Cy5-650及其在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法

本发明属于化工医药技术领域，具体涉及一种新型五甲川花菁染料-cy5-650在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术：

恶性肿瘤是导致死亡最重要的原因之一，也是阻碍21世纪延长人类寿命的最大障碍。随着我国国民经济和人民生活水平的提高，我国结直肠癌发病率和病死率也逐年上升。目前，临床上治疗结直肠癌的靶向药物不可避免地具有很强的副作用，而传统的放疗、手术等也只能维持病人短暂的寿命，而且还给病人带来了极大的痛苦。因此，开发新型的具有靶向作用而且毒副作用少的抗肿瘤药物迫在眉睫，这将极大的提高肿瘤患者的5年生存率以及改善他们的生活，提高他们的幸福感。

菁染料具有易于合成、荧光效果好、发射光谱范围可调、便于与生物分子结合等诸多优点,被广泛应用于活体生物细胞标记中。其中花菁染料在医学领域可用于基因探测、蛋白检测、荧光探针等方面。但随着生物技术发展，已合成花菁染料不能满足应用需求。因此，研究开发新型花菁染料对于生物医学领域重要意义。新型五甲川花菁染料cy5-650设计合成与其在制备抗肿瘤药物中的应用为本课题组首次研究，并且实验发现此化合物具有治疗结直肠癌的潜能，目前没有关于该化合物抗肿瘤活性的相关研究。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种新型花菁染料作为药物的新用途，具体为cy5-650及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

新型五甲川花菁染料cy5-650在制备抗肿瘤药物中的应用，所述cy5-650的化学结构如下所示。

其相关性质如下：

化学名称：1,5-二[n-(3,5-二(2-(2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基)苄基-2,3,3-三甲基-5-磺酸基-3h-吲哚]-3-(4-吡啶)五碳菁溴化盐染料(简称为cy5-650)。

分子式：c72h96n3o22s2^2-；分子量：1419.67；检测方式：¹hnmr、¹³cnmr和esi-ms；性状：蓝色固体；来源：本实验室合成。药理性质：溶于水。

进一步的，所述cy5-650的作用浓度为10-25μm。

本发明提供了一种体外抑制肿瘤细胞活力的方法，将cy5-650加入肿瘤细胞的培养液中，加入cy5-650的终浓度为10-25μm。所述肿瘤细胞是结直肠癌细胞系dld-1。

本发明提供了一种体内抑制肿瘤生长的方法，其将cy5-650经瘤旁组织注射到balb/c裸鼠体内，注射cy5-650的剂量为2.78mg/kg。所述体内模型可以是结直肠癌细胞系dld-1balb/c裸鼠皮下荷瘤模型。

本发明还提供了一种抗肿瘤药物，该抗肿瘤药物的活性成分为cy5-650。

本发明提供的cy5-650通过光热活性发挥抗肿瘤作用，即含有活性成分cy5-650的抗肿瘤药物通过光热效应，可以显著抑制结直肠癌肿瘤hct116和sw480细胞活力。

本发明的有益效果。

本发明提供了cy5-650在制备抗肿瘤药物中的应用。mtt结果显示：cy5-650能剂量依赖的抑制结直肠癌dld-1细胞的增殖。动物实验结果显示：cy5-650显著抑制人结直肠癌细胞系dld-1balb/c裸鼠皮下荷瘤生长。本发明的小分子化合物cy5-650作为新的抗肿瘤药物或者其辅助成分进行开发，抑制肿瘤效果显著，将为治疗和治愈肿瘤提供新的治疗途径和手段。

附图说明

图1.cy5-650结构鉴定¹hnmr(a)、¹³cnmr(b)和esi-ms(c)数据。

图2.cy5-650抑制结直肠癌dld-1细胞活力的测定。

图3.cy5-650抑制结直肠癌dld-1细胞balb/c裸鼠皮下荷瘤生长的测定。

图4.cy5-650抑制结直肠癌dld-1细胞活力ptt和pdt性能的测定。

具体实施方式

为了使本发明的技术目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作出进一步的说明，但所述实施旨在解释本发明，而不能理解为对本发明的限制，实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。

实验方法：

应用实例1、cy5-650合成。

合成路线如下：

向50ml二口圆底烧瓶中加入2-苯基丙二醛(10.6mg，0.071mmol，1.0eq)，化合物5(94.0mg，0.14mmol，2.0eq)，除氧30min，加入除氧的冰乙酸5ml和乙酸酐5ml，搅拌10min，氩气保护下110℃反应3h。tlc监控反应结束，冷却至室温，旋蒸除去溶剂得粗品。粗品经柱层析(200-300目硅胶，流动相：甲醇:二氯甲烷＝1:10)分离得蓝色固体化合物cy5-651：64.3mg，产率：63.5％。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.55(d,j＝5.2hz,2h),8.42(d,j＝14.0hz,2h),7.90(s,2h),7.64(d,j＝8.4hz,2h),7.44(t,j＝8.4hz,2h),6.84(d,j＝5.2hz,2h),6.47(s,2h),6.08(s,4h),5.60(d,j＝14.0hz,2h),5.00(s,4h),3.98(m,8h),3.71(m,8h),3.56-3.47(m,24h),3.40-3.38(m,8h),3.20(s,12h),1.77(s,12h)；¹³cnmr(100mhz,dmso-d6)δ174.09,160.04,152.49,150.36,145.85,142.57,142.30,140.51,126.24,124.53,120.20,110.48,104.88,102.11,100.07,71.25,69.91,69.77,69.58,68.78,67.22,58.02,49.18,47.00,26.94；ms(esi):calcdfor[m]^-1419.67,found1419.67。结构鉴定图谱见图1，结构鉴定1hnmr(a)见图1-a，hrms(b)数据见图1-b，esi-ms数据见图1-c。

应用实例2、mtt法测定cy5-650对结直肠癌细胞系dld-1细胞活力的抑制作用。

dld-1细胞按3×10³/孔接种至96孔板，应用含5％co2、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的rpmi1640完全培养基37℃培养24h，加入不同浓度(分别为10μm、12.5μm、15μm、17.5μm、20μm、22.5μm、25μm)的cy5-650，每个浓度设定3个复孔，药物作用1h后，给与0.4w近红外光照，每孔照射2min，继续培养24h，弃培养液，mtt试剂测定细胞活力。

测定方法为：15μl/孔加入预先配制好的mtt反应液，继续培养4h，吸弃上清，100μl/孔加入dmso溶解还原产物，避光反应5min，490nm波长处读取吸光度值，计算细胞活力，以测定cy5-650干预孔吸光度值/对照孔吸光度值作为细胞活力。

ic50指细胞生长被抑制一半时抑制剂的浓度。这里即为结直肠癌细胞系dld-1细胞数量分别为对照组一半时cy5-650的浓度。

结果：cy5-650对结直肠癌dld-1细胞的ic50值为12μm,见图2，其中a.cy5-650抑制结直肠癌dld-1细胞活力的测定。*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001；b.cy5-650抑制结直肠癌dld-1细胞图像。

应用实例3、cy5-650抑制结直肠癌dld-1细胞balb/c裸鼠皮下荷瘤生长。

测定方法为：以皮下注射方式建立结直肠癌dld-1细胞balb/c裸鼠皮下荷瘤模型，按照2.78mg/kg的剂量，尾静脉注射给予cy5-650干预治疗同时给与0.4w近红外光照，裸鼠实施安乐死并切取肿瘤组织，确定cy5-650抑制结直肠癌dld-1细胞balb/c裸鼠皮下荷瘤生长的作用。

结果：cy5-650显著抑制结直肠癌细胞系dld-1balb/c裸鼠皮下荷瘤生长。见图3，其中a.不同处理下的肿瘤图像；b.从上到下、从左到右依次为不同处理下的裸鼠心脏指数、肝脏指数、脾脏指数、肺脏指数、肾脏指数和肿瘤重量比较；c.不同处理下肿瘤体积的变化曲线；d.不同处理下肿瘤重量的变化曲线。

应用实例4、cy5-650通过光热效应抑制结直肠癌细胞系dld-1细胞活力。

dld-1细胞按3×10³/孔接种至96孔板，应用5％co2、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的rpmi1640完全培养基37℃培养24h，加入不同浓度(分别为10μm、12.5μm、15μm、17.5μm、20μm、22.5μm、25μm)的cy5-650，每个浓度设定3个复孔，药物作用1h后，将96孔板放置冰上并给与0.4w近红外光照，每孔照射2min，继续培养24h，弃培养液，mtt试剂测定细胞活力以初步确定cy5-650的光热性能。

dld-1细胞按3×10³/孔接种至96孔板，应用5％co2、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的rpmi1640完全培养基37℃培养24h，加入不同浓度(分别为10μm、12.5μm、15μm、17.5μm、20μm、22.5μm、25μm)的cy5-650，同时加入5mm的n-乙酰-半胱氨酸(nac)，每个浓度设定3个复孔，药物作用1h后，给与0.4w近红外光照，每孔照射2min，继续培养24h，弃培养液，mtt试剂测定细胞活力以确定cy5-650的光动力性能。

用分析天平精确称量一定量的样品pcpc，配成1×10^-3m的水溶液作为母液，置于冰箱中保存备用。测试时将母液取出自然升至室温，用移液枪取500μl母液于5ml容量瓶中，补加水至刻度，振荡摇匀，得100μm的贮备液溶液。贮备液经梯度稀释配置成不同浓度的待测水溶液。取空白水溶液及待测水溶液2ml于24孔板中，并分别用(660nm，0.5w/cm²)激光器单孔持续照射2min，同时用红外摄像仪分别在0、0.5、1、1.5和2min时记录温度变化。

结果：cy5-650通过光热效应显著抑制结直肠癌肿瘤dld-1细胞活力。见图4，其中a.cy5-650抑制结直肠癌dld-1细胞活力pdt性能测定；b.cy5-650抑制结直肠癌dld-1细胞活力ptt性能测定；c.不同浓度的cy5-650在接受近红外激光照射过程中的温度变化曲线。

由上述实验结果可以看出：cy5-650通过光热效应显著抑制结直肠癌肿瘤dld-1细胞活力，并显著抑制结直肠癌细胞系dld-1balb/c裸鼠皮下荷瘤生长，可用于制备抗肿瘤药物。本发明的小分子化合物cy5-650作为新的抗肿瘤药物或者其辅助成分进行开发，抑制肿瘤效果显著，将为治疗和治愈肿瘤提供新的治疗途径和手段。