本发明涉及苯并氧杂二氮杂十四碳烯衍生物及其用途，属于医药领域。
背景技术：
众所周知，肺癌是对人类威胁最大的恶性肿瘤之一，在男性中发病率和死亡率排第一位，女性发病率和死亡率排第二位。肺癌中，最常见的属非小细胞肺癌(nsclc)，约占肺癌的85％；其中间变性淋巴瘤酶(alk)阳性发病率占非小细胞肺癌(nsclc)的3％～5％。
alk是受体酪氨酸激酶超家族的一个成员并且氨基酸序列水平和例如ros-1、白细胞酪氨酸激酶、胰岛素受体和cmet(肝生长因子受体)的成员最密切相关，如同此基因家族的所有成员，其具有细胞外配体结合区、跨透膜序列和细胞内激酶催化区/信号区。间变性淋巴瘤酶(alk)的信号配体特性还没有被阐明，且不同的机制己在文献中被提出(stoicag.e.etal.,].biol.chem.,2001,276,16772-16779；stoicag.e.etal.,].biol.chem.,2002,277,35990-35999；mewngk.etal.,pnas,2000,97,2603-2608；perez-pinerap.etal.,].biol.chem.,2007,282,28683-28690)，通过磷脂酶c、pi3激酶和stat3(在其他信号蛋白中)刺激间变性淋巴瘤酶(alk)导致细胞内信号级联。间变性淋巴瘤酶(alk)主要在发育中的神经系统中被大量表达，尽管其表达在大脑、脊髓和眼睛的某些区域中被保留，然而其在成年动物体内的相对含量有减少的倾向。间变性淋巴瘤酶(alk)在肿瘤学中有一个重要的作用，引起该酶活化并使全长酶表达增加的全长alk酶点突变皆己被证明导致神经母细胞瘤。此外，由于基因易位缘故alk和其他蛋白质的融合也己被证明导致与癌症相关的活化的激酶区。在淋巴瘤中看到许多引起基因融合的此类alk易位，最普遍是在间变性大细胞淋巴瘤中看到的核磷蛋白npm-alk融合。alk和eml4融合产生嵌合蛋白(eml4-alk)，其被认为对3至5％的非小细胞肺腺癌(nsclc)有相关性。
2011年，alk/ros1/c-met抑制剂克唑替尼被批准用于治疗通过fda批准的测试检测到的alk阳性的局部晚期或转移性nsclc患者。克唑替尼还显示出治疗具有ros1易位的nsclc的效力，正如针对其它酪氨酸激酶抑制剂在临床上观察到的那样，已经赋予对alk抑制剂的抗性的alk和ros1中的突变。
因此，alk和ros1是癌症治疗干预的有吸引力的分子靶标。仍然需要鉴定具有针对野生型和突变形式的alk和ros1的新型活性谱的化合物。
目前针对alk突变的靶向药物有一代alk靶向药克唑替尼(crizotinib)，二代alk靶向药包括色瑞替尼(ceritinib)、艾乐替尼(alectinib)、布加替尼(brigatinib)以及刚上市的三代alk靶向药物劳拉替尼(lorlatinib)。
劳拉替尼(lorlatinib，pf-06463922)是由辉瑞开发的一款新型抗耐药的新型alk抑制剂，用于治疗间变性淋巴瘤激酶阳性(alk+)转移性(晚期)非小细胞肺癌(nsclc)的研究性治疗。，而且，由于其血脑屏障通透性高，对发生中枢神经系统转移的非小细胞肺癌认可发挥较好的效力。
然而该药物的代谢稳定性并不好，半衰期较短，药物的用量较大，容易产生耐药性问题及毒副作用问题。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明人研制了一类新型苯并氧杂二氮杂十四碳烯衍生物用作alk抑制剂，该类化合物具有毒副作用更低，血脑屏障通过率有效增加，半衰期更长，安全性更好。预期此类抑制剂将会有好的疗效，有望克服耐药性问题及毒副作用问题，具有良好的开发前景。本发明新型苯并氧杂二氮杂十四碳烯衍生物及盐类能够有效抑制间变性淋巴瘤酶(alk)并可用于治疗或改善异常细胞增殖性病症。
本发明提供一种作为间变性淋巴瘤酶(alk)抑制剂的新型苯并氧杂二氮杂十四碳烯衍生物，该结构化合物药效学性能更好、代谢稳定性更高。
本发明提供一种具有通式(i)所示结构的苯并氧杂二氮杂十四碳烯衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，当r1为氢时，r2、r3分别独立的选自c3-c6环烷基、氘代甲基；其中，环烷基可任选地被下述相同或不相同的取代基单取代至五取代，所述取代基选自卤素、三氟甲基、氰基、硝基、羟基或c1-c4烷基；
当r1选自c1-c4烷基、c3-c6环烷基、-ch2or4、-coor5、-cor6或-ch2op(o)or7or8时，r2、r3分别独立的选自c1-c4烷基、氘代甲基或c3-c6环烷基；其中所述烷基、环烷基可任选地被相同或不相同的取代基单取代至五取代，所述的取代基选自卤素、三氟甲基、氰基、硝基、羟基或c1-c4烷基；其中，r4，r5，r6分别独立选自氢、c1-c4烷基或c3-c6环烷基；r7，r8分别独立的选自氢、c1-c4烷基或c3-c6环烷基；其中，所述烷基、环烷基可任选地被下述相同或不相同的取代基单取代至五取代，所述的取代基选自：卤素、三氟甲基、氰基、硝基、羟基或c1-c4烷基。
本发明提供的一种具有通式(i)结构的苯并氧杂二氮杂十四碳烯衍生物或其药学上可接受的盐，当r1为氢时，r2、r3分别中至少有一个为氘代甲基，另一个选自c1-c4烷基、c3-c6环烷基、氘代甲基。其中，c3-c6环烷基优选环丙基；c1-c4烷基优选甲基。
本发明提供的一种具有通式(i)结构的苯并氧杂二氮杂十四碳烯衍生物或其药学上可接受的盐，r4优选氢、c1-c4烷基。进一步优选甲基和氢。
本发明提供的一种具有通式(i)结构的苯并氧杂二氮杂十四碳烯衍生物或其药学上可接受的盐，r5优选自氢、甲基、乙基或异丙基；
本发明提供的一种具有通式(i)结构的苯并氧杂二氮杂十四碳烯衍生物或其药学上可接受的盐，r6优选氢。
本发明提供的一种具有通式(i)结构的苯并氧杂二氮杂十四碳烯衍生物或其药学上可接受的盐，r7，r8分别独立的优选氢、甲基、乙基、异丙基、叔丁基；进一步优选乙基、叔丁基。
本发明提供的一种具有通式(i)结构的苯并氧杂二氮杂十四碳烯衍生物或其药学上可接受的盐选自：
本发明通式(i)结构的苯并氧杂二氮杂十四碳烯衍生物或其药学上可接受的盐，其中所述的药学上可接受的盐为无机盐或有机盐，无机盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、酸式磷酸盐；所述有机盐选自乙酸盐、三氟乙酸盐、丙酸盐、丙酮酸盐、羟乙酸盐、乙二酸盐、丙二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、以磺酸盐、苯磺酸盐、水杨酸盐。
本发明再一个目的是提供药物组合物，它含有上述本发明通式(i)化合物或其药学上可接受的盐、以及药学上可接受的载体、药用辅料。
所述药物载体包含：微囊、微球、纳米粒、脂质体。
所述药用辅料包括：包含溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、ph值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂以及释放阻滞剂。
本发明化合物或其药学上可接受的盐可以配制为用于口服给药的固体制剂，包括，但不限于胶囊剂、片剂、丸剂、散剂、颗粒剂等。
本发明化合物或其药学上可接受的盐的单次用量可以为0.01-1000mg，例如0.05-800mg、0.1-500mg、0.01-300mg、0.01-200mg、0.05-150mg、0.05-50mg等。
另一方面，本发明提供了上述通式(i)的化合物或其药学可接受的盐在制备用作alk抑制剂的药物中的用途。
另一方面，本发明提供了上述通式(i)的化合物或其药学可接受的盐在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
本发明所提及的癌症，可选自非小细胞肺癌(nsclc)、鳞状细胞癌、激素难治疗性前列腺癌、乳突状肾细胞癌、大肠直肠腺癌、神经母细胞瘤、间变性大细胞淋巴瘤(alcl)、胃癌和转移性脑癌等。
本发明的有益效果：
本发明提供的具有通式(i)所示结构的一类苯并氧杂二氮杂十四碳烯衍生物具有较为便捷的合成方法以及良好的间变性淋巴瘤酶(alk)抑制活性和优异的药效学性能，能够显著延长药物大代谢半衰期。
本发明新型苯并氧杂二氮杂十四碳烯衍生物，具有抑制alk的生物学功能，用于间变性淋巴瘤激酶阳性(alk+)转移性(晚期)非小细胞肺癌(nsclc)的治疗，为寻找治疗癌症、代谢与免疫疾病、心血管病以及神经性疾病等提供新手段。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行详细的描述。
在本发明中“c1-c4烷基”是指分别为1至4个碳原子的饱和的直链或支链的单价烃基。实例包括，但不限于甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、1-丁基、2-甲基-1-丙基、2-丁基和2-甲基-2-丙基。
在本发明中“c3-c6环烷基”是指分别为3至6个碳原子的环烷基。
在本发明中“给药”或“给予”个体化合物是指向需要治疗的个体提供本发明的化合物。
<化合物或其药学上可接受的盐>
本发明提供了一类作为间变性淋巴瘤酶(alk)抑制剂的新型苯并氧杂二氮杂十四碳烯衍生物或其药学上可接受的盐，其结构式如通式(i)所示：
本发明还提供通式(i)所述的化合物的制备方法，所述方法通过以下反应式进行：
反应方案1：
其中r4选自氢、c1-c4烷基或c3-c6环烷基，当r4为氢时可通过式(ii)化合物与甲醛在四丁基氟化铵条件下获得，当r4为c1-c4烷基、c3-c6环烷基可通过与r4och2br在碱性条件下获得；
或者，反应方案2：
其中r5选自氢、c1-c4烷基或c3-c6环烷基，可通过式(ii)化合物与r5ococl在碱性条件下获得；
或者，反应方案3：
其中r6选自氢、c1-c4烷基或c3-c6环烷基，当r6为氢时可通过式(ii)化合物与甲酸反应获得，当r6为c1-c4烷基或c3-c6环烷基，可通过式(ii)化合物与r6cocl在碱性条件下获得；
或者，反应方案4：
其中r7,r8独立选自氢、c1-c4烷基或c3-c6环烷基；
合适的碱包括叔胺碱例如二异丙基乙胺(diea)和三乙胺、无机碱等。
<药物组合物>
本发明还提供药物组合物，包含上述本发明通式(i)化合物或其药学上可接受的盐、以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
本发明化合物或其药学上可接受的盐可以配制为用于口服给药的固体制剂，包括，但不限于胶囊剂、片剂、丸剂、散剂、颗粒剂等。在这些固体剂型中，本发明通式(i)化合物作为活性成分与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，例如与柠檬酸钠或磷酸二钙。或与下属成分混合：(1)填料或增溶剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸等；(2)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖、阿拉伯胶等；(3)保湿剂，例如，甘油等；(4)崩解剂、例如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些符合硅酸盐和碳酸钠等；(5)缓溶剂，例如石蜡等；(6)吸收加速剂，例如季铵化合物等；(7)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯等；(8)吸附剂，例如，高岭土等；(9)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠等，或其混合物。胶囊剂、片剂、丸剂中也可包含缓冲剂。
所述固体剂型例如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材料如肠溶衣和其他本领域公知的材料晶型包衣或微囊化。他们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性成分的释放可以延迟的方式在消化道的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性成分也可与上述赋形剂中的一种或者多种形成微胶囊形式。
本发明化合物或其药学上可接受的盐可以配制为用于口服给药的液体剂型，包括，但不限于药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆、酊剂等。除了作为活性成分的通式(i)化合物或其药学上可接受的盐外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，例如水和其他溶剂，增溶剂和乳化剂、例如，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油类，特别是棉籽油、花生油、玉米油、橄榄油、蓖麻油、芝麻油等或这些物质的混合物等。除了这些惰性稀释剂外，本发明液体剂型也可包括常规助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料等。
所述悬浮剂包括，例如，乙氧基化十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇、和脱水山梨醇、微晶纤维素、琼脂等或这些物质的混合物。
本发明化合物和其药学上可接受的盐可以配置为用于胃肠外注射的剂型，包括，但不限于生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及用于重新溶解成无菌的可注射溶液和分散液的无菌粉末。适宜的载体、稀释剂、溶剂、赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
本发明化合物或其药学上可接受的盐可以配置为用于局部给药的剂型，包括如软膏剂、散剂、栓剂、滴剂、喷射剂和吸入剂等。作为活性成分的本发明通式(i)化合物或其药学上可接受的盐在无菌条件下和生理上可接受的载体及任选的防腐剂、缓冲剂，和必要时可能需要的推进剂一起混合。
本发明的药物组合物包括通式(i)化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分，以及药学上可接受载体、赋形剂、稀释剂。在制备药物组合物时，通常是将本发明通式(i)化合物或其药学上可接受的盐与药学上可接受载体、赋形剂或稀释剂混合。其中通式(i)化合物或其药学上可接受的盐的含量可以为0.01-1000mg，例如0.05-800mg、0.1-500mg、0.01-300mg、0.01-200mg、0.05-150mg、0.05-50mg等。
<用途>
本发明还提供通式(i)化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗哺乳动物的癌症的用途。
通式(i)化合物或其药学上可接受的盐，通过抑制间变性淋巴瘤酶(alk)活性，用于治疗哺乳动物包括人的转移性(晚期)非小细胞肺癌(nsclc)疾病的方法，所述方法包括向所述哺乳动物包括人施用治疗有效量的上述式i的化合物或其药学上可接受的盐。
“治疗有效量”为个体中有效产生生物或医学应答(例如降低或抑制酶活蛋白活性，或者改善症状、减轻病况、减缓或延迟疾病进展或者预防疾病)的本发明的化合物的量。
本发明所提及的癌症，包括肺癌、骨癌、膜腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤黑色素癌或眼球内黑色素癌、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、胆门部癌、胃癌、结肠癌、乳癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、阴门癌、霍奇金氏病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、肾上腺癌、软组织肉癌、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴癌、膀肮癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾孟癌、中枢神经系统(cns)癌、原发性中枢神经系统淋巴癌、脊髓轴癌、脑干神经胶质瘤、脑垂腺腺瘤等。
本发明的化合物或其药学上可接受的盐可给药于哺乳动物包括人，可以口服、直肠、胃肠外(静脉内、肌肉内或皮下)、局部给药(粉剂、软膏剂、滴剂)或瘤内给药。
本发明所述的化合物或其药学上可接受的盐可以单独给药，或者与其他药学上可接受的治疗剂联合给药，与其他抗肿瘤药物组合。此联合治疗可通过同时、顺序或分开使用治疗的各个组分来实现。所述治疗剂包括但不限于：作用于dna化学结构的抗肿瘤药物，如顺铂，影响核苷酸合成的抗肿瘤药物如甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶等，影响核酸转录的抗肿瘤药物如阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素等，作用于微管蛋白合成的抗肿瘤药物如紫杉醇、长春瑞滨等，芳香化酶抑制剂如氨鲁米特、来曲唑、瑞宁德等，细胞信号通路抑制剂如alk抑制剂克唑替尼、色瑞替尼、艾乐替尼、劳拉替尼等。抗肿瘤单抗，免疫抑制剂pd-1、pd-l1等，待组合的各成分可同时或顺序的给予，以单一制剂形式或者以不同制剂的形式给予。所述组合不仅包括本发明化合物的一种或其他活性剂的组合，而且也包括本发明化合物的两种或更多的其他活性剂的组合。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解为这些实施例仅用于举例说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
具体实施方式中涉及如下中间体物质，可参见下述路线过程合成得到：
中间体9：叔丁基((4-溴-5-氰基-1-甲基-1h-吡唑-3-基)甲基)(甲基)氨基甲酸酯的制备
路线如下所示：
具体过程：
步骤a：2,4-二羰基戊酸甲酯(中间体1)的制备：
将冰盐浴下乙二酸二甲酯(23.6g,0.2mol)和丙酮(29.2g,0.2mol)慢慢滴加至25％甲醇钠的甲醇(200ml,0.2mol)中，0℃下搅拌8小时，反应液倾入200ml水中，乙酸乙酯萃取，水相用浓盐酸调ph为2-3，经乙酸乙酯萃取，有机相水洗，饱和食盐水洗，干燥后浓缩得产物26g，产率：90％。
步骤b：3-甲基-1h-吡唑-5-羧酸甲酯(中间体2)的制备：
将2,4-二羰基戊酸甲酯(中间体1)(12g,0.076mol)溶于100ml二氯甲烷中，冰盐浴下慢慢滴加水合肼(85％,5.3g,0.091mol)，0℃下搅拌3小时，反应液倾入200ml水中，二氯甲烷萃取，有机相经水洗，干燥，浓缩得产物8.8g，产率：83％。
步骤c：1,3-二甲基-1h-吡唑-5-羧酸甲酯(中间体3)的制备：
将3-甲基-1h-吡唑-5-羧酸甲酯(中间体2)(5g,0.036mol)溶于50ml四氢呋喃中，加入碘甲烷(6.1g,0.043mol)，50℃反应3小时，反应液倾入100ml水中，乙酸乙酯萃取，有机相经水洗，干燥，浓缩得产物4.5g，产率：82％。
步骤d：4-溴-1,3-二甲基-1h-吡唑-5-羧酸甲酯(中间体4)的制备：
将1,3-二甲基-1h-吡唑-5-羧酸甲酯(中间体3)(1g,6.49mmol)溶于5mldmf中，分批加入nbs(1.73g,9.73mmol)，加完后室温搅拌4小时。将反应液滴加至50ml冰水中，白色固体析出，过滤，滤饼水洗，烘干得产物1.1g，产率：73％。
步骤e：4-溴-1,3-二甲基-1h-吡唑-5-羧酰胺(中间体5)的制备
将4-溴-1,3-二甲基-1h-吡唑-5-羧酸甲酯(中间体4)(1g,0.0043mol)加至10ml氨水中，室温搅拌过夜，固体析出，抽滤，烘干得产物0.65g，产率：69.5％。
步骤f：4-溴-1,3-二甲基-1h-吡唑-5-腈(中间体6)的制备
将4-溴-1,3-二甲基-1h-吡唑-5-羧酰胺(中间体5)(400mg,1.83mmol)混悬于5ml乙腈中，加入三氯氧磷(844mg,3.0eq)，升温至80℃反应3小时，反应液冷却至室温后，慢慢倒至冰水中，固体析出，过滤，水洗，烘干得产物200mg，产率54.5％。
步骤g：4-溴-3-(溴甲基)-1-甲基-1h-吡唑-5-腈(中间体7)的制备
将4-溴-1,3-二甲基-1h-吡唑-5-腈(中间体6)(500mg,2.5mmol)，nbs(489mg,2.75mmol)，aibn(82mg,0.5mmol)溶于10ml四氯化碳中，氮气保护并回流过夜。反应液冷却至室温后，过滤，滤液旋干得产物600mg,产率86％。
步骤h：4-溴-1-甲基-3-((甲基氨基)甲基)-1h-吡唑-5-腈(中间体8)的制备
将4-溴-3-(溴甲基)-1-甲基-1h-吡唑-5-腈(中间体7)(1g,3.6mmol)溶于10ml甲胺醇溶液中，室温搅拌过夜，旋蒸至干，加入稀盐酸调ph＝2-3，乙酸乙酯洗涤除杂质，水相用1mnaoh水溶液调ph＝9-10，乙酸乙酯萃取，合并有机相，经水洗，干燥，浓缩得产物600mg，产率：73％。
步骤i：叔丁基((4-溴-5-氰基-1-甲基-1h-吡唑-3-基)甲基)(甲基)氨基甲酸酯(中间体9)的制备
将4-溴-1-甲基-3-((甲基氨基)甲基)-1h-吡唑-5-腈(中间体8)(500mg,2.18mmol)溶于10ml四氢呋喃中，加入三乙胺(330mg,3.27mmol)和二碳酸二叔丁酯(713mg,3.27mmol)，室温搅拌3小时，反应液经乙酸乙酯稀释，柠檬酸水溶液洗涤，水洗，干燥，浓缩得产物680mg，产率：95％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ4.46(brs,2h),4.01(s,3h),2.83(brs,3h),1.47(s,9h).
中间体14：(r)-2-(1-((2-氨基-5-溴吡啶-3-基)氧基)乙基)-4-氟苯甲酸甲酯的制备
路线如下所示：
步骤j：(s)-1-(5-氟-2-碘苯基)乙-1-醇(中间体10)的制备
将(-)-dipci(5.7g,17.8mmol)的四氢呋喃(50ml)溶液冷却至-20至-30℃，然后逐滴加入1-(5-氟-2-碘苯基)乙酮(3.13g,11.9mmol)的四氢呋喃(50ml)溶液，加热反应液到室温。2小时后，冷却至-30℃，加入另一部分(-)-dipcl(3.8g,11.9mmol)，保温反应30分钟，然后升至室温，1小时后，浓缩至干，用甲基叔丁基醚(100ml)溶解残留物。冰浴下，二乙醇胺(3.1g,29.6mmol)的乙醇/四氢呋喃(7.5ml/15ml)溶液慢慢滴加入反应液中，加热回流2小时，然后冷却到室温，过滤，浓缩滤液。使残留物在7:3的庚烷/乙酸乙酯(100ml)中析出固体，过滤。重复此步骤直到该液体浓缩后不会再观察到固体为止。柱层析提纯，得油状物。将所得无色油状用庚烷进行重结晶化进一步提纯，得到白色结晶1.8g，产率：57％。
步骤k：(s)-1-(5-氟-2-碘苯基)甲磺酸乙酯(中间体11)的制备
将中间体10(2.2g,8.3mmol)的甲基叔丁基醚(35ml)溶液冷却至0℃，依次逐滴加入三乙胺(2.3ml,16.6mmol)与甲磺酰氯(0.96ml,12.4mmol)，然后加热反应到室温并搅拌3小时。过滤，用乙酸乙酯洗涤固体。浓缩滤液，得到浅黄色油状物3.5g，产率：80％
步骤l：(r)-3-(1-(5-(5-氟-2-碘苯基)乙氧基)吡啶-2-胺(中间体12)的制备
将碳酸铯(6.5g,20.1mmol)加至2-氨基-3-羟基吡啶(1.33g,12.1mmol)的甲基四氢呋喃(60ml)与丙酮(30ml)混合溶剂中，室温搅拌30分钟，然后加热至40℃，逐滴加入中间体11(3.44g,80mmol)的甲基四氢呋喃(30ml)溶液。80℃反应24小时。过滤反应液，浓缩滤液，柱层析纯化得到白色固体1.4g，产率：38％
步骤m：(r)-2-(1-(((2-氨基吡啶-3-基)氧基)乙基)-4-氟苯甲酸甲酯(中间体13)的制备
将中间体12(2g,5.7mmol)溶于20ml甲醇中，依次加入三乙胺(1.54ml,11.3mmol)与pd(dppf)c12(0.41g,0.57mmol)。在压力为100psi的一氧化碳氛围中，100℃反应16小时。过滤反应混合物，浓缩滤液，柱层析纯化得到棕色油状物1.3g，产率：79％。
步骤n：(r)-2-(1-((2-氨基-5-溴吡啶-3-基)氧基)乙基)-4-氟苯甲酸甲酯(中间体14)的制备
将中间体13(1.3g,4.5mmol)溶于20ml乙腈中，0℃下慢慢加入nbs(0.79g,4.5mmol)的乙腈(20ml溶液)，加完后搅拌混合物2小时。浓缩至干，用乙酸乙酯溶解残留物，用2m氢氧化钠水溶液与10％硫代硫酸纳水溶液洗涤。干燥，浓缩，柱层析得到1.2g，产率：73％。
lhnmr(400mhz,dmso-d6)δ:7.97-7.93(m,1h),7.61-7.51(m,1h),7.54(s,1h),7.29-7.24(m,1h),6.89(s,1h),6.25-6.08(m,3h),3.91(s,3h),1.59(d,j＝8.0hz,3h).
中间体18：(10r)-7-氨基-12-氟-2,10,16-三甲基-5-氧代-10,15,16,17-四氢-2h-8,4-(次甲基桥)-吡唑并[4,3-h][2,5,11]苯并氧杂二氮杂十四熳环-3-甲腈的制备
路线如下所示：
步骤o：甲基(r)-2-(1-((5-氨基-2-(3-((((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)甲基]--5-氰基-1-甲基-1h-吡唑-4-)吡啶-3-基)氧基)乙基-4-氟苯甲酸酯(中间体15)的制备
将中间体14(0.9g,2.4mmol)、中间体9(1.0g,3.0mmol)、联硼酸频哪醇酯(0.9g,3.6mmol)、氟化铯(1.9g,12.6mmol)溶于9:1甲醇/水(12ml)的溶液中，加热至60℃，氮气保护下加入pd(dppf)cl2(175mg,0.24mmol)的甲苯(1.5ml)溶液，回流搅拌3小时。加入另一部分的pd(dppf)cl2(87mg,0.12mmol)的甲苯(1.5ml)溶液，60℃搅拌过夜。冷却到室温后，加入乙酸乙酯，过滤，滤液依次用水与盐水洗涤，干燥，浓缩。柱层析纯化得到黄色油状物570mg，产率：43％。
步骤p:(r)-2-(1-((5-氨基-2-(3-((((叔丁氧羰基)(甲基)氨基)甲基]-5-氰基-1-甲基-1h-吡唑-4-基)吡啶-3-基)氧基)乙基)-4-氟苯甲酸(中间体16)的制备
将中间体15(2.7g,5mmol)溶于甲醇(20ml)中，加入氢氧化钠(1.0g,25mmol)的水(2ml)溶液，在40℃搅拌混合物3小时。用水稀释反应液，浓缩除去甲醇，水相用乙酸乙酯洗涤。水相经稀盐酸中和，乙酸乙酯萃取，干燥，浓缩得到浅黄色固体2g，产率：76％。
步骤q：(r)-2-(1-((5-氨基-2-(5-氰基-1-甲基-3-((甲基氨基)甲基)-1h-吡唑-4-基)吡啶-3-基)氧基)乙基)-4-氟苯甲酸(中间体17)的制备
将中间体16(960mg,1.82mmol)溶于4m氯化氢-二氧六环溶液(15ml)中，室温搅拌反应2.5小时。浓缩得到灰白色固体700mg，产率：83.1％。
步骤r：(10r)-7-氨基-12-氟-2,10,16-三甲基-5-氧代-10,15,16,17-四氢-2h-8,4-(次甲基桥)-吡唑并[4,3-h][2,5,11]苯并氧杂二氮杂十四熳环-3-甲腈(中间体18)的制备
将中间体17(100mg,0.217mmol)溶于dmf(10ml)中，加入dipea(42mg,0.325mmol)，降温至0℃，慢慢加入hatu(123.5mg,0.325mmol)，0℃反应2小时。反应液加入水中，乙酸乙酯萃取，有机相经水洗，干燥，浓缩，柱层析得40mg，产率：45％。
lhnmr(400mhz,dmso-d6)δ:7.61-7.58(m,2h),7.48-7.45(m,1h),7.20-7.16(m,1h),6.81(s,1h),6.19(s,2h),5.61(q,j＝8.0hz,1h),4.44(d,j＝16.0hz,1h),4.20(d,j＝12.0hz,1h),4.04(s,3h),2.99(s,3h),1.68(d,j＝8.0hz,3h).
中间体25：叔丁基((4-溴-5-氰基-1-氘代甲基-1h-吡唑-3-基)甲基)(环丙基)氨基甲酸酯的制备
路线如下所示：
合成方法参考中间体9的合成，其中碘甲烷替换为氘代碘甲烷，甲胺替换为环丙基胺，esi-msm/z:358.2/360.2[m+h]+。
中间体27：叔丁基((4-溴-5-氰基-1-氘代甲基-1h-吡唑-3-基)甲基)(氘代甲基)氨基甲酸酯的制备
路线如下所示：
合成方法参考中间体25的合成，其中环丙基胺替换为氘代甲胺，esi-msm/z:335.2/337.2[m+h]+。
中间体34：叔丁基((4-溴-5-氰基-1-环丙基-1h-吡唑-3-基)甲基)(氘代甲基)氨基甲酸酯的制备
路线如下所示：
合成方法参考中间体9的合成，其中碘甲烷替换为溴代环丙烷，甲胺替换为氘代甲胺，esi-msm/z:358.2/360.2[m+h]+。
中间体36：叔丁基((4-溴-5-氰基-1-环丙基-1h-吡唑-3-基)甲基)(甲基)氨基甲酸酯的制备
合成方法参考中间体25的合成，其中环丙基胺替换为甲胺，esi-msm/z:332.2/334.2[m+h]+。
中间体38：叔丁基((4-溴-5-氰基-1-甲基-1h-吡唑-3-基)甲基)(氘代甲基)氨基甲酸酯的制备：
路线如下所示：
合成方法参考中间体9的合成，其中甲胺替换为氘代甲胺，esi-msm/z:332.2/334.2[m+h]+。
中间体40：叔丁基((4-溴-5-氰基-1-甲基-1h-吡唑-3-基)甲基)(环丙基)氨基甲酸酯的制备
路线如下所示：
合成方法参考中间体9的合成，其中甲胺替换为环丙胺，esi-msm/z:355.2/357.2[m+h]+。
实施例1：(10r)-7-羟甲基氨基-12-氟-2,10,16-三甲基-5-氧代-10,15,16,17-四氢-2h-8,4-(次甲基桥)-吡唑并[4,3-h][2,5,11]苯并氧杂二氮杂十四熳环-3-甲腈(化合物1)
将中间体18(100mg,0.245mmol)混悬于水(1ml)，二氯甲烷(1ml)，甲醇(1ml)中，加入甲醛水溶液(37％,0.4ml)和四丁基氟化铵(1m,0.08ml)。室温过夜，反应液经二氯甲烷萃取，有机相经饱和氯化钠洗，无水硫酸钠干燥，柱纯化得固体80mg，产率74.7％。
esi-msm/z:437.2[m+h]+。
lhnmr(400mhz,dmso-d6)δ:9.29(s,1h),7.61-7.58(m,2h),7.48-7.45(m,1h),7.20-7.16(m,1h),6.81(s,1h),6.39(d,j＝4.0hz,2h),5.61(q,j＝8.0hz,1h),4.44(d,j＝16.0hz,1h),4.20(d,j＝12.0hz,1h),4.04(s,3h),2.99(s,3h),1.68(d,j＝8.0hz,3h).
实施例2：(10r)-7-氨基甲酸乙酯-12-氟-2,10,16-三甲基-5-氧代-10,15,16,17-四氢-2h-8,4-(次甲基桥)-吡唑并[4,3-h][2,5,11]苯并氧杂二氮杂十四熳环-3-甲腈(化合物2)
将中间体18(100mg,0.245mmol)溶于thf中，加入dipea(38mg,0.294mmol)，0℃下慢慢加入氯甲酸乙酯(26.5mg,0.245mmol)，然后室温搅拌过夜，反应液经水洗，乙酸乙酯萃取，有机相经干燥旋干，柱纯化得35mg,产率：29.7％。
esi-msm/z:479.2[m+h]+。
lhnmr(400mhz,dmso-d6)δ:9.51(s,1h),7.98(s,1h),7.83-7.80(m,1h),7.49-7.47(m,1h),7.21-7.16(m,2h),5.66(q,j＝8.0hz,1h),4.48(d,j＝16.0hz,1h),4.25(d,j＝12.0hz,1h),4.18(q,j＝8.0hz,2h),4.08(s,3h),3.00(s,3h),1.68(d,j＝8.0hz,3h),1.28(t,j＝8.0hz,3h).
实施例3：(10r)-7-氨甲醛基-12-氟-2,10,16-三甲基-5-氧代-10,15,16,17-四氢-2h-8,4-(次甲基桥)-吡唑并[4,3-h][2,5,11]苯并氧杂二氮杂十四熳环-3-甲腈(化合物3)
冰浴条件下，将中间体18(100mg,0.245mmol)慢慢加至甲酸(113mg,2.45mmol)中，慢慢加入乙酸酐(37mg,0.367mmol)，加完后室温搅拌过夜。反应液经乙酸乙酯稀释，水洗，干燥，浓缩，柱层析得固体42mg，产率：39.2％。
esi-msm/z:435.2[m+h]+。
lhnmr(400mhz,dmso-d6)δ:10.42(d,j＝12.0hz,1h),9.23(s,1h),7.89(s,1h),7.81(d,j＝8.0hz,1h),7.50-7.46(m,1h),7.21-7.17(m,2h),5.73(q,j＝8.0hz,1h),4.48(d,j＝16.0hz,1h),4.23(d,j＝12.0hz,1h),4.08(s,3h),3.01(s,3h),1.72(d,j＝8.0hz,3h).
实施例4：(10r)-7-氨基-12-氟-2-氘代甲基-10-甲基-16-环丙基-5-氧代-10,15,16,17-四氢-2h-8,4-(次甲基桥)-吡唑并[4,3-h][2,5,11]苯并氧杂二氮杂十四熳环-3-甲腈(化合物4)
合成方法参考中间体18的合成，其中中间体9代替为中间体25。
esi-msm/z:436.2[m+h]+
lhnmr(400mhz,dmso-d6)δ:7.61-7.58(m,2h),7.48-7.45(m,1h),7.20-7.16(m,1h),6.81(s,1h),6.19(s,2h),5.61(q,j＝8.0hz,1h),4.44(d,j＝16.0hz,1h),4.20(d,j＝12.0hz,1h),2.30-2.22(m,1h),1.68(d,j＝8.0hz,3h),0.83-0.56(m,4h).
实施例5：(10r)-7-氨基-12-氟-2,16-二氘代甲基-10-甲基-5-氧代-10,15,16,17-四氢-2h-8,4-(次甲基桥)-吡唑并[4,3-h][2,5,11]苯并氧杂二氮杂十四熳环-3-甲腈(化合物5)
合成方法参考中间体18的合成，其中中间体9代替为中间体27。
esi-msm/z:413.2[m+h]+
lhnmr(400mhz,dmso-d6)δ:7.61-7.58(m,2h),7.48-7.45(m,1h),7.20-7.16(m,1h),6.81(s,1h),6.19(s,2h),5.61(q,j＝8.0hz,1h),4.44(d,j＝16.0hz,1h),4.20(d,j＝12.0hz,1h),1.68(d,j＝8.0hz,3h).
实施例6：(10r)-7-氨基-12-氟-2-环丙基-10-甲基-16-氘代甲基-5-氧代-10,15,16,17-四氢-2h-8,4-(次甲基桥)-吡唑并[4,3-h][2,5,11]苯并氧杂二氮杂十四熳环-3-甲腈(化合物6)
合成方法参考中间体18的合成，其中中间体9代替为中间体34。
esi-msm/z:436.2[m+h]+
lhnmr(400mhz,dmso-d6)δ:7.61-7.58(m,2h),7.48-7.45(m,1h),7.20-7.16(m,1h),6.81(s,1h),6.19(s,2h),5.61(q,j＝8.0hz,1h),4.44(d,j＝16.0hz,1h),4.20(d,j＝12.0hz,1h),2.32-2.25(m,1h),1.68(d,j＝8.0hz,3h),0.81-0.58(m,4h).
实施例7：(10r)-7-羟甲基氨基-12-氟-2,10-二甲基-16-氘代甲基-5-氧代-10,15,16,17-四氢-2h-8,4-(次甲基桥)-吡唑并[4,3-h][2,5,11]苯并氧杂二氮杂十四熳环-3-甲腈(化合物7)
合成方法参考实施例1的合成，其中中间体9代替为中间体38。
esi-msm/z:440.2[m+h]+
lhnmr(400mhz,dmso-d6)δ:9.29(s,1h),7.61-7.58(m,2h),7.48-7.45(m,1h),7.20-7.16(m,1h),6.81(s,1h),6.39(d,j＝4.0hz,2h),5.61(q,j＝8.0hz,1h),4.44(d,j＝16.0hz,1h),4.20(d,j＝12.0hz,1h),4.04(s,3h),1.68(d,j＝8.0hz,3h).
实施例8：(10r)-7-羟甲基氨基-12-氟-2,16-二氘代甲基-10-甲基-5-氧代-10,15,16,17-四氢-2h-8,4-(次甲基桥)-吡唑并[4,3-h][2,5,11]苯并氧杂二氮杂十四熳环-3-甲腈(化合物8)
合成方法参考实施例1的合成，其中中间体9代替为中间体27。
esi-msm/z:443.2[m+h]+
lhnmr(400mhz,dmso-d6)δ:9.29(s,1h),7.61-7.58(m,2h),7.48-7.45(m,1h),7.20-7.16(m,1h),6.81(s,1h),6.39(d,j＝4.0hz,2h),5.61(q,j＝8.0hz,1h),4.44(d,j＝16.0hz,1h),4.20(d,j＝12.0hz,1h),1.68(d,j＝8.0hz,3h).
实施例9：(10r)-7-羟甲基氨基-12-氟-2-氘代甲基-10,16-二甲基-5-氧代-10,15,16,17-四氢-2h-8,4-(次甲基桥)-吡唑并[4,3-h][2,5,11]苯并氧杂二氮杂十四熳环-3-甲腈(化合物9)
合成方法参考实施例1的合成，其中中间体9代替为中间体36。
esi-msm/z:440.2[m+h]+
lhnmr(400mhz,dmso-d6)δ:9.29(s,1h),7.61-7.58(m,2h),7.48-7.45(m,1h),7.20-7.16(m,1h),6.81(s,1h),6.39(d,j＝4.0hz,2h),5.65(q,j＝8.0hz,1h),4.44(d,j＝16.0hz,1h),4.20(d,j＝12.0hz,1h),2.99(s,3h),1.68(d,j＝8.0hz,3h).
实施例10：(10r)-7-氨基甲基磷酸二叔丁酯-12-氟-2,10,16-三甲基-5-氧代-10,15,16,17-四氢-2h-8,4-(次甲基桥)-吡唑并[4,3-h][2,5,11]苯并氧杂二氮杂十四熳环-3-甲腈(化合物10)
将中间体18(100mg,0.246mmol)溶于1mldmf中，冰浴下加入nah(10mg,0.246mmol)，加完后0℃下反应0.5h，然后将二叔丁基氯甲基磷酸酯(67mg,0.246mmol)的dmf(0.5ml)加至反应液中，室温反应2h，反应液倒至水中，dcm萃取，有机相经水洗，饱和氯化钠洗，无水硫酸钠干燥，柱纯化得固体20mg，产率：13％。
esi-msm/z:629.4[m+h]+
lhnmr(400mhz,dmso-d6)δ:9.28(s,1h),7.61-7.58(m,2h),7.48-7.45(m,1h),7.20-7.16(m,1h),6.81(s,1h),6.36(d,j＝4.0hz,2h),5.63(q,j＝8.0hz,1h),4.44(d,j＝16.0hz,1h),4.20(d,j＝12.0hz,1h),4.04(s,3h),2.99(s,3h),1.68(d,j＝8.0hz,3h)，1.32(s,18h)
实施例11：(10r)-7-氨基磷酸二氢甲酯-12-氟-2,10,16-三甲基-5-氧代-10,15,16,17-四氢-2h-8,4-(次甲基桥)-吡唑并[4,3-h][2,5,11]苯并氧杂二氮杂十四熳环-3-甲腈(化合物11)
将化合物13(100mg,0.159mmol)溶于1ml稀盐酸(1m)和1ml四氢呋喃中，室温搅拌1小时，二氯甲烷萃取，干燥后旋干得固体25mg,产率：30.5％。
esi-msm/z:517.1[m+h]+
lhnmr(400mhz,dmso-d6)δ:9.28(s,1h),7.61-7.58(m,2h),7.48-7.45(m,1h),7.20-7.16(m,1h),6.81(s,1h),6.34(d,j＝4.0hz,2h),5.61(q,j＝8.0hz,1h),4.44(d,j＝16.0hz,1h),4.20(d,j＝12.0hz,1h),4.04(s,3h),2.99(s,3h),1.68(d,j＝8.0hz,3h).
实施例12：(10r)-7-氨基磷酸二乙酯-12-氟-2,10,16-三甲基-5-氧代-10,15,16,17-四氢-2h-8,4-(次甲基桥)-吡唑并[4,3-h][2,5,11]苯并氧杂二氮杂十四熳环-3-甲腈(化合物12)
合成方法参照实施例10，其中二叔丁基氯甲基磷酸酯代替为二乙基氯甲基磷酸酯。
esi-msm/z:573.2[m+h]+
lhnmr(400mhz,dmso-d6)δ:9.28(s,1h),7.61-7.58(m,2h),7.48-7.45(m,1h),7.20-7.16(m,1h),6.81(s,1h),6.36(d,j＝4.0hz,2h),5.61(q,j＝8.0hz,1h),4.44(d,j＝16.0hz,1h),4.20(d,j＝12.0hz,1h),4.04(s,3h),4.03(q,j＝8.0hz,4h),2.99(s,3h),1.68(d,j＝8.0hz,3h),1.41(t,j＝8.0hz,6h).
实施例13：(10r)-7-氨基酸二甲酯-12-氟-2,10,16-三甲基-5-氧代-10,15,16,17-四氢-2h-8,4-(次甲基桥)-吡唑并[4,3-h][2,5,11]苯并氧杂二氮杂十四熳环-3-甲腈(化合物13)
合成方法参照实施例10，其中二叔丁基氯甲基磷酸酯代替为二甲基氯甲基磷酸酯。
esi-msm/z:545.2[m+h]+
lhnmr(400mhz,dmso-d6)δ:9.28(s,1h),7.61-7.58(m,2h),7.48-7.45(m,1h),7.20-7.16(m,1h),6.81(s,1h),6.36(d,j＝4.0hz,2h),5.63(q,j＝8.0hz,1h),4.44(d,j＝16.0hz,1h),4.20(d,j＝12.0hz,1h),4.04(s,3h),3.78(s,6h),2.99(s,3h),1.68(d,j＝8.0hz,3h).
实施例14：(10r)-7-甲氧基甲氨基-12-氟-2,10,16-三甲基-5-氧代-10,15,16,17-四氢-2h-8,4-(次甲基桥)-吡唑并[4,3-h][2,5,11]苯并氧杂二氮杂十四熳环-3-甲腈(化合物14)
将中间体18(100mg,0.246mmol)溶于1mldmf中，冰浴下加入nah(10mg,0.246mmol)，加完后0℃下反应0.5h，然后加入溴甲基甲基醚(30.7mg,0.246mmol)，室温反应2h，反应液倒至水中，dcm萃取，有机相经水洗，饱和氯化钠洗，无水硫酸钠干燥，柱纯化得固体32mg，产率：28.9％。
esi-msm/z:451.2[m+h]+
lhnmr(400mhz,dmso-d6)δ:9.29(s,1h),7.61-7.58(m,2h),7.48-7.45(m,1h),7.20-7.16(m,1h),6.81(s,1h),6.39(d,j＝4.0hz,2h),5.61(q,j＝8.0hz,1h),4.44(d,j＝16.0hz,1h),4.20(d,j＝12.0hz,1h),4.04(s,3h),3.32(s,3h),2.99(s,3h),1.68(d,j＝8.0hz,3h).
实施例15：(10r)-7-氨基甲基磷酸二叔丁酯-12-氟-2,10-二甲基-16-氘代甲基-5-氧代-10,15,16,17-四氢-2h-8,4-(次甲基桥)-吡唑并[4,3-h][2,5,11]苯并氧杂二氮杂十四熳环-3-甲腈(化合物15)
合成方法参照实施例10，其中中间体9代替为中间体38。
esi-msm/z:632.3[m+h]+
lhnmr(400mhz,dmso-d6)δ:9.28(s,1h),7.61-7.58(m,2h),7.48-7.45(m,1h),7.20-7.16(m,1h),6.81(s,1h),6.36(d,j＝4.0hz,2h),5.61(q,j＝8.0hz,1h),4.44(d,j＝16.0hz,1h),4.20(d,j＝12.0hz,1h),4.04(s,3h),1.68(d,j＝8.0hz,3h)，1.32(s,18h).
实施例16：(10r)-7-氨基甲基磷酸二叔丁酯-12-氟-2-氘代甲基-10,16-二甲基-5-氧代-10,15,16,17-四氢-2h-8,4-(次甲基桥)-吡唑并[4,3-h][2,5,11]苯并氧杂二氮杂十四熳环-3-甲腈(化合物16)
合成方法参照实施例10，其中中间体9代替为中间体36。
esi-msm/z:632.3[m+h]+
lhnmr(400mhz,dmso-d6)δ:9.28(s,1h),7.61-7.58(m,2h),7.48-7.45(m,1h),7.20-7.16(m,1h),6.81(s,1h),6.36(d,j＝4.0hz,2h),5.62(q,j＝8.0hz,1h),4.44(d,j＝16.0hz,1h),4.20(d,j＝12.0hz,1h),2.99(s,3h),1.68(d,j＝8.0hz,3h)，1.32(s,18h).
实施例17：(10r)-7-氨基甲基磷酸二叔丁酯-12-氟-2,10-二甲基-16-环丙基-5-氧代-10,15,16,17-四氢-2h-8,4-(次甲基桥)-吡唑并[4,3-h][2,5,11]苯并氧杂二氮杂十四熳环-3-甲腈(化合物17)
合成方法参照实施例10，其中中间体9代替为中间体40。
esi-msm/z:655.3[m+h]+
lhnmr(400mhz,dmso-d6)δ:9.28(s,1h),7.61-7.58(m,2h),7.48-7.45(m,1h),7.20-7.16(m,1h),6.81(s,1h),6.36(d,j＝4.0hz,2h),5.61(q,j＝8.0hz,1h),4.44(d,j＝16.0hz,1h),4.20(d,j＝12.0hz,1h),4.04(s,3h),2.30-2.22(m,1h),1.68(d,j＝8.0hz,3h),1.32(s,18h),0.83-0.56(m,4h).
实施例18：(10r)-7-羟甲基氨基-12-氟-2,10-二甲基-16-环丙基-5-氧代-10,15,16,17-四氢-2h-8,4-(次甲基桥)-吡唑并[4,3-h][2,5,11]苯并氧杂二氮杂十四熳环-3-甲腈(化合物18)
合成方法参考实施例1的合成，其中中间体9代替为中间体40。
esi-msm/z:463.3[m+h]+。
lhnmr(400mhz,dmso-d6)δ:9.29(s,1h),7.61-7.58(m,2h),7.48-7.45(m,1h),7.20-7.16(m,1h),6.81(s,1h),6.39(d,j＝4.0hz,2h),5.61(q,j＝8.0hz,1h),4.44(d,j＝16.0hz,1h),4.20(d,j＝12.0hz,1h),4.03(s,3h),2.30-2.22(m,1h),1.67(d,j＝8.0hz,3h),0.83-0.56(m,4h).
实施例19探究新型苯并氧杂二氮杂十四碳烯衍生物的alk抑制作用
野生型alk与l1196m突变体alk酶分析
用微射流迁移率变动分析测量野生型alk与l1196m突变体alk酶抑制作用。在96孔盘中以50μl体积进行反应，其含有预活化的人重组野生型(1.3nm)或l1196m(0.5nm)alk激酶结构域(第1093至1411位氨基酸)、1.5μm磷受体肤、5'fam-kksrgdymtmqig-conh2(cpcscientific,sunnyva1e,ca)、试验化合物(11-剂量三倍连续稀释，最终2％二甲亚枫)或纯二甲亚砜、1mmdtt、0.002％tween-20与5mm氯化镁/25mmhepes(ph7.1)，预温育20分钟，加入atp(60μm终浓度，～km等级)来起始。以室温温育反应物1小时，加入0.1medta(ph8)来终止，以labchipezreaderii(ca1iperlifesciences,hopkinton,ma)电泳分离荧光标记的肽底物与磷酸化产物，测定反应程度(在无抑制剂下～5％至20％转化率)。动力学与结晶学研究证实该抑制剂是atp竞争性的。用非线性回归法(graphpadprism,graphpadsoftware,sandiego,ca)使转化率拟合竞争性抑制用的方程式来计算出ki值，以及通过实验测得野生型atpkm58μm和l1196m激酶的atpkm值＝55μm。自己制备atp酶(杆状病毒表达)，在室温、2mmatp、10mm氯化镁与4mmdtt/20mmhepes(ph7.5)存在下、利用16μm未活化的酶的自体磷酸化预活化～1小时，通过q-tof质谱法证实alk激酶结构域完全磷酸化(每个蛋白质分子～4个磷酸化物)。
eml4-alk用的细胞phospho-alk(tyr1604)elisa分析：
细胞株：
nih-3t3eml4-alkwtv1与nih-3t3eml4-alkv1ll196m细胞是人类稳定细胞株。将该细胞保存于37℃与5％二氧化碳培养箱内t-75烧瓶中的dmem(invitrogen,car1sbad,ca)培养基中，该培养基添加1％l-谷氨酰胺、1％青霉素与链霉素、1μg/ml嘌呤霉素与10％新生牛血清(ncs)。
分析：
用pbs洗涤细胞，使细胞悬浮于dmem培养基中，该培养基添加0.5％ncs和1％青霉素与链霉素，以20,000个细胞/孔/100μl的密度接种于96孔盘中，在37℃与5％二氧化碳培养箱内温育。在温育20小时后将100μl含有指定pf-合物浓体或对照组(二甲亚砜)的检验培养基dmem加入盘中，以培养箱温育1小时。除去培养基，将含有磷酸酯酶抑制剂与苯甲磺酰氟(pmsf)的裂解液加入孔中，以4℃震荡30分钟得到蛋白质裂解液。随后用pathscanphospho-alk(tyr1604)化学发光三明治型elisa试剂盒(cellsignaltechnologyinc.,cat#7020)评估alk的磷酸化，请参见下列：
将phospho-alk(tyr1604)兔抗体涂覆于96孔微型盘上。取50μl细胞裂解液加到涂覆抗体的盘中，以室温温育2小时。用0.1％tween20/pbs大量洗涤除去未结合的物质，加入alk小鼠mab以检测被捕获的phospho-alk(tyr1604)与phospho-alk融合蛋白。然后用抗小鼠igg(hrp酶结合抗体)辨识结合检验抗体。最后加入化学发光剂，温育10分钟使信号发展。用envision板读数仪以发光模式读取该检验定盘。用四参数分析法通过浓度反应曲线拟合计算出ic50值。
alk酶分析和wteml4-alk与l1196meml4-alk用的细胞phospho-alk(tyr1604)elisa分析得到的ki与ic50数据表示在表1。
表1不同化合物的细胞抑制性能结果
通过野生型alk与l1196m突变体alk酶活性数据分析，其中化合物4、5、6在激酶水平和细胞水平上均体现了优于劳拉替尼的效果，化合物1、2、3、7、8、9、18在激酶水平和细胞水平上与劳拉替尼表现相当；化合物10、11、12、13、15、16、17作为磷酸酯前药虽然在激酶水平上稍弱于劳拉替尼，但是，其中的化合物10、11、12、13、14均为化合物1的前体、化合物15是化合物7的前体、化合物16是化合物9的前体，化合物17是化合物18的前体，它们在细胞水平的效果是与劳拉替尼相当的。
实施例20探究新型苯并氧杂二氮杂十四碳烯衍生物的代谢稳定性
使用人体肝脏微粒体进行化合物稳定性的评价。将实施例化合物的肝微粒体酶稳定性与lorlatinib(pf-06463922)进行比较。
测定系统：本发明化合物的代谢稳定性利用由男女混合的肝脏微粒体用1mmnadph进行试验。样品使用质谱仪进行分析。将hrms用于确定峰面积响应比率(对应于试验化合物或对照物的峰面积除以分析内标的峰面积)而不运行标准曲线。为了检测到所有的可能代谢物，在适当的m/z范围内进行hrms扫描。
测定条件：该测定用一次孵育(n＝1)v进行。将试验化合物在37℃下在含有0.5毫克/毫升肝脏微粒体蛋白的缓冲液中孵育。通过加入辅因子引发反应，并于0、2、4、8、16、24、36、48小时取样，平行孵育阳性对照物(5μm睾丸素)并于0、2、4、8、16、24、36、48小时取样。
测定质量控制：平行进行对照化合物睾丸素以证实(肝脏)微粒体的酶活性。最终时间点后，利用荧光测定法来确认nadph添加到反应混合物中。对照物的t1/2满足可接受的内标。
分析方法：
液相色谱柱：thermobdshypersilc1830x2.0mm，3μm，具有保护柱m.p.，缓冲液:25mm甲酸接缓冲液，ph3.5；
水相(a)：90％水，10％缓冲液；
有机相(b)：90％乙腈，10％缓冲液；
流速：300微升/分钟
自动进样器：注射体积10微升
梯度程序参见表2。
表2梯度程序
通过使用人体肝微粒体，如本发明中所述实施例4、5、6表现出大于36小时的代谢半衰期，10、12、15、16、17表现出24-36小时的代谢半衰期，显著大于lorlatinib(pf-06463922)20小时的代谢半衰期，实施例1、2、3、7、8、9、11、13、14、18表现出于lorlatinib(pf-06463922)相似代谢半衰期。结果显示，相对较长的代谢半衰期使得它们具有降低医疗剂量和扩大给药时间间隔的潜能。
由实施例1-17的化合物的酶活性、ic50值及代谢半衰期数据可知，对于通式(i)类的化合物而言，连接基团和取代基团对于化合物的药效学性能和代谢稳定性有着重要的影响。尽管本发明通过之前的特定实施例说明，但不应将其解释为受此限制；而是本发明涵盖之前公开的一般方面。可在不背离本发明的精神和范围下进行多种修饰并具有多种实施方案。