特异性靶向骨性关节炎滑膜细胞的修饰碱基适配体及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种特异性靶向骨性关节炎滑膜细胞的修饰碱基适配体及其应用。

背景技术：

骨关节炎(oa)是老年人口的常见关节炎类型，最终可能导致关节功能的破坏和丧失，严重影响老年人的生活质量，对个人和社会都是沉重的负担。oa疾病早期的隐匿性及鉴别诊断复杂等因素也是这些疾病往往治疗时机延误，预后较差的原因。oa的基本病理特征是软骨变性，软骨下骨增生，滑膜炎；而持续性慢性滑膜炎，滑膜膜增生伴随骨侵袭破坏炎症。上述滑膜炎疾病，由于关节软骨表面没有血管，其一致的病理改变是关节囊内层的成纤维样滑膜细胞(fls)的炎性细胞因子的分泌，正常情况下fls是可以分泌润滑剂以帮助关节运动，而炎症状态下的fls通过增加炎症细胞因子的产生，例如肿瘤坏死因子α(tnf-α)，白细胞介素6(il-6)和白细胞介素1(il-1)，可能使慢性滑膜炎恶化。

目前批准用于治疗ra的药物最为广泛，例如：adalimumab(阿达木单抗)、infliximab(英夫利昔单抗)，激素等，这些用于抑制细胞因子tnf-a、il-1β及il-6同样用于oa的治疗，但全身使用时但出现了明显的副作用，例如过敏和单核细胞减少症，而局部注射玻璃酸钠仅能改善关节炎症环境，润滑关节等短期作用。而关节内注射药物的方式,滑膜炎症有被抑制，并没有靶向治疗滑膜炎症，导致关节软骨破坏严重。总体来说，通过全身抑制免疫反应或炎性细胞因子，这确实能改善部分患者关节的炎性症状，但不能完全解决炎症后活化的fls继续分泌炎性细胞因子，导致oa疾病进展。所以临床治疗迫切需要能长期、安全、靶向作用oa中发病机制中核心效应细胞fls的药物，用于治疗oa导致的滑膜炎症，保护关节软骨。

适配体技术是近年来出现的核酸技术，具有高特异性、高选择性地与靶标结合能力，由于其属于dna或rna核酸序列片段，稳定性好，所以没有抗原抗体种属性，不会产生排斥反应。经典的适配体筛选检测是用指数富集配体系统进化技术(systematicevolutionofligandsbyexponentailenrichment，selex)，其是90年代初由美国两个研究组最早提出的一项筛选和扩增技术。它应用大容量的随机寡核苷酸库，并结合聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，pcr)体外扩增技术，经过几轮或数十轮的筛选，可获得高亲和力、高特异性的核酸适配体。该技术对靶物质无特殊要求，现已筛选出多种靶物质的适配子，包括金属离子、有机染料、药物、氨基酸、核苷酸、多肽、细胞等。此外，适配体的靶蛋白还有：酶、生长因子、抗体、基因调控因子、细胞黏附因子以及外源凝集素等。因其具有靶分子范围广、亲和力高、特异性强等特点，筛选到的适配子能够特异地与疾病发生发展中起重要作用的靶分子结合，阻断或封闭靶分子的功能，从而达到治疗疾病的目的。基于此，核酸适配体作为一种新型的分子探针在药物筛选、疾病诊断、临床治疗等方面显示出广阔的应用前景，对肿瘤的诊断和治疗具有重要意义。细胞适配体筛选技术是适配体文库通过多轮对靶细胞富集筛选技术，在细胞-selex技术(cell-selex)中，活细胞被用来选择适体。在肿瘤治疗领域，cell-selex方法可以选择特异性的适配子作为癌细胞靶标，基于适配体的探针已经被开发用于多种癌症，包括宫颈癌、卵巢癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌、胶质瘤、结肠直肠癌和肺癌。cell-selex筛选靶细胞技术主要有一下有点优点：细胞表面有大量的分子，这些分子有可能成为靶标，其天然构象对于诊断和治疗应用很重要；此外，由于整个细胞应用于选择，不需要对细胞有生物标志物的先验知识。在oa的滑膜炎中炎症机制的效应细胞为fls，利用cell-selex筛选靶向结合fls的适配体，并搭载不同药物治疗不同病因引起的关节滑膜炎症，可能是解决关节炎症诊断及治疗、缩短病程、减少治疗副作用的关键技术。

目前，在针对滑膜细胞的核酸适配体方面的研究，申请号为201510063418.1的专利《特异性靶向类风湿关节炎炎性滑膜细胞的适配子及其应用》是基于普通适配体文库，采用传统selex技术，利用人成纤维样滑膜细胞系mh7a正筛，一种人肝细胞系l-02反筛，从而筛选出适配体仅适用于类风湿炎症滑膜细胞。但在该专利中发现根据其筛选出的适配体解离常数未公开，结合力不确定，且只针对ra滑膜炎的适配体，所以针对类风湿性滑膜炎的适配体可能并不适用于oa滑膜细胞。同时，该专利中的筛选是基于传统普通适配体文库，适配体未经过适当修饰，限制了其对滑膜细胞相关疾病诊断和治疗等实际应用。另外，该适配体并没有随意装载可拆卸组装纳米、核酸、蛋白等技术，反筛细胞仅利用肝细胞，无法证明其区别成纤维细胞来源谱系类型细胞(如软骨细胞、半月板细胞、肌腱细胞)之间的特异性。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供经修饰的碱基适配体。本发明基于修饰适配体文库，筛选出两种针对滑膜细胞的核酸适配体序列，该适配体可以为后续利用滑膜细胞来诊断或靶向治疗关节炎症提供可靠载体。

本专利即是基于修饰适配体文库，筛选出一种针对骨性关节炎滑膜细胞的核酸适配体序列，该适配体可以为后续利用滑膜细胞来诊断或靶向治疗关节炎症提供可靠载体。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

本发明提供了一种特异性靶向骨性关节炎滑膜细胞的修饰碱基适配体，其特征在于，所述适配体具有如seqidno：1或2所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种特异性靶向滑膜细胞的修饰碱基适配体的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备寡核苷酸文库微球；

(2)阴性筛选：将负筛细胞与步骤(1)的寡核苷酸文库微球孵育，然后取上清中未吸附的微球，未吸附的微球为本发明的目的适配体微球。

(3)阳性筛选：将步骤(2)获得的适配体微球与原代骨关节炎滑膜细胞结合，获得与滑膜细胞结合的适配体微球；

(4)适配体与原代骨关节炎滑膜细胞的解离：在步骤(3)所述的偶联靶细胞的适配体微球中加入碱性溶液，孵育后，再加入缓冲溶液中和离心，上清液中含有本发明所述的寡核苷酸适配体。

优选地，所述步骤(1)中所述寡核苷酸文库使用x-aptamer试剂盒。

优选地，所述步骤(4)中碱性溶液为1m的naoh，缓冲溶液为2m的tris-cl。

优选地，所述步骤(4)中寡核苷酸适配体的核苷酸序列如seqidno：1、2所示。

发明还提供了如上所述的特异性靶向滑膜细胞适配体中的修饰碱基团amine-du在制备治疗或诊断相关疾病的药物或制剂中的应用证明。

本发明的有益效果：在基本结构上与现有适配体完全不同，适配体与靶细胞结合力更强，解决了目前无骨性关节炎滑膜细胞靶向结合适配体的空白，后续可直接通过目标适配体中修饰基团，标记适配体，搭载纳米颗粒，传送药物等。从修饰适配体文库中筛选，筛选过程简便，大大缩减了传统方法繁琐的步骤。多种滑膜周围细胞(软骨细胞，半月板细胞，肌腱细胞)反筛，特异性大大增强。

附图说明

图1为本发明两个适配体的二级示意图(左)及修饰核苷酸分子结构图(右)，图a中原始序列中碱基“t”被“x”、“y”、“w”修饰碱基替换，替换符号“＝”；图b中为x、y、w修饰碱基结构。

图2为适配体文库及筛选出的2条适配体与滑膜细胞结合情况。由此图得出与骨性关节炎滑膜细胞结合亲和力较高的sa1、sa2适配体。

图3为两条适配体的特异性分析。通过比较适配体与人l02肝细胞、hk-2原代，发现适配体对骨性关节炎滑膜细胞具有较强的特异性，对其它细胞结合能力弱。

图4为两条适配体分别与人l02肝细胞、hk-2肾细胞及原代滑膜细胞的结合情况。可以看出目标适配体与软骨细胞几乎没有结合，而与滑膜细胞特异性结合良好。

图5为一共两条适配体与滑膜细胞结合解离曲线。通过记录不同浓度适配体与滑膜细胞结合情况，根据拟合公式：y＝bmaxx/(kd+x)，算出sa1-2适配体的解离常数kd分别为35.86±16.55、30.01±8.85(nm)。此图表明两条适配体与滑膜细胞结合情况较好，解离常数在nm级别。

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。

实施例1骨关节炎滑膜细胞适配体的筛选

步骤一、寡核苷酸文库的准备：

该寡核苷酸文库来源于x-aptamer试剂盒(ambiotechnologies，usa)，该试剂盒包括一种美国am生物公司特别设计和生产的微球库，库容一般有为109个微球，通过磁性粒子的磁性控制来筛选高亲力的修饰的适配体。

x-aptamer高亲和力修饰适配体是含有修饰过的寡核苷酸，能与特定的细胞、蛋白质或小分子靶标进行高亲和力和强特异性的结合。它与传统的核酸适配体筛选有很大的不同，它的文库是经过计算机设计的，并包含了一系列新颖的化学修饰的核苷酸。这些新颖的化学修饰增强了核苷酸与靶标的亲合力和适配体的稳定性，并增加了筛选的效率。这些新颖的化学修饰涵盖了二硫代磷酸酯骨架修饰、正电修饰及氨基酸修饰的碱基等。

具体操作如下：

制备两种缓冲液a和b。缓冲液a:1xpbsph7.4,1mmmgcl2,0.05％(v/v)tween20,2mg/mlbsa。缓冲液b：1×pbsph7.4,1mmmgcl2,0.05％(v/v)tween20。

把干装微球库转移到15ml离心管中，用1ml的移液器和预备的缓冲液apbstmb(1xpbsph7.4,1mmmgcl2,0.05％(v/v)tween20,2mg/mlbsa)，把干装微球库完全湿转移到15ml离心管中(5次，每次2ml)，然后在涡旋混合器上涡旋。

室温下，在浮桶式转头离心机上(吊桶式转头离心机)，以3000cfr的速度离心10min。

利用1ml移液器小心弃去上清液，试管中只保留约100μl上清液(弃去上清液时，确保微球全部保留在试管中)。

加入3ml缓冲液a到前述准备的15ml离心管中，然后在涡旋混合器上涡旋。

把上一步准备的15ml离心管，放在95℃水浴锅中静置5min。自然冷却到室温(需要30min以上)。(这一步的目的是让寡核苷酸“退火”到其最低能耗构象，形成稳定的三级结构)。加入7ml缓冲液b。然后在涡旋混合器上涡旋，以3000cfr的速度离心10min。利用1ml移液器小心弃去上清液，试管中保留100μl上清液。加入新鲜的缓冲液b至总体积为1.8ml。最后把含有寡核苷酸文库的微球转移到2ml管中。

步骤二、筛选，包括以下步骤：

1、阴性筛选，具体操作如下：

在t25培养瓶中增殖软骨细胞、半月板细胞，肌腱细胞直至密度约80％。用2ml缓冲液a清洗细胞一次，然后将新鲜的1ml缓冲液a加入细胞。将步骤一准备好的文库添加到细胞中，并摇动孵育1小时，然后取上清。用缓冲液b清洗这些未结合的珠子并用选择缓冲液b重悬至约1.5ml，并保留这些珠子用于阳性筛选并。

2、阳性筛选，具体操作如下：

在t25培养瓶中增殖原代骨关节炎滑膜细胞直至密度约80％。用2ml缓冲液a清洗细胞一次，然后将新鲜的1ml缓冲液a加入细胞。将阴性筛选中的未结合珠子添加到细胞中，并摇动孵育1小时。通过缓冲液b清洗去除未结合的珠子，从细胞中回收结合的珠子，刮细胞并离心下来。颗粒中含有与细胞结合的珠子。用50μl缓冲液b重悬沉淀。

3、适配体解离，具体操作如下：

向上述50μl重悬液中，加入50μl的1mnaoh。在65℃下孵育30min。再加入40μl的2mtris-cl去中和naoh。

将细胞物质沉淀并将上清液转移到1.5ml管中，上清液中含有通过靶蛋白筛选出的寡核苷酸适配体。

实施例2适配体的测序及结构分析

pcr扩增

对上清液进行pcr扩增。正向引物：1个1.5ml离心管:5’-caggggacgcaccaagg-3’，反向引物:5’-atcacgcagcacgcgggtcatgg-3’，储存在-20℃条件下。pcr反应使用100μl的1×pcr缓冲液(2.5mmmgcl2,0.2mmdntp,0.4μm正向引物,0.4μm反向引物和1utaqpolymerase)，扩增条件为：预变性94℃，1min、循环条件94℃，30s、50℃，30s和72℃，1min，最后72℃延长3min。设置20个循环。

二代测序

将上述获得的pcr产物寄到生工生物工程(上海)股份有限公司，进行二代测序分析。分析后，针对滑膜细胞合成2个测序频率最高的适配体。

二代测序结果为：

sa1:tttttaacacgacaacgcygtgacxcxcgaacgycatgccggtgggcccatg

sa2:tttttaagcccacxawacygtgcccaxcacagggygtwgcagxcgygccatg

其中x,y,w为x-aptamer文库中经过特殊修饰基团修饰的核苷酸，这些新颖的化学修饰涵盖了二硫代磷酸酯骨架修饰、正电修饰及氨基酸修饰的碱基等，适配体具体二级结构如图1所示。

实施例3适配体的亲和力验证

细胞准备：人原代骨关节炎滑膜细胞经传代后在37℃，5％co2中培养1～2天，使其处于对数生长期，并让细胞覆盖培养皿底部的面积约90％－95％左右，同时保证细胞具有良好的活力，用磷酸盐缓冲溶液(phosphatebuffersalinepbs)洗涤三次，加入1ml的缓冲液a孵育10分钟。

孵育过程：选择处于对数生长期的细胞，经0.25％胰酶消化后，取适当数量的细胞悬液，结合缓冲液洗涤2次后，分别加入浓度为300nmol/l、体积为0.2ml荧光标记的适配体文库和实施例2测序的两条适配体(sa1、sa2)，放置于冰上，避光，摇床上孵育30分钟，孵育结束后，缓冲液b将细胞洗涤3次；

流失分析：加入0.2ml缓冲液b，将滑膜细胞细胞核酸适配体复合物重悬，上样，流式细胞仪检测各组细胞与核酸适配体结合后的荧光值。flowjo_v10软件分析流式细胞分析结果如图2所示。

实施例4适配体的特异性验证(流式细胞分析)

细胞准备：人肝细胞系l02、肾上皮细胞系hk-2、原代骨关节炎滑膜细胞经传代后在37℃，5％co2中培养1～2天，使其处于对数生长期，并让细胞覆盖培养皿底部的面积约90％－95％左右，同时保证细胞具有良好的活力，用磷酸盐缓冲溶液(phosphatebuffersalinepbs)洗涤三次，加入1ml的缓冲液a孵育10分钟。

孵育过程：分别选择上述处于对数生长期的4种细胞，经0.25％胰酶消化后，取适当数量的细胞悬液，缓冲液a洗涤2次后，加入浓度为300nmol/l、体积为0.2ml荧光标记的适配体(sa1、sa2)，放置于冰上，避光，摇床上孵育30分钟，孵育结束后，缓冲液b将细胞洗涤3次；

流失分析：加入0.2ml缓冲液b，将滑膜细胞细胞核酸适配体复合物重悬，上样，流式细胞仪检测各组细胞与核酸适配体结合后的荧光值。flowjo_v10软件分析流式细胞分析结果如图3所示。

实施例5适配体的特异性验证(免疫荧光法)

分别选择处于对数生长期的人肝细胞系l02、肾上皮细胞系hk-2、原代骨关节炎滑膜细胞，经0.25％胰酶消化后，取适当数量的细胞悬液，均匀平铺于共聚焦显微镜专用的培养皿中，37℃，5％co2细胞培养箱中培养24小时，洗涤2次后，加入浓度为300nmol/l、体积为0.4mlfam荧光标记的适配体(sa1、sa2)，放置于冰上，避光，摇床上孵育30分钟，孵育结束后，缓冲液b将细胞洗涤3次；加入浓度为2μg/ml的hoechst溶液染细胞核5分钟，将细胞再次洗涤后加入0.5ml洗涤缓冲液，于共聚焦荧光显微镜下进行细胞成像并拍照。图像结果如图4所示。

实施例6适配体的解离常数kd值测定

细胞准备：细胞处理方法同实施例3。

孵育过程：细胞计数板计数2×10⁴个滑膜细胞，将滑膜细胞、标记fam的适配体(sa1、sa2)及缓冲液a按照预先计算好的用量配置成0nmol/l、10nmol/l、20nmol/l、50nmol/l、60nmol/l、80nmol/l、100nmol/l浓度梯度且体积为200ul的溶液，放置于冰上，避光，摇床上孵育30分钟，移液器移除未结合的核酸适配体，0.5ml预冷缓冲液b洗涤细胞3次，每次2分钟；

流失分析及数据处理：加入0.2ml缓冲液b，将滑膜细胞细胞核酸适配体复合物重悬，上样，流式细胞仪检测各组细胞与核酸适配体结合后的荧光值。运用sigmaplot14.0软件分析，根据拟合公式：y＝bmax*x/(kd+x)，得到核酸适配体的拟合曲线及kd值。拟合结果曲线如图5所示。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

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