本发明公开了一种抗微生物肽mspiscidin-2、其编码基因及用途，具体地，提供了一种来源于大口黑鲈(micropterussalmoides)的piscidin家族广谱抗微生物肽mspiscidin-2及其基因，制备方法和在抗病原微生物感染、医疗、生物制药及水产养殖病害防治中的应用，属于生物医学技术领域。
背景技术：
piscidin家族抗菌肽是一类来源于鱼类的抗菌肽，是鱼类体内非特异性免疫系统的重要组成部分，通常由20-50个氨基酸残基组成，具有α螺旋结构，富含阳离子，具有疏水性和两亲性，具有广谱的杀菌、抗肿瘤、抗病毒的活性。在最早从杂交斑纹鲈鱼的肥大细胞中发现piscidin后，piscidin陆续在比目鱼、金头海鲷、大黄鱼等许多鱼类体内被发现。鱼类属于原始的低等脊椎动物，其生活环境相对比较复杂，由于其自身的免疫器官相对发育进化不够完善，自身的后天免疫系统相对于其他高等的脊椎动物而言是非常脆弱的，其适应性免疫的免疫球蛋白和免疫记忆也都相对比较缺乏，因此当它们面对复杂的生活环境及病原细菌的危害时，主要依赖于自身的先天免疫系统来抵抗外源因子的侵害进行自我保护。研究表明抗菌肽是鱼类先天性免疫系统中的重要组成部分，当鱼类受到外源因子侵害时会诱导自身产生大量的抗菌肽从而进行防御保护。随着研究的深入越来越多的抗菌肽从鱼类中分离出来，预示着抗菌肽是鱼类先天性免疫系统中最重要的防御线。目前，已经从鱼类的唾液组织、粘液组织等容易受到外源因子侵害的部位和免疫器官中发现了大量的抗菌肽，其中包括从杂交斑纹鲈鱼中发现的piscidin和hepcidin抗菌肽，从比目鱼粘液组织中发现的pleurocidin抗菌肽，另有研究学者从大西洋八目鳗鱼中发现cathelicidins抗菌肽。
目前抗菌肽的应用主要集中于医药领域的开发，并且取得了一些令人满意的成果，已经有许多新型药物逐步迈入医药市场。比如，来自爪蟾抗菌肽magainin的pexiganan，由genaera公司开发，目前以外用霜剂的形式用来治疗脓疱病和糖尿病患者足底溃烂等，已经进入临床iii期试验阶段，它也是第一个进行商业开发的抗菌肽；daptomycin是一种阴离子抗菌肽，由cubitpharmaceuticals公司研发，2003年9月由美国食品与药物管理局(fda)批准上市；来自猪白细胞的iseganan，由intrabiotics公司开发，用药途径是口服液或喷雾剂，用来治疗抗肿瘤治疗引发的口腔炎和囊肿性纤维化病人肺感染，目前也处于临床iii期试验阶段；来自于牛的mbi-肽，由micrologix生物技术公司，以外用乳膏的形式用来治疗尿道相关的血流感染，处于iii期临床；来自人唾液的histatin衍生肽，做成口腔洗剂，用来治疗牙根炎和口腔感染(ii-iii期临床)、口腔念珠菌感染(ii期临床)和慢性绿脓杆菌感染(i期临床)。可见，抗菌肽在医药领域有着很好的应用前景，不仅限于医药领域，在农业、畜牧业和日化用品领域，抗菌肽也存在巨大的应用潜能。
我国是渔业大国，水产品总产量位居世界首位。但是，近几年，随着高密度、集约化养殖模式的发展，水环境的污染程度加重，各种细菌性和病毒性疾病频发，防治疾病大量使用抗生素破坏水环境的微生态平衡，导致某些病原体对药物产生了耐药性，危害人体健康等。相继发生的水产养殖或水产品加工过程中过量使用渔用药物或加入禁用药物导致的“孔雀石绿事件”、“多宝鱼事件”、“氯霉素事件”等，给水产业蒙上一层浓厚的阴影，对消费者的人身安全造成威胁，也因此食品安全问题更加受到人们的关注。近年来，我国已有研究利用抗菌肽替代传统抗生素针对抗水产养殖过程中常见病原菌，如嗜水气单胞菌(aeromonashydrophila)、梅氏弧菌(vibriometschnikovi)、迟钝爱德华氏菌(edwardsiellatarda)及温和气单胞菌(aeromonassobria)均有较好的抑菌效果。通过饲料摄入抗菌肽，对南美白对虾亲虾产卵、孵化率及虾苗饲养，和对成虾的饲养效果明显优于金霉素。抗菌肽制品在对虾的饲料或水体中能对水中的微生物加以控制，使致病微生物如弧菌等均能杀灭，通过饲料摄入虾体内能提高免疫力和促进生长等功效。关于piscidin的研究表明，石斑鱼和斑马鱼口服或注射使用含有piscidin的药物可以提高其抗弧菌感染能力，另有研究报道，piscidin还能够有效的抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌的生长，此外还有研究称，小鼠感染耐药菌株金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantstaphylococcusaureus，mrsa)，通过给药小鼠piscidin可有效抑制小鼠体内细菌数量，从而使小鼠存活下来。抗菌肽在抗肿瘤方面也有显著效果，epinecidin-1能够有效地抑制肿瘤细胞的生长。有研究报道，将抗菌肽添加饲料投喂鲤鱼，能够引起鲤鱼血清磷酸酶活性显著提高，血清中免疫因子，免疫球蛋白和白介素含量也明显提高，有效的提高了鲤鱼的免疫力。
大口黑鲈(micropterussalmoides)，又名加州鲈鱼，属太阳鱼科，黑鲈属，属广温性鱼类，原产北美洲密西西比河流域。1983年引入广东省，现在是在广东、江苏、浙江、江西、四川和福建等省份的主要养殖鱼类，是我国重要的淡水养殖品种。本次发明的加州鲈鱼抗微生物肽mspiscidin-2，将其全序列氨基酸结构经ncbi蛋白质数据库进行搜寻比对，未发现有任何相同多肽。发明人将本发明的加州鲈鱼mspiscidin-2编码基因经ncbi基因数据库进行搜寻比对，未发现有任何相同基因。
技术实现要素：
本发明提供一种在亚微摩尔剂量下即具有很强的抗微生物活性的来源于加州鲈鱼的一种抗微生物肽，mspiscidin-2及其基因、化学合成方法和应用。本发明的目的是基于上述理论研究和现有技术基础，提供一种具有强烈的抗菌活性，尤其针对水产养殖中多种常见病原菌的加州鲈鱼mspiscidin-2及其应用，着重水产养殖领域。
为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种抗微生物肽mspiscidin-2，其氨基酸序列为苯丙氨酸1-亮氨酸2-赖氨酸3-组氨酸4-异亮氨酸5-赖氨酸6-丝氨酸7-苯丙氨酸8-色氨酸9-精氨酸10-甘氨酸11-丙氨酸12-赖氨酸13-丙氨酸14-异亮氨酸15-苯丙氨酸16-精氨酸17-甘氨酸18-丙氨酸19-精氨酸20-谷氨酰胺21-甘氨酸22-色氨酸23-精氨酸24-谷氨酸25-组氨酸26-精氨酸27(flkhiksfwrgakaifrgarqgwrehr)，如seqidno:1所示。
进一步地，所述的抗微生物肽mspiscidin-2来源于加州鲈鱼脾脏和头肾组织，选取加州鲈鱼脾脏和头肾组织，洗涤，匀浆，获得组织蛋白粗提物。随后，sephadexg-50凝胶过滤层析，用自动部分收集器收集3ml/管，220nm检测并收集各峰检测抗菌活性，冻干备用。然后经反相高压液相层析(rp-hplc)进行梯度洗脱，收集各多肽样品峰，用灭菌去离子水溶解，检测抗菌活性。最后对得到多肽样品进行一级结构的解析，包括采用电喷雾四级杆飞行时间串联质谱法测定分子量。利用等电聚焦电泳测定其等电点，用edman降解法确定其多肽氨基酸序列组成。多肽全序列一级结构为：苯丙氨酸1-亮氨酸2-赖氨酸3-组氨酸4-异亮氨酸5-赖氨酸6-丝氨酸7-苯丙氨酸8-色氨酸9-精氨酸10-甘氨酸11-丙氨酸12-赖氨酸13-丙氨酸14-异亮氨酸15-苯丙氨酸16-精氨酸17-甘氨酸18-丙氨酸19-精氨酸20-谷氨酰胺21-甘氨酸22-色氨酸23-精氨酸24-谷氨酸25-组氨酸26-精氨酸27。
进一步地，mspiscidin-2是加州鲈鱼piscidin基因编码的一种直链多肽，含有27个氨基酸残基，理论等电点(pi)为12.69，理论分子量为3.34kda，含有10个碱性氨基酸残基(5个精氨酸、3个赖氨酸和2个组氨酸)，含有两个酸性氨基酸残基(1个谷氨酸、1个谷氨酰胺)，静电荷为+8，说明它是一种较强的碱性多肽。mspiscidin-2不含半胱氨酸，因此没有分子内和分子间二硫键，结构简单。mspiscidin-2全序列为：苯丙氨酸1-亮氨酸2-赖氨酸3-组氨酸4-异亮氨酸5-赖氨酸6-丝氨酸7-苯丙氨酸8-色氨酸9-精氨酸10-甘氨酸11-丙氨酸12-赖氨酸13-丙氨酸14-异亮氨酸15-苯丙氨酸16-精氨酸17-甘氨酸18-丙氨酸19-精氨酸20-谷氨酰胺21-甘氨酸22-色氨酸23-精氨酸24-谷氨酸25-组氨酸26-精氨酸27。
第二方面，本发明提供了一种编码上述的抗微生物肽mspiscidin-2的核酸分子。
具体地，加州鲈鱼mspiscidin-2基因的克隆包括：加州鲈鱼头肾和脾脏总rna提取，mrna纯化，mrna反转录及cdna文库构建，设计引物，利用pcr方法筛选加州鲈鱼抗菌肽mspiscidin-2基因。获得阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定。基因测序结果表明编码抗菌肽mspiscidin-2前体piscidin的基因由465个核苷酸组成，如seqidno:7所示，自5’端至3’端序列为:
编码加州鲈鱼piscidin成熟肽mspiscidin-2的为第67-147位核苷酸。
第三方面，本发明提供了一种重组载体，其包含编码抗微生物肽mspiscidin-2的核酸分子。
第四方面，本发明提供了一种用上述的重组载体转化的宿主细胞，所述宿主细胞选自原核细胞和真核细胞，优选为真核细胞，更优选哺乳动物细胞。
本发明上述的抗微生物肽mspiscidin-2可通过基因工程方法制备或通过化学方法制备。
mspiscidin-2的基因工程制备方法：
所述方法包括将上述的宿主细胞在适合所述宿主细胞生长的培养基中进行培养以形成并积累上述抗微生物肽mspiscidin-2，以及从培养物中回收所积累的所述抗微生物肽mspiscidin-2。
mspiscidin-2的化学制备方法：
抗微生物肽mspiscidin-2的合成，包括以下步骤：
(1)根据基因编码的mspiscidin-2氨基酸序列，用自动多肽合成仪合成其全序列；
(2)通过hplc反相柱层析脱盐纯化，并确定其纯度大于95％；
(3)用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测定其分子量；等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。合成的mspiscidin-2抗菌肽可以溶于灭菌超纯水，用于药理活性检测。
第五方面，本发明提供了上述的抗微生物肽mspiscidin-2、上述第二方面提供的核酸分子、上述第三方面提供的重组载体在制备用于抗微生物感染的药物中的用途。
进一步地，所述微生物为革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌。革兰氏阳性菌选自溶藻弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、巴西弧菌、霍乱弧菌、河流弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、灿烂弧菌、创伤弧菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和维氏气单胞菌。革兰氏阳性菌选自金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和星状诺卡氏菌。
进一步地，所述的药物用于水产养殖病害防治。
第六方面，本发明提供了上述的抗微生物肽mspiscidin-2、上述第二方面提供的核酸分子、上述第三方面提供的重组载体作为化妆品、保健品、食品的添加剂的用途，以替代抗生素或防腐剂。
第七方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含有效量的上述的抗微生物肽mspiscidin-2、上述第二方面提供的核酸分子或上述第三方面提供的重组载体，以及药学上可接受的载体。
本发明的有益效果在于：
通过基因克隆得到编码加州鲈鱼piscidin抗微生物肽的基因，再通过化学合成方法得到成熟肽mspiscidin-2。该抗微生物肽富含碱性氨基酸，对水产养殖常见病原菌均具有很强的杀菌作用，结构简单，不含有二硫键及环状结构，方便化学合成及基因工程制备，同时也不易引起耐药性产生。
具体实施方式
下面结合技术方案详细叙述本发明的具体实施例，但本发明的内容并不局限于此。以下提供了本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
为了更容易理解本公开，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
本文中使用的术语“核酸分子”是指dna分子和rna分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链dna。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。
术语“载体”是指能够递送一个或多个目标基因或序列并且优选地在宿主细胞中表达其的构建体。载体的实例包括，但不限于，病毒载体、裸露dna或rna表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子凝聚剂缔合的dna或rna表达载体、包封在脂质体中的dna或rna表达载体和某些真核生物细胞诸如生产细胞。在本公开的一个实施方案中，载体是“质粒”，其是指可将另外的dna区段连接至其中的环状双链dna环。在另一个实施方案中，载体是病毒载体，其中可将另外的dna区段连接至病毒基因组中。本文中公开的载体能够在已引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌的复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)或可在引入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组，从而随宿主基因组一起复制(例如，非附加型哺乳动物载体)。
术语“宿主细胞”是指已向其中引入了表达载体的细胞。宿主细胞可包括微生物(例如细菌)、植物或动物细胞。易于转化的细菌包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)的成员，例如大肠杆菌(escherichiacoli)或沙门氏菌(salmonella)的菌株；芽孢杆菌科(bacillaceae)例如枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)；肺炎球菌(pneumococcus)；链球菌(streptococcus)和流感嗜血菌(haemophilusinfluenzae)。适当的微生物包括酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)和毕赤酵母(pichiapastoris)。适当的动物宿主细胞系包括cho(中国仓鼠卵巢细胞系)和ns0细胞。
本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括后代。因此，单词“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物，而不考虑转移数目。还应当理解的是，由于故意或非有意的突变，所有后代在dna含量方面不可能精确相同。包括具有与最初转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后代。在意指不同名称的情况下，其由上下文清楚可见。
本文使用的“聚合酶链式反应”或“pcr”是指其中微量的特定部分的核酸、rna和/或dna如在例如美国专利号4,683,195中所述扩增的程序或技术。一般来说，需要获得来自目标区域末端或之外的序列信息，使得可以设计寡核苷酸引物；这些引物在序列方面与待扩增模板的对应链相同或相似。2个引物的5’末端核苷酸可以与待扩增材料的末端一致。pcr可用于扩增特定的rna序列、来自总基因组dna的特定dna序列和由总细胞rna转录的cdna、噬菌体或质粒序列等。一般参见mullis等(1987)coldspringharborsymp.ouant.biol.51:263；erlich编辑，(1989)pcrtechnology(stocktonpress,n.y.)。本文使用的pcr被视为用于扩增核酸测试样品的核酸聚合酶反应法的一个实例，但不是唯一的实例，所述方法包括使用作为引物的已知核酸和核酸聚合酶，以扩增或产生核酸的特定部分。
“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，所述其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
“有效量”包含足以改善或预防医学疾病的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：例如，待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。本公开的一个实施方式中，“有效量”为获得消除或降低风险、减轻严重性或延迟病症的发作(包括但不限于，病症、其并发症和在病症的发展过程中呈现的中间病理表型的生物化学、组织学和/或行为症状)的任一种或多种有益结果所必需的药物、化合物或药物组合物的量；在另一个实施方式中，“有效量”为获得有益的或所需的临床结果(包括但不限于，诸如减少各种凝血酶相关病症的发病率或改善所述病症的一个或多个症状，减少治疗病症所需的其它药剂的剂量，增强另一种药剂的疗效，和/或延缓患者的凝血酶相关病症的进展)所必需的药物、化合物或药物组合物的量。
实施例1抗微生物肽mspiscidin-2的分离纯化
(1)从生鲜市场买回鲜活的加州鲈鱼，活体解剖取其新鲜完整脾脏和头肾组织，用生理盐水少许洗涤脾脏和头肾组织表面。匀浆后，用少量生理盐水溶解，按匀浆组织溶解液与正丁醇1：50(v/v)比例，把匀浆组织溶解液与正丁醇在室温下搅拌60min，13000r/min，20min离心两次，然后将沉淀冻干。随后，第一步sephadexg-50凝胶过滤层析：0.9g冻干粉用10ml0.1m磷酸盐(na2hpo4-nah2po4,ph6.0)缓冲液溶解，12000rpm离心10min，取上清液上样于已平衡好的sephadexg-50凝胶排阻色谱柱(1.6cmx90cm,amershambioscience)，用同样缓冲液洗脱，流速3ml/10min，用自动部分收集器收集3ml/管，220nm检测并收集各峰检测抗菌活性，冻干备用。
(2)反相高压液相层析(rp-hplc)：将sephadexg-50凝胶排阻色谱分离得到的活性成分的峰重新溶解于纯水中，4℃，12000rpm离心15min，取上清液，用0.45μm滤膜过滤，收集滤液上样于经含1‰三氟乙酸的超纯水充分平衡的c18反相柱(hypersilbdsc18,30cmx0.46cm)用乙腈(含1‰三氟乙酸)构成的洗脱系统进行梯度洗脱，215nm检测多肽浓度。收集得到的各峰，冻干浓缩，用灭菌的去离子水重新溶解并进行抗菌活性检测。
(3)活性多肽一级结构分析。纯化的mspiscidin-2采用电喷雾四级杆飞行时间串联质谱法(esi-q-tof-ms,biosystems/mdssciex,多伦多，加拿大)测定分子量。利用等电聚焦电泳测定其等电点，用edman降解法确定了其氨基酸序列组成为mspiscidin-2：flkhiksfwrgakaifrgarqgwrehr(seqidno:1)。
实施例2mspiscidin-2前体基因的克隆及基因测序
第一步、加州鲈鱼头肾和脾脏混合物总rna提取(以下实验所用器具和试剂均经过处理，无rnase)：
a.从加州鲈鱼活体解剖从头肾和脾脏新鲜组织上分别剪下1g左右的小块，放入液氮预冷的细胞冻存管中，然后迅速放入液氮中保存；
b.将保存在液氮中的组织材料取出，放入预冷的研钵内，迅速充分研磨，期间不断向研钵内加入少许液氮；将大约30mg的组织粉末转移至预冷的1.5ml离心管中，向其中加入1ml总rna提取缓冲液(trizol，美国life公司产品)，充分混匀，之后于4℃，12000rpm离心10min；
c.将离心后的上清转移至新的1.5ml离心管中，加入200μl氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟，之后于4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。
d.取上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，以4℃，12000rpm离心10分钟，收集沉淀用75％(v/v)乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为加州鲈鱼头肾和脾脏混合物总rna。
第二步、cdna文库的构建，采用clontech公司in-fusionsmartertmdirectionalcdnalibraryconstructionkit合成。
cdna第一链的合成(mrna反转录)：
a.在新的0.2mlpcr管(无dnase和rnase)中配制下列混合液：
混合均匀，短暂离心(2000rpm，30s)；离心后于pcr仪中72℃保温3min后，然后再将pcr管在42℃孵育2min；短暂离心后，在上述管中配制如下反转录反应液：
混合均匀后，短暂离心(2000rpm，30s)；在pcr仪中完成以下程序：
42℃，90min；68℃，10min；之后将离心管置于冰上终止第一链的合成。从离心管取2μl所合成的cdna第一链备用。
第二链的合成：采用长末端聚合酶链式反应(ld-pcr)方法扩增第二链(所用试剂均为clontech公司in-fusionsmartertmdirectionalcdnalibraryconstructionkit建库试剂盒中配备)
上述在95℃预热的pcr管中进行混合。
之后在pcr仪中按以下程序扩增：
95℃，1min；18个循环：95℃，15s，65℃，30s，68℃，6min。循环结束后，将离心管中合成的cdna双链-80℃保存。
第三步、加州鲈鱼抗微生物肽mspiscidin-2编码基因克隆
根据piscidin家族抗菌肽信号肽区的保守序列，人工设计合成正向引物p1：5’-gtattrtgatctttcttgtgytgtc-3’(seqidno:2)，反向引物为clontech公司in-fusionsmartertmdirectionalcdnalibraryconstructionkit中的3’-pcr引物，其序列为5’-cggggtacgatgagacaccat-3’(seqidno:3)。引物使用前先12000rpm离心5min,然后根据标明的摩尔数加入相应体积的ddh2o溶解至20μm的浓度。以合成的cdna为模板，以p1和in-fusionsmartercds为引物，进行第一次pcr扩增。在0.2mlpcr管中加入下列试剂(总体积20μl)：
混匀后，短暂离心。pcr条件为：95℃变性4min；30个循环：95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min；72℃延伸10min；4℃保存。反应结束后，取5μl产物于1％琼脂糖凝胶电泳检测目的条带。
取上步pcr产物1μl加入99μlddh2o稀释100倍作为模板，以p2：5’-ggtcgtcctcatggctgaacc-3’(seqidno:4)和cdsⅲ：5’-cggggtacgatgagacaccat-3’(seqidno:3)为引物，进行第二次pcr扩增。在0.2mlpcr管中先后加入下列试剂(总体积20μl)：
pcr条件为：95℃变性4min；25个循环：95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min；72℃延伸10min；4℃保存。反应结束后，取5μl，1％琼脂糖凝胶电泳检测目的条带。
扩增完成后用胶回收试剂盒(天根生物)进行目的片段回收。将回收的目的dna片段与测序载体pmd19-tvecter(takara,大连)连接，转化dh5α感受态细胞。取100μl转化菌液均匀涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素(amp)的lb固体琼脂培养基平板上，将平板放在37℃恒温培养箱中倒置培养12-16h。挑取单菌落用m13引物(正向m13-f：5’-gtaaaacgacggccagtg-3’(seqidno:5)；反向m13-r：5’-caggaaacagctatgacc-3’(seqidno:6))进行pcr检测插入片段大小。挑取阳性菌落，摇菌提取质粒，使用appliedbiosystemsdnasequencer,modelabiprism377进行核苷酸测序。
第四步、加州鲈鱼piscidin的基因序列测定和结果：
基因测序结果表明编码mspiscidin-2前体piscidin的基因由基因测序结果表明编码抗菌肽mspiscidin-2前体piscidin的基因由465个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为(seqidno:7):
加州鲈鱼piscidin编码区的cdna核苷酸的序列为：序列长度为465个碱基，序列类型：核酸，链数：单链，拓扑学：直链状，序列种类：cdna，来源：加州鲈鱼头肾和脾脏。
编码加州鲈鱼piscidin成熟肽mspiscidin-2为第67-147位核苷酸，其氨基酸序列为：flkhiksfwrgakaifrgarqgwrehr(seqidno:1)，即：苯丙氨酸1-亮氨酸2-赖氨酸3-组氨酸4-异亮氨酸5-赖氨酸6-丝氨酸7-苯丙氨酸8-色氨酸9-精氨酸10-甘氨酸11-丙氨酸12-赖氨酸13-丙氨酸14-异亮氨酸15-苯丙氨酸16-精氨酸17-甘氨酸18-丙氨酸19-精氨酸20-谷氨酰胺21-甘氨酸22-色氨酸23-精氨酸24-谷氨酸25-组氨酸26-精氨酸27。
实施例3mspiscidin-2的化学制备方法：
(1)根据编码加州鲈鱼piscidin基因推断的成熟肽mspiscidin-2氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433a,appliedbiosystems)合成其全序列。
(2)通过hplc反相c18柱层析对合成多肽进行脱盐纯化：过程中使用柱子是gemini-nx5μc18100a，4.6×250mm；溶剂a是0.1％trifluoroacetic溶于100％乙腈，溶剂b是0.1％trifluoroacetic溶于100％水；梯度设为：0.01min(a10％，b90％)，25min(a70％,b30％)，25.1min(a100％，b0％)，30min(stop)；流速为1.0ml/min，波长为220nm，体积为20μl，结果测得合成的多肽序列纯度大于95％。
(3)分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(maldi-tof)：首先将mspiscidin-2样品分散在基质分子中并形成晶体，然后用激光照射晶体，基质从激光中吸收能量，样品解吸附，基质-样品之间发生电荷转移使得样品分子电离，电离的样品在电场作用下飞过真空的飞行管，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即通过离子的质量电荷之比(m/z)与离子的飞行时间成正比来分析离子，并测得样品分子的分子量，得到mspiscidin-2样品的分子量是3339.86da。
(4)等电聚焦电泳测定等电点：配胶：胶液组成为载体两性电解质，凝胶贮液，蒸馏水，混合样品，染色物质等，灌胶，加电极液，电泳，样品收集进行检测，得到mspiscidin-2等电点。
(5)用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。合成的mspiscidin-2抗菌肽可以溶于灭菌超纯水或pbs，用于药理活性检测。
加州鲈鱼抗微生物肽mspiscidin-2是基因编码的一种小分子多肽，由27个氨基酸残基组成，分子量3.34kda，等电点12.69。加州鲈鱼抗微生物肽mspiscidin-2全序列为：flkhiksfwrgakaifrgarqgwrehr(seqidno:1)，即：苯丙氨酸1-亮氨酸2-赖氨酸3-组氨酸4-异亮氨酸5-赖氨酸6-丝氨酸7-苯丙氨酸8-色氨酸9-精氨酸10-甘氨酸11-丙氨酸12-赖氨酸13-丙氨酸14-异亮氨酸15-苯丙氨酸16-精氨酸17-甘氨酸18-丙氨酸19-精氨酸20-谷氨酰胺21-甘氨酸22-色氨酸23-精氨酸24-谷氨酸25-组氨酸26-精氨酸27。
测试例加州鲈鱼抗微生物肽mspiscidin-2的抗菌活性检测：
(1)mspiscidin-2抗菌活性检测：
将化学合成的mspiscidin-2以2mg/ml的浓度溶解在无菌超纯水中；用接种环挑取新活化的微生物，然后均匀涂布在新的mh(mueller-hintonagarplate)琼脂板上；将直径0.5cm的圆形无菌滤纸片放在上述琼脂板上，然后向纸片上缓慢滴加10μlmspiscidin-2样品溶液；放入37℃恒温培养箱中培养12-24h；观察是否会形成抑菌圈，将对mspiscidin-2敏感的菌株记录下来。
(2)mspiscidin-2对敏感菌株最小抑菌浓度(minimuminhibitoryconcentration，mic)测定：
该实验以无菌液体mh培养基作阴性对照，最小抑菌浓度的定义为肉眼可以观察到的完全抑制微生物生长的最低多肽浓度，或者是光吸收值不高于阴性对照5％的最低浓度。挑取新活化的微生物，接种至无菌液体mh培养基，37℃恒温振荡器中200rpm培养10-16h至对数生长期；用紫外分光光度计测菌液600nm光波处的吸光值，吸光值为1时，浓度大约为109cfu/ml，将菌液用无菌液体mh培养基稀释至106cfu/ml，冰上待用；在无菌96微孔板上配制浓度梯度为200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、1.5625μg/ml的经0.22μm孔径无菌滤膜过滤的mspiscidin-2样品溶液(即59.8828μm、29.9414μm、14.9707μm、7.4853μm、3.7427μm、1.8713μm、0.9357μm、0.4678μm、0.2339μm)，每孔50μl；每孔加入50μl上述稀释菌液，充分混匀后，则mspiscidin-2样品终浓度为100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、1.5625μg/ml、0.78125μg/ml(即29.9414μm、14.9707μm、7.4853μm、3.7427μm、1.8713μm、0.9357μm、0.4678μm、0.2339μm)，在37℃培养箱中培养10-16h；使用酶标仪测600nm处吸光值或肉眼观察；上述实验重复3次，取平均值。
(3)mspiscidin-2对嗜水气单胞菌和副溶血弧菌的杀菌动力学：
将嗜水气单胞菌接种到mh固体培养基平板上，37℃培养箱中倒置培养至菌落长出。用接种环挑取单菌落接种到mh液体培养基中，37℃振荡培养箱中培养到对数生长期。用新鲜的mh液体培养基将菌液稀释至1×106cfu/ml，将mspiscidin-2样品加入稀释好的菌液中，使其终浓度为5×mic(阴性对照加入相应体积的灭菌超纯水)。加入样品的菌液迅速放入37℃振荡培养箱中，150rpm振荡培养，分别于0min、15min、30min、60min、120min、180min取10μl菌液用灭菌的生理盐水稀释500倍，取50μl涂布mh固体平板。以硫酸新霉素作为阳性对照。平板放入37℃培养箱中倒置培养16h，之后进行菌落计数。
mspiscidin-2对副溶血弧菌的杀菌动力学方法也如上所述。:
结果参见下表1-3：
表1.mspiscidin-2的最小抑菌浓度(mic)
*mic：minimalinhibitconcentration最小抑菌浓度，浓度值为3次重复实验的平均值；以上结果为三次独立重复实验平均值。
由表1可见，mspiscidin-2对测试的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有很强的抗菌活性，测试菌株多为水产养殖致病菌，其mic值处于2.8085-11.2280μm的范围。
表2.mspiscidin-2对金黄色葡萄球菌cmcc26003的杀菌动力学
由表2可知，mspiscidin-2在15分钟以内就能够杀死全部金黄色葡萄球菌cmcc26003的，而阳性对照硫酸新霉素需要30分钟才能全部杀死全部金黄色葡萄球菌cmcc26003，表3显示mspiscidin-2在120分钟内杀死全部创伤弧菌，与阳性对照硫酸新霉素相当，结果证明了mspiscidin-2不仅有很强的杀菌活性，并且其杀菌速度也要快于抗生素药物硫酸新霉素或与之相当；不仅如此，mspiscidin-2对细菌的作用是致死性的，金黄色葡萄球菌cmcc26003和创伤弧菌经mspiscidin-2作用后全部死亡，3小时后无细菌恢复生长，显示了mspiscidin-2的良好和持久的杀菌作用。
序列表
<110>大连理工大学
<120>一种抗微生物肽mspiscidin-2、其编码基因及用途
<130>2020
<160>7
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>27
<212>prt
<213>大口黑鲈micropterussalmoides
<400>1
pheleulyshisilelysserphetrpargglyalalysalailephe
151015
argglyalaargglnglytrparggluhisarg
2025
<210>2
<211>25
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物p1
<400>2
gtattrtgatctttcttgtgytgtc25
<210>3
<211>21
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物in-fusionsmartercds
<400>3
cggggtacgatgagacaccat21
<210>4
<211>21
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物p2
<400>4
ggtcgtcctcatggctgaacc21
<210>5
<211>18
<212>dna
<213>artificialsequence
<220>
<223>正向m13-f
<400>5
gtaaaacgacggccagtg18
<210>6
<211>18
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>反向m13-r
<400>6
caggaaacagctatgacc18
<210>7
<211>465
<212>dna
<213>大口黑鲈micropterussalmoides
<400>7
atgaagtttgttatgatctttctggtgctgtcgctggtcgtcctcatggctgaacccggg60
gagtgttttttaaaacacataaaatccttctggagaggggccaaggctatattcaggggt120
gccaggcagggatggagagaacacagagccttgtctaagcagcgcaagatggatcaaggg180
ggtggaggaaacgaagtggacaatggaactccgccatactggcagaaatgaatttgttca240
atcgaagggaagatttgagccacagagttctgctttgcaagaaacaaaaacatgagttaa300
gaaacctgttgtggagtttgtataaactacttcttttgtagttatttttggcacagctac360
aatttggttttaaacatttaaaattgcttaatattgcaagctgccctgctgaataaagtt420
gtgtaaaaggctaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa465