一种与连城白鸭白羽羽色相关的分子标记及连城白鸭杂交白羽后代的选育方法与流程

本发明涉及遗传改良
技术领域：
，具体涉及一种与连城白鸭白羽羽色相关的分子标记及连城白鸭杂交白羽后代的选育方法。
背景技术：
：杂交选育技术是快速改良肉鸭重要经济性状，培育满足市场需要新品种的有效手段。连成白鸭是我国著名的优质地方鸭品种，该鸭和其它鸭杂交后代会出现羽色性状分离，f1代全部为花羽和灰羽，f2代羽色性状进一步分离，出现黑羽、花羽、灰羽和白羽等多种羽色。传统选育连城白鸭杂交白羽后代的方法可见于已授权的专利《一种乌嘴青脚白羽肉鸭的制种方法》，但该方法仅获得了f2代白羽肉鸭群体，并未见该群体是否可以产生稳定的白羽后代，种用价值有限；还有报道利用连城白鸭和大体型肉鸭杂交获得纯白羽肉鸭新品系的方法，耗费至少6个世代，且每个世代都需要对几千只鸭进行了详细记录复杂的羽色性状(黑、白、花、灰等)，此方法费时费力，且后代中仍然会出现少量的杂色鸭。传统选育方法无法快速对肉鸭杂交过程中羽色性状进行纯化，限制了连城白鸭品种用于优质肉鸭的遗传改良用途。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种与连城白鸭白羽羽色相关的分子标记及连城白鸭杂交白羽后代的选育方法。本发明所述分子标记可以通过3个世代获得乌嘴白羽率96％后代，提高纯白羽后代选种效率和准确率，加快白羽优质肉鸭羽色性状的纯化，同时促进优秀地方鸭遗传资源进一步开发利用。本发明提供了一种连城白鸭白羽羽色相关的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如seqidno.1所示，且所述核苷酸序列的第123位碱基处的r为t或c。本发明还提供了扩增上述技术方案所述分子标记的引物，所述引物包括外围引物和内侧延伸引物，所述外围引物包括核苷酸序列如seqidno.2所示的外围上游引物和核苷酸序列如seqidno.3所示的外围下游引物，所述内侧延伸引物的核苷酸序列如seqidno.4所示。本发明还提供了上述技术方案所述分子标记或上述技术方案所述引物在连城白鸭杂交后代中筛选白羽鸭的应用。本发明还提供了一种基于上述技术方案所述分子标记或上述技术方案所述引物的连城白鸭杂交白羽后代的选育方法，包括以下步骤：1)将连城白鸭和其它品种鸭杂交，得到杂交f1代，f1代自群交配，获得f2代；2)当f2代生长至2～3周龄时，选取乌嘴乌脚的个体，利用上述技术方案所述分子标记或上述技术方案所述引物进行筛选，选留基因型为tt型的个体，得到筛选后的f2代；3)将步骤2)筛选后的f2代进行繁殖，得到连城白鸭杂交白羽后代。优选的是，步骤1)所述其它鸭品种，包括北京鸭、樱桃谷鸭、丽佳鸭、奥白星鸭或沔阳麻鸭。优选的是，步骤2)所述筛选用模板包括生长至2～3周龄的f2代乌嘴乌脚的个体的基因组dna。优选的是，当使用上述技术方案所述引物进行步骤2)所述筛选时，先使用外围引物扩增，获得遗传标记所在的片段，再使用内侧延伸引物进行扩增，测序，确定基因型。优选的是，获得遗传标记所在的片段后，还包括纯化的过程。优选的是，步骤3)所述繁殖前，还包括在筛选后的f2代生长至8周龄，去掉带杂羽色的f2代鸭的步骤。优选的是，步骤3)所述繁殖为按公母个数比为1：(4～5)进行配种。本发明提供了一种与连城白鸭白羽羽色相关的分子标记。本方法利用所述分子标记能够在连城白鸭和其他鸭品种杂交的f2代采血检测遗传标记，通过遗传标记选择纯白羽色的杂交后代，不需要记录复杂的羽色表型性状，相比之前常规的方法省时省力。传统选育方法需在5～6周龄羽毛初步长成时，通过观察羽色来淘汰非白羽杂交鸭，至少需要4～5个世代才能获得纯白羽鸭品系，耗时较长。传统选育方法也可以通过淘汰非白羽杂交鸭及其同胞半同胞家系，加快纯白羽鸭品系培育，但是这种方法需要更大群体用于淘汰，成本较大。与传统方法相比，本技术方案可以节约大量育种时间和成本。试验结果表明，本发明所述分子标记可以通过3个世代获得乌嘴白羽率96％以上的后代，提高纯白羽后代选种效率和准确率，加快白羽优质肉鸭羽色性状的纯化，同时促进优秀地方鸭遗传资源进一步开发利用。附图说明图1为本发明提供的分子标记基因型检测图。具体实施方式本发明提供了一种连城白鸭白羽羽色相关的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如seqidno.1所示：gagaccgtggctgccagcacgtcgcttcccgacccagccggcgagttcgacaggaacgtgccccgaatctgtggggtctgtggggacagggccacgggcttccacttcaacgccatgacctgr(c/t)gaaggctgcaagggcttcttcaggcgaagcatgaagaggaaggcgatgttcacgtgtccgttcaacggcgactgcaaaatcaccaaggacaaccggcggcactgccaggcctgccggctgaagcgctgcgtggacatcggcatgatgaaggag，且所述核苷酸序列的第123位碱基处的r为t或c。本发明所述分子标记从维生素d受体(vitamindreceptor，vdr)基因中克隆得到。含有tt基因型的个体羽色主要为连城白鸭相关的白色。本发明所述分子标记能够提供用于快速筛选连城白鸭和其它品种鸭杂交后代中具有连城白鸭“乌嘴白羽”特征的纯系鸭的方法。本发明对所述其它品种鸭没有特殊的限定，选用除连城白鸭以外的鸭品种均可。在本发明中，所述其它品种鸭优选包括北京鸭、樱桃谷鸭、丽佳鸭、奥白星鸭或沔阳麻鸭。本发明还提供了扩增上述技术方案所述分子标记的引物，所述引物包括外围引物和内侧延伸引物，所述外围引物包括核苷酸序列如seqidno.2所示的外围上游引物(ataaatacctgccttcctctgc)和核苷酸序列如seqidno.3所示的外围下游引物(tccccaaagattcgctcac)，所述内侧延伸引物的核苷酸序列如seqidno.4所示(ttttttttttttttttttttttttttccacttcaatgccatgacctg)。本发明对所述引物的合成方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的基因合成公司进行常规合成即可。本发明还提供了上述技术方案所述分子标记或上述技术方案所述引物在连城白鸭杂交后代中筛选白羽鸭的应用。本发明还提供了一种基于上述技术方案所述分子标记或上述技术方案所述引物的连城白鸭杂交白羽后代的选育方法，包括以下步骤：1)将连城白鸭和其它品种鸭杂交，得到杂交f1代，f1代自群交配，获得f2代；2)当f2代生长至2～3周龄时，选取乌嘴乌脚的个体，利用上述技术方案所述分子标记或上述技术方案所述引物进行筛选，选留基因型为tt型的个体，得到筛选后的f2代；3)将步骤2)筛选后的f2代进行繁殖，得到连城白鸭杂交白羽后代。本发明将连城白鸭和其它品种鸭杂交，得到杂交f1代，f1代自群交配，获得f2代。本发明对所述其它鸭品种和羽色没有特殊限定，选用除连城白鸭以外的其它鸭品种均可。在本发明中，所述其它鸭品种，优选包括北京鸭、樱桃谷鸭、丽佳鸭、奥白星鸭或沔阳麻鸭。本发明得到杂交f1代后，优选不经筛选，使f1代自群交配繁殖。本发明优选将自群交配的公母比例设置为1:(4～5)，更优选为1:4。本发明当f2代生长至2～3周龄时，选取乌嘴乌脚的个体，利用上述技术方案所述分子标记或上述技术方案所述引物进行筛选，选留基因型为tt型的个体，得到筛选后的f2代。在本发明中，所述筛选用模板优选包括生长至2～3周龄的f2代乌嘴乌脚的个体的基因组dna。本发明所述基因组dna优选提取自乌嘴乌脚的个体的血液。本发明对所述基因组dna提取的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规基因组提取方法即可。在本发明中，当使用上述技术方案所述引物进行所述筛选时，先使用外围引物扩增，获得遗传标记所在的片段，再使用内侧延伸引物进行扩增，测序，确定基因型。本发明在获得在本发明中，获得遗传标记所在的片段后，还包括纯化的过程，本发明对所述纯化的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规基因纯化方法即可。本发明在所述纯化前，优选还包括对所述遗传标记所在的片段进行消化的过程，本发明优选在获得的遗传标记所在的片段中加入核酸外切酶i(exoi)和碱性磷酸酶(shrimpalkalinephosphatase，sap)消化掉反应体系中残留的引物和dntps。本发明在使用内侧延伸引物(引物的5’端靠近分子标记位点)进行扩增时，优选在扩增体系中加入dna测序酶(snpshotmultiplexreadyreacrtionmix试剂)、四种不同颜色荧光标记ddntp(如a碱基：绿色；t碱基：红色，c碱基黄色；g碱基蓝色)，引物延伸一个碱基即终止，本发明优选使用abi测序仪进行检测，根据峰移动的位置确定该延伸产物对应的遗传标记位点，根据峰的颜色确定掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型。基因型检测示意图如图1所示。两个dna片段的扩增引物(外围引物)序列见表1，用于遗传标记检测的延伸测序引物(内侧延伸引物)序列见表2。根据对分子标记位点的检测，可检出三种基因型个体，即tt型，tc型和cc型，本发明选留基因型为tt型的个体，作为筛选后的f2代。表1遗传标记检测用外围引物序列外围引物名称引物序列vdr-f2ataaatacctgccttcctctgc(seqidno.2)vdr-r2tccccaaagattcgctcac(seqidno.3)表2遗传标记检测用内测延伸引物序列得到筛选后的f2代后，本发明将筛选后的f2代进行繁殖，得到连城白鸭杂交白羽后代。在本发明中，所述繁殖前，优选还包括在筛选后的f2代生长至8周龄，去掉带杂羽色的f2代鸭的步骤。在本发明中，所述繁殖优选为按公母个数比为1：(4～5)进行配种。本发明所述配种优选待养殖到鸭性成熟阶段进行操作。本发明得到的连城白鸭杂交白羽后代(f3代)自交繁殖后代(f4代)中，98％以上为乌嘴白羽鸭。本发明每一代繁殖用鸭，优选均选取纯白羽鸭。传统选育方法需在5～6周龄羽毛初步长成时，通过观察羽色来淘汰非白羽杂交鸭，至少需要4～5个世代才能获得纯白羽鸭品系，耗时较长。传统选育方法也可以通过淘汰非白羽杂交鸭及其同胞半同胞家系，加快纯白羽鸭品系培育，但是这种方法需要更大群体用于淘汰，成本较大。与传统方法相比，本技术方案可以节约大量育种时间和成本。下面结合具体实施例对本发明所述的一种与连城白鸭白羽羽色相关的分子标记及连城白鸭杂交白羽后代的选育方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。实施例1连城白鸭和奥白星鸭杂交筛选乌嘴白羽后代(1)奥白星公鸭(25只)与连城白鸭母鸭(100只)，按1:4进行组群杂交，获得f1代鸭群800只，全部为乌嘴乌脚灰羽鸭和花羽鸭，母鸭全部留下约400只，公鸭随机选留100只，公母比例约1:4。(2)f1代群体不进行任何选择，生长到性成熟阶段后自由交配，产生f2代，约2021只，公鸭987只，母鸭1034。(3)f2代鸭群2～3周龄，选择乌嘴乌脚的鸭留下，约867只。饲养至8周羽毛长齐。挑选乌嘴灰羽或花羽鸭40只，乌嘴白羽鸭42只，乌嘴黑羽鸭30只，采血检测分子标记位点基因型(表3)，基因频率卡方检验表明该遗传标记与不同鸭羽色极显著，tt型鸭白羽率为93.3％。表3遗传标记基因型与不同羽色鸭关联分析(4)留下基因型为tt的乌嘴白羽鸭个体，其余鸭及时淘汰，获得113只鸭。养至繁殖阶段，自由交配，获得f3代鸭群体931只，公鸭463只，母鸭468。(5)f3代鸭群养殖到8周龄羽毛初长成观察羽色，纯白羽率达96.2％。获得乌嘴乌脚白羽性状稳定群体。(6)该群体可以用于体重、大小、喙色、繁殖等其它性状的继续选育。实施例2连城白鸭和沔阳麻鸭杂交筛选乌嘴白羽后代(1)沔阳麻鸭(25只)与连城白鸭母鸭(100只)，按1:4进行组群杂交，获得f1代鸭群400只，全部为乌嘴乌脚灰黑羽鸭，母鸭全部留下约200只，公鸭随机选留50只，公母比例约1:4。(2)f1代群体不进行任何选择，生长到性成熟阶段后自由交配，产生f2代，约1273只，公鸭612只，母鸭661只。(3)f2代鸭群2～3周龄，采血检测分子标记位点基因型，留下基因型为tt的个体，其余鸭及时淘汰，可以获得大概324只鸭。(4)选留下的tt基因型鸭养殖到8周龄去掉带杂羽色的鸭37只，剩余继续养至性成熟阶段，剩余287只鸭自由交配，获得f3代鸭群体1221只，公鸭563只，母鸭658。(5)f3代鸭群养殖到8周龄羽毛初长成观察羽色，纯白羽率达96.7％。获得乌嘴乌脚白羽性状稳定群体。(6)该群体可以用于体重大小、繁殖等其它性状的继续选育。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>武汉市农业科学院<120>一种与连城白鸭白羽羽色相关的分子标记及连城白鸭杂交白羽后代的选育方法<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>276<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>unsure<222>(123)<223>r=c/t<400>1gagaccgtggctgccagcacgtcgcttcccgacccagccggcgagttcgacaggaacgtg60ccccgaatctgtggggtctgtggggacagggccacgggcttccacttcaacgccatgacc120tgrgaaggctgcaagggcttcttcaggcgaagcatgaagaggaaggcgatgttcacgtgt180ccgttcaacggcgactgcaaaatcaccaaggacaaccggcggcactgccaggcctgccgg240ctgaagcgctgcgtggacatcggcatgatgaaggag276<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ataaatacctgccttcctctgc22<210>3<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3tccccaaagattcgctcac19<210>4<211>47<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ttttttttttttttttttttttttttccacttcaatgccatgacctg47当前第1页12