一种非洲猪瘟病毒荧光PCR快速检测试剂盒的制作方法

本发明属于非洲猪瘟病毒荧光pcr快速检测技术领域，具体的说是一种非洲猪瘟病毒荧光pcr快速检测试剂盒。

背景技术：

非洲猪瘟(africanswinefever,asf)是一种由非洲猪瘟病毒(africanswinefevervirus,asfv)引起的一种急性、热性、高度接触性动物传染病，发病迅速，病死率高达90％以上，严重危及到养猪业的发展。世界动物卫生组织(oie)将其列为法定报告疫病，被我国列为一类传染病。2018年8月3日，我国首次asf暴发于沈阳市某猪场，自此以后我国20多个省份又陆续暴发100多起非洲猪瘟疫情，给我国养猪业带来了巨大损失。asfv基因组庞大，可达160-190kb，产生的结构蛋白超过了50种，且asfv感染宿主后诱导宿主产生的中和抗体水平很低甚至不产生中和抗体，这些特性加大了非洲猪瘟的防治难度。尽管非洲猪瘟病毒的主要宿主为家猪和野猪以及软蜱，但其存活能力强、传播途径多样，在粪便、血清、鲜肉和肉制品中均可长期存活，并通过泔水、车辆和人员机械携带、排泄物和分泌物等不断传播，因此，一个地区一旦发生asfv感染后就很难消除。本发明为一种检测试剂盒，试剂盒采用实时荧光pcr方法检测猪血液、脾脏、淋巴结或肾脏淋巴结、肌肉等组织、粪便、泔水、饲料等环境中的非洲猪瘟病毒(asfv)的dna，适用于asfv的检测、诊断和流行病学调查。关于对非洲猪瘟病毒荧光pcr快速检测的介绍，可见刊期：张险朋，非洲猪瘟实验室检测技术研究进展，畜牧兽医科技信息，2019(07)，但是，本发明在对pcr管离心的过程中存在一些问题，具体包括以下方面：

本发明在对多个pcr管内的试液进行离心时，由于现有技术中的离心装置的离心效果不高，导致试液在离心时无法将试液中的混合物与液体分离完全，从而导致在检测时无法检测到准确的数值，同时由于多个pcr管的离心不是同时进行的，导致离心后的试液会再次发生扩散，从而影响试液检测的问题，同时现有技术在对试液离心的过程中无法将离心出的混合物进行稳固，从而会使混合物再次扩散的问题。

现有技术中也有一些关于非洲猪瘟病毒荧光pcr快速检测试剂盒的方案，如专利号201910108734.4专利名称为非洲猪瘟病毒荧光pcr快速检测试剂盒的专利，该技术方案采用特异性引物asfv-f和asfv-r，以及taqman探针asfv-p，探针的5′端标记报告荧光染料为fam，3′端标记荧光淬灭基团为bhq-1，进行检测，但是在试液离心的过程中使用的是现有技术中的设备，从而无法将试液中的混合物进行堆积，从而导致降低检测的准确性。

本发明的试剂盒对非洲猪瘟病毒p72基因的一对特异性引物和一条特异性荧光标记探针，通过taqman实时荧光pcr技术检测非洲猪病病毒核酸。p72是非洲猪瘟的主要结构蛋白，产生于asfv感染的晚期，位于病毒衣壳的表面，对自然感染具有良好的免疫原性，是一种非常保守的抗原性蛋白。

技术实现要素：

为了弥补现有技术的不足，本发明提出的一种非洲猪瘟病毒荧光pcr快速检测试剂盒，本发明主要用于解决本发明在对多个pcr管内的试液进行离心时，由于多个pcr管的离心不是同时进行的，导致离心后的试液会再次发生扩散，从而影响试液检测的问题，同时现有技术在对试液离心的过程中无法将离心出的混合物进行稳固，从而会使混合物再次扩散的问题。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：本发明所述的一种非洲猪瘟病毒荧光pcr快速检测试剂盒；该试剂盒由引物、探针、rox校正染料、消化液、dna结合液、dna洗涤液、dna洗脱液、蛋白酶k、无菌无核酸酶水、pcr扩增反应液、阴性对照、阳性对照、dna吸附柱和收集管及说明书组成；

非洲猪瘟病毒的荧光pcr快速检测方法包括以下步骤：

s1：选取病死或扑杀猪的脾脏、淋巴结或肾脏等病变部与健康部交界处组织，待检活猪，用注射器取血至少2ml，2～8℃保存并送实验室检测，其中要求送检病料新鲜，严禁反复冻融病料；

s2：对选取的样品进行处理，以每份组织分别从三个不同的位置称取样品约1g，用手术剪剪碎混匀后取0.05g于研磨器中研磨，加入1.5ml生理盐水继续研磨，待匀浆后转至1.5ml灭菌离心管中，以8000rpm的转速离心2min即得样品组织研磨液；

s3：选取多个pcr管,每管加入20μl核酸释放液，再分别加入阴性对照、阳性对照，然后将s2中制得的样品组织研磨液上清或血清5μl加入至pcr管内，然后将多个pcr管安装在试剂盒上涡旋混匀后瞬时离心，然后将pcr管放入pcr仪上以80℃温育2min，瞬时离心后上清可直接作为模板进行检测；

s4：实时荧光rcr操作：设被检样品、阴性对照和阳性对照总和为n，则反应体系配制如下：

试剂：体系，无菌无核酸酶水6.3×(n+1)μl、pcr反应液10×(n+1)μl、荧光探针1.7×(n+1)μl，将以上配制的反应体系充分混匀后，分装每个反应管中各18μl，分别取2μl模板dna，加入相应反应管中，混匀并作好标记，在荧光pcr扩增仪上进行以下反应：95℃2min，循环95℃5s，60℃15s，共40次，每次循环的第二步60℃15s时，收集荧光信号。

优选的，引物、探针使用时用无菌无核酸酶水稀释至保存浓度100pmol/μl，工作浓度10pmol/μl；所述探针标记为5′fam--3′bhq-1，5′，3′端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团；

引物是用来扩增片段用的,而探针,探针上面有荧光基团,完整时检测不到荧光,与两引物之间的目的基因结合,pcr扩增过程中,探针被切断,可以检测到荧光扩增得到的目的基因越多,那么探针被切断的也越多,检测到的荧光也越多,由于引物和探针的保存浓度为100pmol/μl，工作浓度为10pmol/μl，在引物工作的过程中可以提高引物扩增片段的速度，从而加快对探针的切断，可以检测到更多的荧光，提高检测的效率，由于探针标记5′fam--3′bhq-1，5′，3′端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团，荧光报告集团自身存在共轭体系，从而可以产生荧光效应，进而可以增强荧光效应促进检测，当荧光报告基团脱离荧光淬灭基团后可以产生被检测的荧光，从而提高检测程度。

优选的，其中，

荧光混合液的制备：上下游引物、探针各10pmol/μl，rox校正染料以10:10:5:1的比例混匀，定量分装，rox购买商品化试剂；通过上述比例进行混匀，可以使非洲猪瘟病毒检测试剂盒的检测效果达到最优化，从而提高检测的过程；

蛋白酶k的制备：将蛋白酶k干粉用无菌无核酸酶水溶解至浓度20mg/ml；通过将蛋白酶k溶解为20mg/ml的浓度，可以防止蛋白酶k的浓度过高对细胞结构造成破坏，从而影响病毒的检测结果；

阴对对照：购买的无菌无核酸酶水；

pcr反应液：购买的商品化试剂，含有taqdna热启动酶、dntps、mgcl2等成分；通过使用含有taqdna热启动酶、dntps、mgcl2等成分的pcr反应液，可以增强dna扩增的特异性、敏感性和产量，同时dntps可以防止产物的甲基化，同时还可以增强pcr反应液的聚合能力；

阳性对照：阳性对照生产用线性化质粒，用重组细菌种子接种平培养基培养，提取质粒，酶切，胶回收；

吸附柱收集管为购买，吸附柱装量为800μl/个，离心柱层析膜为硅基质膜，厚度为0.28cm，收集管的装量为2ml/个。

优选的，其中所述剂盒包括盒体；所述盒体底部内壁中固连有马达，且马达通过导线与控制器电连接；所述马达驱动轴上固连有第一转轴；所述第一转轴内壁中转动连接有第二转轴；所述第二转轴另一端固连有支撑板；所述支撑板下方于马达驱动轴外表面固连有辅助板；所述辅助板上表面固连有均匀布置的电动伸缩杆，且电动伸缩杆均通过导线与控制器电连接；每个所述电动伸缩杆另一端均与支撑板固连；所述支撑板上表面通过转杆转动连接有均匀布置的第一套环，且第一套环内均装有pcr管；每个所述第一套环外表面均固连有均匀布置的第一齿轮齿；所述盒体内表面于盒体内壁中固连有均匀布置的第二齿轮齿，且第二齿轮齿均与第一齿轮齿相互啮合；所述支撑板上表面固连有支撑辊，且支撑辊延伸至盒体上方；所述支撑辊上表面固连有第一环板；所述第一环板内壁中开设有均匀布置的管孔，且管孔用于存放per管使用；每个所述管孔相背一侧于第一环板外表面开设有均匀布置的第一开口；所述第一环板外表面通过均匀布置的支杆固连有第二环板；所述第二环板内表面开设有均匀布置的第二开口，且第二开口与第一开口相互对应；每个所述pcr管均延伸至第一开口与第二开口内；

工作时，本发明在对多个pcr管内的试液进行离心时，由于现有技术中的离心装置的离心效果不高，导致试液在离心时无法将试液中的混合物与液体分离完全，从而导致在检测时无法检测到准确的数值，同时由于多个pcr管的离心不是同时进行的，导致离心后的试液会再次发生扩散，从而影响试液检测的问题，同时现有技术在对试液离心的过程中无法将离心出的混合物进行稳固，从而会使混合物再次扩散，本发明制作的剂盒在给试液进行离心时，可以使所有的pcr管同时离心，从而可以防止试液离心不同时，导致试液再次扩散，同时还可以将离心后的混合物堆积，并推至pcr管上方，从而可以提高试剂的检测过程，在使用本发明制作的剂盒时，首先将pcr管取出，然后将配置好的试液注入pcr管内，然后将pcr管卡入第一开口与第二开口之间，同时pcr管底部均卡入第一套环的空腔内，此时利用遥控器控制马达转动，在马达转动的过程中可以带动支撑板转动，由于第一环板通过支撑辊与支撑板固连，在支撑板转动的过程中可以通过支撑辊带动第一环板转动，从而带动均匀布置的pcr管转动，在此过程中可以对pcr管内的试液进行离心，由于辅助板上表面固连有均匀布置的电动伸缩杆，且马达的驱动轴与支撑板通过第一转轴与第二转轴转转动连接，在支撑板转动的过程中控制器控制均匀布置的电动伸缩杆依次伸张，在一个电动伸缩杆伸张的过程中，其它电动伸缩杆向下收缩，同时第二转轴在第一转轴内做圆周运动，在此过程中支撑板可以带动pcr管波浪式运动，从而可以进一步提高试液的离心效果，同时还可以将试液离心出的混合物震荡至pcr管上方，从而可以更方便的对试剂进行检测，由于第一套环外表面固连的第一齿轮齿与盒体内表面固连的第二齿轮齿相互啮合，在支撑板带动第一套环转动的过程中，第一齿轮齿与第二齿轮齿发生啮合，从而可以使第一套环自转，在第一套环自转的过程中可以带动pcr管自转，在此过程中可以进一步提高试液的离心效果，从而可以提高试液的检测程度，由于pcr管置于第一开口与第二开口之间，在pcr管转动的过程中，可以防止pcr管发生倾斜，从而影响试液的离心过程。

优选的，每个所述pcr管上表面均转动连接有管盖；每个所述管盖内壁中均通过支杆固连有插套；所述第一环板与第二环板上表面均固连有均匀布置的插杆，且插杆与插套均相互配合；每个所述管盖下表面均固连有长杆，且长杆底部均为圆锥形设计；每个所述长杆外表面均设有螺纹；每个所述pcr管内均盛装有生物膜，且长杆伸入pcr管时可扎破生物膜；

工作时，当试液注入pcr管内后，此时将管盖盖在pcr管上方，由于管盖内壁中固连的插套与第一环板和第二环板上表面固连的插杆相互配合，从而可以将插杆插入插套内，在此过程中可以防止pcr管内的试液在离心的过程中发生洒落，从而影响试剂的含量和检测精度，由于管盖下表面固连有长杆，在管盖盖在pcr管上方时，长杆底部的锥形可以穿过生物膜，由于长杆外表面开设有螺纹，在pcr管自转的过程中，pcr管会带动生物膜转动，由于长杆插入生物膜内，在生物膜转动的过程中可以跟随生物膜上的螺纹向上移动，在此过程中可以将生物膜上方离心出的混合物堆积在生物膜上，当生物膜脱离螺纹时会卡在螺纹上方，在此过程中可以对试液中的混合物进行收集，从而提高试液离心后混合物的浓度，进而提高对混合物的检测效果。

优选的，每个所述第一开口与第二开口内壁中均通过弹簧滑动连接有支撑层，且支撑层均为弧形设计，并与pcr管相互贴合；

工作时，由于第一开口与第二开口内壁中均通过弹簧滑动连接有支撑层，在pcr管转动的过程中可以对pcr管进行支撑，从而防止pcr管在转动的过程中发生倾斜影响试液的离心过程，同时还可以缓冲pcr管受到的作用力，从而防止pcr管受到作用力的挤压使pcr管发生损坏，同时在pcr管自转的过程中支撑层可以将pcr管一直支撑在中轴线位置，从而防止pcr管发生倾斜，影响试液的离心过程。

本发明的有益效果如下：

1.本发明通过将引物、探针使用时用无菌无核酸酶水稀释至保存浓度100pmol/μl，工作浓度10pmol/μl，引物是用来扩增片段用的,而探针,探针上面有荧光基团,完整时检测不到荧光,与两引物之间的目的基因结合,pcr扩增过程中,探针被切断,可以检测到荧光扩增得到的目的基因越多,那么探针被切断的也越多,检测到的荧光也越多,由于引物和探针的保存浓度为100pmol/μl，工作浓度为10pmol/μl，在引物工作的过程中可以提高引物扩增片段的速度，从而加快对探针的切断，可以检测到更多的荧光，提高检测的效率。

2.本发明通过设置长杆，由于管盖下表面固连有长杆，在管盖盖在pcr管上方时，长杆底部的锥形可以穿过生物膜，由于长杆外表面开设有螺纹，在pcr管自转的过程中，pcr管会带动生物膜转动，由于长杆插入生物膜内，在生物膜转动的过程中可以跟随生物膜上的螺纹向上移动，在此过程中可以将生物膜上方离心出的混合物堆积在生物膜上，当生物膜脱离螺纹时会卡在螺纹上方，在此过程中可以对试液中的混合物进行收集，从而提高试液离心后混合物的浓度，进而提高对混合物的检测效果。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步说明。

图1是本发明的方法流程图；

图2是本发明剂盒的立体图；

图3是本发明剂盒的主视图；

图4是本发明处理收集装置的剖视图；

图5是图3中a处局部放大图；

图6是图3中b处局部放大图；

图7是本发明检验结果及判断标准曲线图；

图中：盒体1、马达11、第一转轴12、第二转轴13、支撑板14、辅助板15、电动伸缩杆16、第一套环17、第一齿轮齿18、第二齿轮齿19、支撑辊191、第一环板192、第一开口193、第二环板194、第二开口195、pcr管2、管盖21、插套22、插杆23、长杆24、生物膜25、支撑层26。

具体实施方式

使用图1-图7对本发明实施方式的一种非洲猪瘟病毒荧光pcr快速检测试剂盒进行如下说明。

如图1-图7所示，本发明所述的一种非洲猪瘟病毒荧光pcr快速检测试剂盒；该试剂盒由引物、探针、消化液、dna结合液、dna洗涤液、dna洗脱液、蛋白酶k、无菌无核酸酶水、pcr扩增反应液、实时荧光混合液、阴性对照、阳性对照、dna吸附柱和收集管及说明书组成；

非洲猪瘟病毒的荧光pcr快速检测方法包括以下步骤：

s1：选取病死或扑杀猪的脾脏、淋巴结或肾脏等病变部与健康部交界处组织，待检活猪，用注射器取血至少2ml，2～8℃保存并送实验室检测，其中要求送检病料新鲜，严禁反复冻融病料；

s2：对选取的样品进行处理，以每份组织分别从三个不同的位置称取样品约1g，用手术剪剪碎混匀后取0.05g于研磨器中研磨，加入1.5ml生理盐水继续研磨，待匀浆后转至1.5ml灭菌离心管中，以8000rpm的转速离心2min即得样品组织研磨液；

s3：选取多个pcr管2,每管加入20μl核酸释放液，再分别加入阴性对照、阳性对照，然后将s2中制得的样品组织研磨液上清或血清5μl加入至pcr管2内，然后将多个pcr管2安装在试剂盒上涡旋混匀后瞬时离心，然后将pcr管2放入pcr仪上以80℃温育2min，瞬时离心后上清可直接作为模板进行检测；

s4：实时荧光rcr操作：设被检样品、阴性对照和阳性对照总和为n，则反应体系配制如下：

试剂：体系，无菌无核酸酶水6.3×(n+1)μl、pcr反应液10×(n+1)μl、荧光探针1.7×(n+1)μl，将以上配制的反应体系充分混匀后，分装每个反应管中各18μl，分别取2μl模板dna，加入相应反应管中，混匀并作好标记，在荧光pcr扩增仪上进行以下反应：95℃2min，循环95℃5s，60℃15s，共40次，每次循环的第二步60℃15s时，收集荧光信号。

作为本发明的一种实施方式，引物、探针使用时用无菌无核酸酶水稀释至保存浓度100pmol/μl，工作浓度10pmol/μl；所述探针标记为5′fam--3′bhq-1，5′，3′端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团；

引物是用来扩增片段用的,而探针,探针上面有荧光基团,完整时检测不到荧光,与两引物之间的目的基因结合,pcr扩增过程中,探针被切断,可以检测到荧光扩增得到的目的基因越多,那么探针被切断的也越多,检测到的荧光也越多,由于引物和探针的保存浓度为100pmol/μl，工作浓度为10pmol/μl，在引物工作的过程中可以提高引物扩增片段的速度，从而加快对探针的切断，可以检测到更多的荧光，提高检测的效率，由于探针标记5′fam--3′bhq-1，5′，3′端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团，荧光报告集团自身存在共轭体系，从而可以产生荧光效应，进而可以增强荧光效应促进检测，当荧光报告基团脱离荧光淬灭基团后可以产生被检测的荧光，从而提高检测程度。

作为本发明的一种实施方式，其中，

荧光混合液的制备：上下游引物、探针各10pmol/μl，rox染料以10:10:5:1的比例混匀，定量分装，rox购买商品化试剂；通过以上述比例进行混匀，可以使荧光混合液的检测效果达到最大化，从而提高检测的过程；

蛋白酶k的制备：将蛋白酶k干粉用无菌无核酸酶水溶解至浓度20mg/ml；通过将蛋白酶k溶解为20mg/ml的浓度，可以防止蛋白酶k的浓度过高对细胞结构造成破坏，从而影响病毒的检测结果；

阴对对照：购买的无菌无核酸酶水；

pcr反应液：购买的商品化试剂，含有taqdna热启动酶、dntps、mgcl2等成分；通过使用含有taqdna热启动酶、dntps、mgcl2等成分的pcr反应液，可以增强dna扩增的特异性、敏感性和产量，同时dntps可以防止产物的甲基化，同时还可以增强pcr反应液的聚合能力；

阳性对照：阳性对照生产用线性化质粒，用重组细菌种子接种平培养基培养，提取质粒，酶切，胶回收；

吸附柱收集管为购买，吸附柱装量为800μl/个，离心柱层析膜为硅基质膜，厚度为0.28cm，收集管的装量为2ml/个。

作为本发明的一种实施方式，其中所述试剂盒包括盒体1；所述盒体1底部内壁中固连有马达11，且马达11通过导线与控制器电连接；所述马达11驱动轴上固连有第一转轴12；所述第一转轴12内壁中转动连接有第二转轴13；所述第二转轴13另一端固连有支撑板14；所述支撑板14下方于马达11驱动轴外表面固连有辅助板15；所述辅助板15上表面固连有均匀布置的电动伸缩杆16，且电动伸缩杆16均通过导线与控制器电连接；每个所述电动伸缩杆16另一端均与支撑板14固连；所述支撑板14上表面通过转杆转动连接有均匀布置的第一套环17，且第一套环17内均装有pcr管2；每个所述第一套环17外表面均固连有均匀布置的第一齿轮齿18；所述盒体1内表面于盒体1内壁中固连有均匀布置的第二齿轮齿19，且第二齿轮齿19均与第一齿轮齿18相互啮合；所述支撑板14上表面固连有支撑辊191，且支撑辊191延伸至盒体1上方；所述支撑辊191上表面固连有第一环板192；所述第一环板192内壁中开设有均匀布置的管孔，且管孔用于存放per管使用；每个所述管孔相背一侧于第一环板192外表面开设有均匀布置的第一开口193；所述第一环板192外表面通过均匀布置的支杆固连有第二环板194；所述第二环板194内表面开设有均匀布置的第二开口195，且第二开口195与第一开口193相互对应；每个所述pcr管2均延伸至第一开口193与第二开口195内；

工作时，本发明在对多个pcr管2内的试液进行离心时，由于现有技术中的离心装置的离心效果不高，导致试液在离心时无法将试液中的混合物与液体分离完全，从而导致在检测时无法检测到准确的数值，同时由于多个pcr管2的离心不是同时进行的，导致离心后的试液会再次发生扩散，从而影响试液检测的问题，同时现有技术在对试液离心的过程中无法将离心出的混合物进行稳固，从而会使混合物再次扩散，本发明制作的剂盒在给试液进行离心时，可以使所有的pcr管2同时离心，从而可以防止试液离心不同时，导致试液再次扩散，同时还可以将离心后的混合物堆积，并推至pcr管2上方，从而可以提高试剂的检测过程，在使用本发明制作的剂盒时，首先将pcr管2取出，然后将配置好的试液注入pcr管2内，然后将pcr管2卡入第一开口193与第二开口195之间，同时pcr管2底部均卡入第一套环17的空腔内，此时利用遥控器控制马达11转动，在马达11转动的过程中可以带动支撑板14转动，由于第一环板192通过支撑辊191与支撑板14固连，在支撑板14转动的过程中可以通过支撑辊191带动第一环板192转动，从而带动均匀布置的pcr管2转动，在此过程中可以对pcr管2内的试液进行离心，由于辅助板15上表面固连有均匀布置的电动伸缩杆16，且马达11的驱动轴与支撑板14通过第一转轴12与第二转轴13转转动连接，在支撑板14转动的过程中控制器控制均匀布置的电动伸缩杆16依次伸张，在一个电动伸缩杆16伸张的过程中，其它电动伸缩杆16向下收缩，同时第二转轴13在第一转轴12内做圆周运动，在此过程中支撑板14可以带动pcr管2波浪式运动，从而可以进一步提高试液的离心效果，同时还可以将试液离心出的混合物震荡至pcr管2上方，从而可以更方便的对试剂进行检测，由于第一套环17外表面固连的第一齿轮齿18与盒体1内表面固连的第二齿轮齿19相互啮合，在支撑板14带动第一套环17转动的过程中，第一齿轮齿18与第二齿轮齿19发生啮合，从而可以使第一套环17自转，在第一套环17自转的过程中可以带动pcr管2自转，在此过程中可以进一步提高试液的离心效果，从而可以提高试液的检测程度，由于pcr管2置于第一开口193与第二开口195之间，在pcr管2转动的过程中，可以防止pcr管2发生倾斜，从而影响试液的离心过程。

作为本发明的一种实施方式，每个所述pcr管2上表面均转动连接有管盖21；每个所述管盖21内壁中均通过支杆固连有插套22；所述第一环板192与第二环板194上表面均固连有均匀布置的插杆23，且插杆23与插套22均相互配合；每个所述管盖21下表面均固连有长杆24，且长杆24底部均为圆锥形设计；每个所述长杆24外表面均设有螺纹；每个所述pcr管2内均盛装有生物膜25，且长杆24伸入pcr管2时可扎破生物膜25；

工作时，当试液注入pcr管2内后，此时将管盖21盖在pcr管2上方，由于管盖21内壁中固连的插套22与第一环板192和第二环板194上表面固连的插杆23相互配合，从而可以将插杆23插入插套22内，在此过程中可以防止pcr管2内的试液在离心的过程中发生洒落，从而影响试剂的含量和检测精度，由于管盖21下表面固连有长杆24，在管盖21盖在pcr管2上方时，长杆24底部的锥形可以穿过生物膜25，由于长杆24外表面开设有螺纹，在pcr管2自转的过程中，pcr管2会带动生物膜25转动，由于长杆24插入生物膜25内，在生物膜25转动的过程中可以跟随生物膜25上的螺纹向上移动，在此过程中可以将生物膜25上方离心出的混合物堆积在生物膜25上，当生物膜25脱离螺纹时会卡在螺纹上方，在此过程中可以对试液中的混合物进行收集，从而提高试液离心后混合物的浓度，进而提高对混合物的检测效果。

作为本发明的一种实施方式，每个所述第一开口193与第二开口195内壁中均通过弹簧滑动连接有支撑层26，且支撑层26均为弧形设计，并与pcr管2相互贴合；

工作时，由于第一开口193与第二开口195内壁中均通过弹簧滑动连接有支撑层26，在pcr管2转动的过程中可以对pcr管2进行支撑，从而防止pcr管2在转动的过程中发生倾斜影响试液的离心过程，同时还可以缓冲pcr管2受到的作用力，从而防止pcr管2受到作用力的挤压使pcr管2发生损坏，同时在pcr管2自转的过程中支撑层26可以将pcr管2一直支撑在中轴线位置，从而防止pcr管2发生倾斜，影响试液的离心过程。

具体工作流程如下：

工作时，在使用本发明制作的剂盒时，首先将pcr管2取出，然后将配置好的试液注入pcr管2内，然后将pcr管2卡入第一开口193与第二开口195之间，同时pcr管2底部均卡入第一套环17的空腔内，此时利用遥控器控制马达11转动，在马达11转动的过程中可以带动支撑板14转动，由于第一环板192通过支撑辊191与支撑板14固连，在支撑板14转动的过程中可以通过支撑辊191带动第一环板192转动，从而带动均匀布置的pcr管2转动，在此过程中可以对pcr管2内的试液进行离心，由于辅助板15上表面固连有均匀布置的电动伸缩杆16，且马达11的驱动轴与支撑板14通过第一转轴12与第二转轴13转转动连接，在支撑板14转动的过程中控制器控制均匀布置的电动伸缩杆16依次伸张，在一个电动伸缩杆16伸张的过程中，其它电动伸缩杆16向下收缩，同时第二转轴13在第一转轴12内做圆周运动，在此过程中支撑板14可以带动pcr管2波浪式运动，由于第一套环17外表面固连的第一齿轮齿18与盒体1内表面固连的第二齿轮齿19相互啮合，在支撑板14带动第一套环17转动的过程中，第一齿轮齿18与第二齿轮齿19发生啮合，从而可以使第一套环17自转，在第一套环17自转的过程中可以带动pcr管2自转，由于pcr管2置于第一开口193与第二开口195之间，在pcr管2转动的过程中，可以防止pcr管2发生倾斜，从而影响试液的离心过程,当试液注入pcr管2内后，此时将管盖21盖在pcr管2上方，由于管盖21内壁中固连的插套22与第一环板192和第二环板194上表面固连的插杆23相互配合，从而可以将插杆23插入插套22内，由于管盖21下表面固连有长杆24，在管盖21盖在pcr管2上方时，长杆24底部的锥形可以穿过生物膜25，由于长杆24外表面开设有螺纹，在pcr管2自转的过程中，pcr管2会带动生物膜25转动，由于长杆24插入生物膜25内，在生物膜25转动的过程中可以跟随生物膜25上的螺纹向上移动，在此过程中可以将生物膜25上方离心出的混合物堆积在生物膜25上，当生物膜25脱离螺纹时会卡在螺纹上方，在此过程中可以对试液中的混合物进行收集。

为验证本发明非洲猪瘟病毒荧光pcr快速检测试剂盒的检测效果和检验标准，特作出以下方法进行结果判定：

检验项目一：性状检验

检验结果及判定标准：

检测项目二：质控试验

仪器名称：linegene9600plus荧光定量pcr仪

检验结果及判断标准(图7及下表)

综上可知：

1结果分析条件设定阈值设定原则：阈值线设定于刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。

2结果描述及判定：阳性对照ct值＜30并出现特异的扩增曲线，阴性对照无ct值且无特异的扩增曲线，实验结果成立。被检样品ct值＜35并出现特异的扩增曲线，判为非洲猪瘟病毒核酸阳性；无ct值且无特异的扩增曲线，判为非洲猪瘟病毒核酸阴性；35≤ct值＜40并出现特异的扩增曲线，判为非洲猪瘟病毒核酸疑似，对疑似样品，需重新取样提取dna，进行复检，ct值＜40判为阳性，否则判为阴性。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实验组的限制，上述实验组和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。