

进一步的，seqidno.1的序列如下：

ccactgaatttaaataaataagtaagaagtttttctacccgtagtacaaaggct。

进一步的，seqidno.2的序列如下：taag。

进一步的，所述与鸭喙色性状相关的分子标记的应用，包括以下步骤：

(1)采集待测鸭个体的生物检材，提取待测鸭个体生物检材的基因组dna；

(2)以所提取基因组dna为模板，设计特异性扩增引物，再以步骤(1)的dna为模板进行pcr扩增反应，获得pcr产物；

(3)将步骤(2)得到的pcr产物电泳检测，然后测定基因序列，通过基因测序序列和峰图判定鸭喙色基因型。

进一步的，所述步骤(1)中，待测鸭个体生物检材的基因组dna为鸭翅下静脉血样基因组dna、皮肤样品基因组dna或毛囊样品基因组dna。

进一步的，所述步骤(2)的特异性扩增引物序列为：

上游引物(5’—3’)：aagtcttatccaggtccagtca(seqidno.4)；

下游引物(5’—3’)：ttctcttcacgcttcatttgt(seqidno.5)。

进一步的，步骤(2)中，反应体系为20ul，包括上下游引物各0.5ul、模板dna2ul、dntp1.5ul、taqdna聚合酶1ul、灭菌去离子水12.5ul和10×solutionbuffer2ul。

进一步的，步骤(2)中，反应程序为：95℃变性5min；然后95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，重复30个循环；最后12℃保存pcr产物。

进一步的，步骤(3)中，利用1％浓度琼脂糖凝胶电泳分离pcr产物，以dl2000作为dnamarker，goldviewi作为dna染色剂。

进一步的，步骤(3)中，判定鸭喙色对应的基因型：若pcr产物的核苷酸序列为seqidno.3，待测鸭个体为纯合粉色喙；若pcr产物的核苷酸序列为seqidno.1，待测鸭个体为纯合黄色喙或杂合粉色喙。seqidno.3的序列为：ccactgaatttaaataaataagaagtttttctacccgtagtacaaaggct。

本发明的有益效果：

(1)本发明研究开发的分子标签，可快速对粉色喙个体基因型进行鉴定，区分开粉色喙中纯合和杂合个体，通过选留基因型纯合个体，可保证该群体留种的后代全部为粉色喙个体；

(2)本发明分子标签选择鸭喙色基因型，减少了以往费事、费力和投入大的问题，可以实现肉鸭粉色纯系群体的快速选择，可以应用在肉鸭地方品种资源开发和商业化品种种源控制，具有较强的应用价值。

附图说明

图1为利用分子标记检测3种基因型鸭的测序结果图。

具体实施方式

为了进一步说明本发明的技术效果，下面通过实施例对本发明进行具体描述。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

(1)基因型的测定

从鸭翅下静脉采集血样，共采集9周龄鸭225个体，血样标号与翅号对应。获得的血样采用苯酚-氯仿法提取dna。采用纳米粒电泳和琼脂糖凝胶电泳检测dna的质量和数量。使用标准过程为每个合格dna样本建成cdna文库。所有文库采用简化基因组测序，双末端读长150bp(pe150)。

使用带有默认参数的ngsqc(v2.3.3)工具包过滤原始读取数据。使用默认参数，使用burrows-wheeleralignment(bwaaln)将cleanreads分别mapping到鸭参考基因组(iascaas_pekingduck_pbh1.5，gcf_003850225.1)。使用gatk(版本3.5)收集全基因组范围的单核苷酸突变位点(snp)信息，输出的snp使用vcftools(版本0.1.15)进一步过滤，设置参数为最小等位基因频率(maf)>0.05、最大等位基因频率<0.99、最大缺失率<0.1。所有筛选的snp均匀分布在鸭29条常染色体、chrz、chrw和chru(未组装)上。

(2)表型的测定

观察225鸭喙颜色，逐一记录其表型(粉色、黄色)，并将其翅号记录清楚。

(3)全基因组关联分析(gwas)

使用混合线性模型程序emmax进行全基因组关联分析(genomewideassociationanalysis,gwas)，分析每一snp位点基因频率与表型的相关性。在混合模型中，用前三个主成分值(pca特征向量)作为为固定效应。通过分析，在鸭25号染色体上获得与喙色颜色(粉色、黄色)显著关联区域。

(4)分子标记的筛选和引物设计

通过对该区域snp位点进一步分析，发现了本申请专利中的分子标记位点，该位点可将黄色喙鸭和粉色黄区分开。通过对包含此snp位点的dna区域设计pcr扩增引物，以及验证扩增的可靠性和效率，最终形成了用于本专利的检测引物。

实施例1

本发明的应用，包括以下步骤：

1)采集多组粉色喙鸭和黄色喙鸭的生物检材，从鸭翅下静脉采集血样，提取血样的基因组dna；

2)以所提取基因组dna为模板，通过pcr引物进行常规pcr反应；

上游引物(5’—3’)：aagtcttatccaggtccagtca(seqidno.4)；

下游引物(5’—3’)：ttctcttcacgcttcatttgt(seqidno.5)。

反应体系为20ul，包括上下游引物各0.5ul，模板dna2ul，dntp1.5ul，taqdna聚合酶1ul，灭菌去离子水12.5ul，10×solutionbuffer2ul。反应程序为：95℃变性5min；(95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸50s)×30个循环；12℃保存反应产物。

3)利用1％浓度琼脂糖凝胶电泳分离pcr产物，以dl2000作为dnamarker，goldviewi作为dna染色剂；根据电泳条带，判断pcr是否成功。

4)将pcr产物电泳检测合格样品送至生物公司进行序列测定，根据基因测序峰图判定鸭喙色基因型。

5)如图1所示，粉色喙表型个体在图箭头所示位点位置有taag四个碱基缺失，对应的基因型为-/-(纯合)；粉色喙表型个体在图箭头所示位点位置无taag四个碱基缺失，对应个体基因型为+/-(杂合)；黄色喙表型个体在图箭头所示位点位置无taag四个碱基缺失，对应个体基因型为+/+(纯合)。

最后需要说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，本领域技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。

序列表

<110>四川农业大学

<120>一种与鸭喙色性状相关的分子标记及其应用

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>2

<211>54

<212>dna

<213>anasplatyrhynchos

<400>2

ccactgaatttaaataaataagtaagaagtttttctacccgtagtacaaaggct54

<210>3

<211>4

<212>dna

<213>anasplatyrhynchos

<400>3

taag4

<210>4

<211>50

<212>dna

<213>anasplatyrhynchos

<400>4

ccactgaatttaaataaataagaagtttttctacccgtagtacaaaggct50

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

aagtcttatccaggtccagtca22

<210>5

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

ttctcttcacgcttcatttgt21