基于AS-PCR技术快速检测二化螟鱼尼丁受体基因突变的方法与流程

本发明属于基因突变鉴定
技术领域：
，具体涉及一种基于as-pcr技术快速检测二化螟鱼尼丁受体基因突变的方法。
背景技术：
：二化螟(chilosuppressalis，walker)属于鳞翅目螟蛾科(lepidoptera:pyrlidae)，是我国水稻上危害最为严重的害虫之一。长期以来，二化螟的防治主要依靠化学防治。双酰胺类杀虫剂作用于昆虫ryr(ryanodinereceptor,ryr)，使昆虫ryr的ca2+通道打开，促使ca2+从内质网膜中释放出来，引起细胞质中钙离子浓度上升，使肌肉细胞完成一次收缩，且持续的ca2+释放导致虫体不断收缩，进而停止进食、抽搐、呕吐、致昏，最终死亡。由于其独特的杀虫机制和对鳞翅目害虫具有良好的防治效果，同时对哺乳动物安全，且与其它常用杀虫药剂间无交互抗性，逐步成为我国防治二化螟的首选药剂，在水稻上推广使用。但由于不合理使用，使其存在很大的抗性风险，多种害虫的田间种群出现该类药剂防治效果下降和对其产生了抗药性。如田间小菜蛾(plutellaxylostella)、茶小卷夜蛾(adoxophyeshonmai)、番茄潜叶蛾(tutaabsoluta)和二化螟已经对双酰胺类杀虫剂产生了抗性。近年来已经在一些鳞翅目害虫中发现导致其对双酰胺类抗性发展的靶标突变位点。目前关于二化螟抗药性的监测大都局限于室内药剂毒力生物测定，尚未见到相关快速检测的报道，然而，生测结果并不能对靶标抗性产生精准判断，并且存在实验周期长，虫量需求大等缺点，因此在生产实践中需要一种能够快速检测二化螟抗性突变的方法。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供鉴定二化螟鱼尼丁受体基因突变的引物组及其鉴定方法，基于as-pcr技术即可进行快速鉴定，通过对扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果来判断二化螟对双酰胺类杀虫剂的敏感性，稳定性好，准确性高，且试验周期短，虫量需求小。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一组鉴定二化螟鱼尼丁受体基因突变的引物组，所述引物组包括独立包装的4组as-pcr引物，所述引物组针对y4667c、y4667d、i4758m和y4891f位点设计得到；每组所述as-pcr引物包括抗性引物对和敏感引物对，所述敏感引物对包括上游抗性引物f-rr和下游引物r；所述敏感引物对包括上游敏感引物f-ss和下游引物r；所述抗性引物对和敏感引物对的下游引物r相同；其中针对y4667c设计的上游敏感引物y4667cf-ss的核苷酸序列如seqidno.1所示，上游抗性引物y4667cf-rr的核苷酸序列如seqidno.2所示，下游引物y4667cr的核苷酸序列如seqidno.3所示；针对y4667d设计的上游敏感引物y4667df-ss的核苷酸序列如seqidno.4所示，上游抗性引物y4667df-rr的核苷酸序列如seqidno.5所示，下游引物y4667dr的核苷酸序列如seqidno.3所示；针对i4758m设计的上游敏感引物i4758mf-ss的核苷酸序列如seqidno.6所示，上游抗性引物i4758mf-rr的核苷酸序列如seqidno.7所示，下游引物i4758mr的核苷酸序列如seqidno.8所示；针对y4891f设计的上游敏感引物y4891ff-ss的核苷酸序列如seqidno.9所示，上游抗性引物y4891ff-rr的核苷酸序列如seqidno.10所示，下游引物y4891fr的核苷酸序列如seqidno.11所示。本发明提供了一种鉴定二化螟鱼尼丁受体基因突变的试剂，所述试剂中包括所述引物组的水溶液。本发明提供了一种鉴定二化螟鱼尼丁受体基因突变的试剂盒，所述试剂盒中包括所述引物组或所述试剂。本发明提供了一种鉴定二化螟鱼尼丁受体基因突变的方法，包括以下步骤：以二化螟基因组dna为模板，分别以所述引物组为引物进行as-pcr，对得到的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳；当只有敏感引物对的扩曾产物的电泳条带显示出有条带，而抗性引物对的电泳条带显示无条带时，说明检测的模板为未突变个体；当敏感引物对和抗性引物对的电泳条带都显示条带时，说明检测的模板为杂合突变个体；当敏感引物对的电泳条带显示无条带，而抗性引物对的电泳显示有条带时，说明检测的模板为纯合突变个体。优选的，所述as-pcr的体系以25μl计，包括：10×extaqbuffer2.5μl，dntpmixture2μl，上游抗性引物f-rr或上游敏感引物f-ss0.5μl，下游引物r0.5μl，模板dna1μl，extaqdna聚合酶0.25μl和ddh2o18.25μl。优选的，所述as-pcr的程序包括：94℃预变性3min；94℃变性20s，57℃退火20s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸2min。优选的，在判断出二化螟鱼尼丁受体基因是否突变后，还包括扩增鉴定，所述扩增的引物对分别包括上游引物f和下游引物r；其中根据y4667c或y4667d设计的引物y4667cf或y4667df的核苷酸序列如seqidno.12所示，y4667cr或y4667dr的核苷酸序列如seqidno.3所示；根据i4758m设计的引物i4758mf的核苷酸序列如seqidno.13所示，i4758mr的核苷酸序列如seqidno.8所示；根据y4891f设计的引物y4891ff的核苷酸序列如seqidno.14所示，y4891fr的核苷酸序列如seqidno.11所示。本发明提供了一组鉴定二化螟鱼尼丁受体基因突变的引物组，以待测二化螟基因组dna为模板，分别采用敏感引物对和抗性引物对进行pcr扩增，通过对扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果来判断二化螟对双酰胺类杀虫剂的敏感性。本发明所述引物组基于y4667c/d、i4758m和y4891f四个位点设计，克隆片段长度分别为198bp、133bp和146bp。在本发明实施例中，对单头二化螟基因组进行pcr扩增，测序后结果显示，敏感/抗性纯合子在突变位置为单一峰图，而杂合子为双峰，与as-pcr检测结果一致。附图说明图1为利用y4667c设计的引物进行的鉴定结果图，其中a为田间抗性品系和敏感品系的二化螟个体为模板，分别采用csryry4667c敏感引物对和抗性引物对进行pcr扩增，pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；b为二化螟基因组鱼尼丁受体基因y4667c扩增产物测序的峰图；敏感/抗性纯合子在突变位置tac(ta/gc)为单一峰图，而杂合子为双峰，与as-pcr检测结果一致；图2为利用y4667d设计的引物进行的鉴定结果图，其中a为田间抗性品系和敏感品系的二化螟个体为模板，分别采用csryry4667d敏感引物对和抗性引物对进行pcr扩增，pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；b为二化螟基因组鱼尼丁受体基因y4667d扩增产物测序的峰图，敏感/抗性纯合子在突变位置tac(t/gac)为单一峰图，而杂合子为双峰，与as-pcr检测结果一致；图3为利用i4758m设计的引物进行的鉴定结果图，其中a为田间抗性品系和敏感品系的二化螟个体为模板，分别采用csryri4758m敏感引物对和抗性引物对进行pcr扩增，pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；b为二化螟基因组鱼尼丁受体基因i4758m扩增产物测序的峰图，敏感/抗性纯合子在突变位置ata(ata/g)为单一峰图，而杂合子为双峰，这与as-pcr检测结果一致；图4为利用y4891f设计的引物进行的鉴定结果图，其中a为田间抗性品系和敏感品系的二化螟个体为模板，分别采用csryry4891f敏感引物对和抗性引物对进行pcr扩增，pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；b为二化螟基因组鱼尼丁受体基因y4891f扩增产物测序的峰图，敏感/抗性纯合子在突变位置tac(ta/tc)为单一峰图，而杂合子为双峰，与as-pcr检测结果一致。具体实施方式本发明提供了一组鉴定二化螟鱼尼丁受体基因突变的引物组，所述引物组包括独立包装的4组as-pcr引物，所述引物组针对y4667c、y4667d、i4758m和y4891f位点设计得到；每组所述as-pcr引物包括抗性引物对和敏感引物对，所述敏感引物对包括上游抗性引物f-rr和下游引物r；所述敏感引物对包括上游敏感引物f-ss和下游引物r；所述抗性引物对和敏感引物对的下游引物r相同；其中针对y4667c设计的上游敏感引物y4667cf-ss的核苷酸序列如seqidno.1所示，上游抗性引物y4667cf-rr的核苷酸序列如seqidno.2所示，下游引物y4667cr的核苷酸序列如seqidno.3所示；针对y4667d设计的上游敏感引物y4667df-ss的核苷酸序列如seqidno.4所示，上游抗性引物y4667df-rr的核苷酸序列如seqidno.5所示，下游引物y4667dr的核苷酸序列如seqidno.3所示；针对i4758m设计的上游敏感引物i4758mf-ss的核苷酸序列如seqidno.6所示，上游抗性引物i4758mf-rr的核苷酸序列如seqidno.7所示，下游引物i4758mr的核苷酸序列如seqidno.8所示；针对y4891f设计的上游敏感引物y4891ff-ss的核苷酸序列如seqidno.9所示，上游抗性引物y4891ff-rr的核苷酸序列如seqidno.10所示，下游引物y4891fr的核苷酸序列如seqidno.11所示。本发明所述引物组的信息具体如表1所示：表1引物组信息名称序列seqidnoy4667cf-sscgaaacttctacaacctgaacta1y4667cf-rrcgaaacttctacaacctgaactg2y4667crctgctcctacacttctgatat3y4667df-sscgaaacttctacaacctgaggt4y4667df-rrcgaaacttctacaacctgaggg5y4667drctgctcctacacttctgatat3i4758mf-ssctatcgtgtctctggccgta6i4758mf-rrctatcgtgtctctggccgtg7i4758mrttgcggtgataatgggcagt8y4891ff-sscgttcctctactctctatgcta9y4891ff-rrcgttcctctactctctatgctt10y4891frctgtttcccattatgggtgaca11本发明利用所述y4667c或y4667d位点设计的引物组进行的as-pcr的扩增条带优选为198bp，其序列优选如seqidno.15所示：cgaaacttctacaacctgaagtacgtcgcgttagtgctcgccttctgcatcaacttcgtactgctgttttataaggtgagtaagtttattatttcgtgggggaattatacatgaaagattattcgctttttttacataagaatgagactaggaattattttggaggaaaacagtcgcatatcagaagtgtaggagcag；利用i4758m位点设计得到的引物组进行的as-pcr的扩增条带优选为133bp，其序列优选如seqidno.16所示：ctatcgtgtctctggccatactcataggatactatcatctcaaggtgagaactaaaatagaccatagagcagtgttataaaaatcattactttttttgtgtatatggaagaaaactgcccattatcaccgcaa；利用y4891f位点设计得到的引物组进行的as-pcr的扩增条带优选为146bp，其序列优选如seqidno.17所示：cgttcctctactctctatggtacttctcgttctctgtcatgggcaacttcaacaacttcttcttcgccgcccatttactagacgtcgctgtgggattcaagaccttgaggaccatattgcagtctgtcacccataatgggaaacag。本发明提供了一种鉴定二化螟鱼尼丁受体基因突变的试剂，所述试剂中包括所述引物组的水溶液。本发明所述试剂的工作浓度优选为10μm。本发明还提供了一种鉴定二化螟鱼尼丁受体基因突变的试剂盒，所述试剂盒中包括所述引物组或所述试剂。本发明所述试剂盒中优选还包括10×extaqbuffer、dntpmixture和extaqdna聚合酶。本发明还提供了一种鉴定二化螟鱼尼丁受体基因突变的方法，包括以下步骤：以二化螟基因组dna为模板dna，以所述引物组为引物进行as-pcr，对得到的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，当只有敏感引物对的扩曾产物的电泳条带显示出有条带，而抗性引物对的电泳条带显示无条带时，说明检测的模板为未突变个体；当敏感引物对和抗性引物对的电泳条带都显示条带时，说明检测的模板为杂合突变个体；当敏感引物对的电泳条带显示无条带，而抗性引物对的电泳显示有条带时，说明检测的模板为纯合突变个体。以y4667c为例，当只有敏感引物对(由上游敏感引物y4667cf-ss和下游引物y4667cr组成)的扩曾产物电泳条带显示有条带，而抗性引物对(由上游抗性引物y4667cf-rr和下游引物y4667cr组成)的电泳条带显示无条带时，检测模板为未突变个体；当敏感引物对(由上游敏感引物y4667cf-ss和下游引物y4667cr组成)和抗性引物对(由上游抗性引物y4667cf-rr和下游引物y4667cr组成)的扩曾产物的电泳条带都显示有条带时，检测的模板为杂合突变个体；当只有抗性引物对的扩曾产物电泳条带显示有条带，而敏感引物对(由上游敏感引物y4667cf-ss和下游引物y4667cr组成)电泳条带显示无条带时，检测模板为纯合突变个体。本发明对所述二化螟基因组dna的提取方法并没有特殊限定，利用本领域的常规dna提取方法即可。本发明进行所述as-pcr时，分别独立进行，所述as-pcr的体系以25μl计，优选包括：10×extaqbuffer2.5μl，dntpmixture2μl，上游抗性引物f-rr或上游敏感引物f-ss0.5μl，下游引物r0.5μl，模板dna1μl，extaqdna聚合酶0.25μl和ddh2o18.25μl。本发明所述as-pcr的程序优选包括：94℃预变性3min；94℃变性20s，57℃退火20s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸2min。本发明在判断出二化螟鱼尼丁受体基因是否突变后，优选还包括扩增鉴定，所述扩增的引物对分别包括上游引物f和下游引物r；其中针对y4667c或y4667d设计的引物y4667cf或y4667df的核苷酸序列如seqidno.12所示：tctaatacaacaggcggtccaag，y4667cr或y4667dr的核苷酸序列如seqidno.3所示：ccacgaaataataaacttactcacc；针对i14758m设计的引物i4758mf的核苷酸序列如seqidno.13所示：agtggttcacatagacgaggac，i4758mr的核苷酸序列如seqidno.8所示：caagcctgcgtgctatctct；针对y4891f设计的引物y4891ff的核苷酸序列如seqidno.14所示：tggcgttaccaagtgtggaagg，y4891fr的核苷酸序列如seqidno.11所示：ctgtttcccattatgggtgaca。本发明所述扩增鉴定的pcr体系和程序分别与上述as-pcr的体系和程序相同，在此不再赘述，将得到的扩增产物进行测序，敏感/抗性纯合子在突变位置为单一峰图，而杂合子为双峰。下面结合实施例对本发明提供的一组鉴定二化螟鱼尼丁受体基因突变的引物组及鉴定方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例11、单头二化螟基因组dna的提取(1)配制提取液a：1％(g/ml)sds，50mmol/ltris·hcl，25mmol/lnacl，25mmol/ledta；提取液b：3mol/lkac，ph＝7.2。上述两提取液的溶剂均为超纯水，室温保存；(2)将单头二化螟试虫置于无菌2.0ml的ep离心管中，放入灭菌后的钢珠，加入200μl的提取液a，用研磨仪进行研磨；(3)将匀浆后的样品65℃水浴1h，每隔15min震荡混匀，加速组织裂解；(4)加入等体积(200μl)的提取液b，涡旋震荡混匀，冰浴2h；(5)10000×g离心15min，小心将上清液转移到另一个无菌1.5mlep离心管中；(6)加入3倍体积(600μl)预冷的无水乙醇，涡旋震荡混匀，-20℃放置2h；(7)10000×g离心15min，弃尽上清液，用70％(ml/ml)乙醇(现配现用)清洗两次；(8)用移液器吸尽管底70％(ml/ml)乙醇，空气干燥沉淀20min，加入30μl灭菌水溶解，-20℃保存备用。2、等位基因特异性pcr扩增及电泳检测(1)在200μl灭菌pcr管中建立总体积为25μl的反应体系(表2)：表2as-pcr反应体系其中引物序列分别如表1中所示。(2)按以下程序进行pcr扩增：94℃预变性3min；30轮循环：94℃变性20s，57℃退火20s，72℃延伸20s；72℃延伸2min。(3)电泳检测：取10μl扩增产物用2.0％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳缓冲液为1×tae，恒压(120mv)电泳30min，dnamarker(2000bp)，用紫外凝胶成像系统进行观察并拍照保存，结果如图1～4中的a所示，其中图1的1、2、3为y4667c的杂合子，4、5、6为纯合子，7为未突变个体；图2的1、2、3为未突变个体，4、5为纯合子，6为杂合子；图3的1、2为未突变个体，3、4、5为杂合子，6、7为纯合子；图4的1为未突变个体，2为纯合子，3为杂合子。3、测序验证结果准确性对已用电泳鉴定出的单头二化螟基因组进行pcr扩增，pcr引物分别如表3所示：表3扩增鉴定pcr引物名称序列seqidnoy4667d/c-ftctaatacaacaggcggtccaag12y4667d/c-rccacgaaataataaacttactcacc3i4758m-fagtggttcacatagacgaggac13i4758m-rcaagcctgcgtgctatctct8y4891f-ftggcgttaccaagtgtggaagg14y4891f-rctgtttcccattatgggtgaca11具体方法如2所示，取3μl电泳后单一条带即可送测，测序结果如附图1～4中的b所示，敏感/抗性纯合子在突变位置为单一峰图，而杂合子为双峰，与as-pcr检测结果一致。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
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的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>南京农业大学<120>基于as-pcr技术快速检测二化螟鱼尼丁受体基因突变的方法<160>17<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cgaaacttctacaacctgaacta23<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2cgaaacttctacaacctgaactg23<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ctgctcctacacttctgatat21<210>4<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4cgaaacttctacaacctgaggt22<210>5<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5cgaaacttctacaacctgaggg22<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6ctatcgtgtctctggccgta20<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7ctatcgtgtctctggccgtg20<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8ttgcggtgataatgggcagt20<210>9<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9cgttcctctactctctatgcta22<210>10<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10cgttcctctactctctatgctt22<210>11<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11ctgtttcccattatgggtgaca22<210>12<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12tctaatacaacaggcggtccaag23<210>13<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13agtggttcacatagacgaggac22<210>14<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14tggcgttaccaagtgtggaagg22<210>15<211>198<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15cgaaacttctacaacctgaagtacgtcgcgttagtgctcgccttctgcatcaacttcgta60ctgctgttttataaggtgagtaagtttattatttcgtgggggaattatacatgaaagatt120attcgctttttttacataagaatgagactaggaattattttggaggaaaacagtcgcata180tcagaagtgtaggagcag198<210>16<211>133<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16ctatcgtgtctctggccatactcataggatactatcatctcaaggtgagaactaaaatag60accatagagcagtgttataaaaatcattactttttttgtgtatatggaagaaaactgccc120attatcaccgcaa133<210>17<211>146<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17cgttcctctactctctatggtacttctcgttctctgtcatgggcaacttcaacaacttct60tcttcgccgcccatttactagacgtcgctgtgggattcaagaccttgaggaccatattgc120agtctgtcacccataatgggaaacag146当前第1页12