本发明涉及天然产物的提取，尤其是涉及一种从灵芝孢子粉中提取灵芝多糖的方法。
背景技术：
灵芝(ganodermalucidum)为担子菌纲的多孔菌科(polyproraceae)，属于灵芝属(ganoderma)真菌，是古今闻名的中药，具有延年益寿的作用，能够帮助治愈多种疾病，被称为灵丹妙药(zhou,etal.2012)。作为食品和药品的两用真菌，灵芝受到植物化学、药学、生物学等领域众多研究学者的关注(gao,etal.2006)。灵芝孢子(ganodermalueidiumspore)是灵芝成熟时的种子。灵芝孢子中含有灵芝全部的遗传物质，营养价值高于灵芝其他部位，而且灵芝孢子药用价值很高(唐柳,等.2011)。含有多种活性化学成分的灵芝孢子粉具有免疫调节、抑制肿瘤、抗癌、降血糖、降血脂、清除自由基、抗辐射神经、心血管、调节呼吸系统等多种药理学作用(yuan,etal.2006；baox,etal.2001；liux,etal.2002)。在灵芝孢子的活性成分中，多糖是最主要的活性成分之一。由于灵芝孢子具有双层细胞壁，在几丁质、钙和硅的作用下，孢壁坚硬无比，耐酸碱性高，且氧化分解十分困难，用一般的物理和化学方法很难对其进行破壁处理，这一特性不仅阻碍了人体对灵芝孢子有效成分的吸收和利用，而且限制了人们对它有效成分的研究。灵芝相关产品质量的检测和控制是功能性食品行业与制药工业发展中的重要环节，科学和有效的方法已经成为亟待解决的问题，而高效的提取方法是先决条件，多糖的提取为后续对多糖进行分离纯化、结构表征以及活性研究提供基础，在整个多糖的研究过程中多糖的提取起着至关重要的作用。因此，探究高效的多糖提取技术具有重要的现实意义。最常用的提取灵芝多糖的方法是传统热水法，近几年来，在多糖的国内外研究中，新的提取技术逐渐被发掘，包括微波辅助提取、超声波辅助提取、超高压提取法、超临界萃取法等(胡灵,等.2011；macw,etal.2013；prasad,etal.2010；gao,etal.2017)。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供用超高压处理与热水浸提结合，可节省溶剂与工艺成本，提取效率高，且提取的灵芝多糖具有良好抗氧化活性的一种从灵芝孢子粉中提取灵芝多糖的方法。
本发明包括以下步骤：
1)原料预处理：将破壁灵芝孢子粉干燥后加入石油醚，在室温下进行脱脂处理，将抽滤得到的孢子粉置于通风橱挥发至无醚味，然后再干燥，获得脱脂灵芝孢子粉；
2)浸润：在脱脂灵芝孢子粉中加入超纯水，置于自封袋超声；
3)超高压处理：将自封袋抽真空密封，然后将自封袋经过超高压处理；
4)热水提取：将超高压处理过的灵芝孢子粉恒温水浴，抽滤后得到灵芝多糖的粗提液；
5)灵芝多糖脱蛋白脱色素：在灵芝多糖的粗提液中加入大孔树脂，摇床处理，抽滤后得上清液，即脱脂脱蛋白的多糖溶液；
6)醇沉：将脱脂脱蛋白的多糖溶液进行旋转蒸发浓缩至原来体积的四分之一，往浓缩液中加入四倍体积的无水乙醇，沉淀过夜后离心，得到多糖沉淀，冷冻干燥后即得精制灵芝多糖粉末。
在步骤1)中，所述干燥的温度可为50～60℃，干燥的时间可为10～12h；所述破壁灵芝孢子粉与石油醚的料液比可为1︰(20～30)g/ml；所述脱脂处理的时间可为10～12h；脱脂处理过程中可用200～1000r/min均匀地搅拌；所述挥发的时间可为4～6h；所述再干燥的温度可为50～60℃。
在步骤2)中，所述脱脂灵芝孢子粉与超纯水的料液比可为1mg︰(10～55)ml；所述超声的时间可为5～10min。
在步骤3)中，所述抽真空的时间可为90～120s；所述超高压处理的保压时间3～15min，处理压力100～600mpa；优选保压时间为6～10min。
在步骤4)中，所述水浴的时间可为30～60min，水浴的温度可为60℃。
在步骤5)中，所述多糖溶液与大孔树脂的料液比可为1︰20(g/ml)；所述摇床处理的时间可为4～9h，摇床处理的温度28～35℃，摇床的转速可为200r/min。
在步骤6)中，所述沉淀过夜可在4℃环境下沉淀过夜；所述离心的时间可为12～15min；所述冷冻干燥的时间可为12h。
本发明提供了一种从灵芝孢子粉中提取灵芝多糖的工艺，包括脱脂、浸润、超高压处理、热水提取、乙醇沉淀多糖、大孔树脂除杂、透析、二次醇沉、真空冷冻干燥等步骤得到精制灵芝多糖。本发明提供的这种工艺结合了超高压与热水提取的方法并对灵芝多糖进行精提纯，仅一次提取能够达到普通方法提取的效果，节省了溶剂，效率高，杂质少，且提取与除杂工艺过程中无高温或酸碱环境，能够更好的保护多糖的结构。
与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点：
(1)本发明通过石油醚脱脂与超声波浸润的过程，能够有效地去除脂质，且石油醚能够回收获得灵芝中的脂类物质，提高原料的利用率，同时超声的过程可以使固液充分混合均匀。
(2)本发明先将孢子粉进行超高压处理再进行热水浸提提高了灵芝多糖的提取率。
(3)本发明采用大孔树脂除杂质，可以达到除蛋白除色素的效果，且树脂可以重复利用。
具体实施方式
以下实施例将对本发明作进一步的说明。本发明的特点和优点将随着描述而更清楚，但示例性的实施例仅仅用来说明本发明，并不对本发明的范围构成任何限制。
实施例1
(1)原料预处理：将破壁灵芝孢子粉在60℃的温度下干燥12h，然后按料液比1︰30(g/ml)的比例加入石油醚，在室温下进行脱脂处理12h，期间用500r/min均匀地搅拌。将抽滤得到的孢子粉置于通风橱挥发6h至无醚味，然后在60℃的温度下干燥，获得脱脂灵芝孢子粉；
(2)浸润：按照料液比1︰30mg/ml往孢子粉中加入超纯水，置于自封袋在超声5min。
(3)超高压处理：将自封袋抽真空120s密封，然后将自封袋经过超高压处理，保压时间10min，处理压力400mpa。
(4)热水提取：将超高压处理过的孢子粉在60℃环境下恒温水浴60min，抽虑后得到灵芝多糖的粗提液。
(5)灵芝多糖脱蛋白脱色素：按照1︰20(g/ml)的料液比，往灵芝多糖的粗提液中加入大孔树脂，放入28℃摇床中处理6h，抽虑后得上清液，即脱脂脱蛋白的多糖溶液；
(6)醇沉：将脱脂脱蛋白的多糖溶液进行旋转蒸发浓缩至原来体积的四分之一，往浓缩液中加入四倍体积的无水乙醇，在4℃环境下沉淀过夜后离心15min后得到多糖沉淀，最后将其冷冻干燥得到精制多糖粉末；
实施例2
(1)原料预处理：将破壁灵芝孢子粉在60℃的温度下干燥12h，然后按料液比1︰30(g/ml)的比例加入石油醚，在室温下进行脱脂处理12h，期间用1000r/min均匀地搅拌。将抽滤得到的灵芝孢子粉置于通风橱挥发6h至无醚味，然后在60℃的温度下干燥，获得脱脂灵芝孢子粉；
(2)浸润：按照料液比1︰40mg/ml往脱脂灵芝孢子粉中加入超纯水，置于自封袋在超声5min。
(3)超高压处理：将自封袋抽真空120s密封，然后将自封袋经过超高压处理，保压时间10min，处理压力500mpa。
(4)热水提取：将超高压处理过的孢子粉在60℃环境下恒温水浴60min，抽虑后得到灵芝多糖的粗提液。
(5)灵芝多糖脱蛋白脱色素：按照1︰20(g/ml)的料液比，往灵芝多糖的粗提液中加入大孔树脂，放入28℃摇床中处理6h，抽虑后得上清液，即脱脂脱蛋白的多糖溶液；
(6)醇沉：将脱脂脱蛋白的多糖溶液进行旋转蒸发浓缩至原来体积的四分之一，往浓缩液中加入四倍体积的无水乙醇，在4℃环境下沉淀过夜后离心15min后得到多糖沉淀，最后将其冷冻干燥得到精制多糖粉末；
实施例3
(1)原料预处理：将破壁灵芝孢子粉在60℃的温度下干燥12h，然后按料液比1︰30(g/ml)的比例加入石油醚，在室温下进行脱脂处理12h，期间用1000r/min均匀地搅拌。将抽滤得到的孢子粉置于通风橱挥发6h至无醚味，然后在60℃的温度下干燥，获得脱脂灵芝孢子粉；
(2)浸润：按照料液比1︰40mg/ml往孢子粉中加入超纯水，置于自封袋在超声10min。
(3)超高压处理：将自封袋抽真空120s密封，然后将自封袋经过超高压处理，保压时间8min，处理压力500mpa。
(4)热水提取：将超高压处理过的孢子粉在60℃环境下恒温水浴60min，抽虑后得到灵芝多糖的粗提液。
(5)灵芝多糖脱蛋白脱色素：按照1︰20(g/ml)的料液比，往灵芝多糖的粗提液中加入大孔树脂，放入28℃摇床中处理6h，抽虑后得上清液，即脱脂脱蛋白的多糖溶液；
(6)醇沉：将脱脂脱蛋白的多糖溶液进行旋转蒸发浓缩至原来体积的四分之一，往浓缩液中加入四倍体积的无水乙醇，在4℃环境下沉淀过夜后离心15min后得到多糖沉淀，最后将其冷冻干燥得到精制多糖粉末；
实施例4
(1)原料预处理：将破壁灵芝孢子粉在55℃的温度下干燥11h，然后按料液比1︰25(g/ml)的比例加入石油醚，在室温下进行脱脂处理11h，期间用800r/min均匀地搅拌。将抽滤得到的孢子粉置于通风橱挥发5h至无醚味，然后在55℃的温度下干燥，获得脱脂灵芝孢子粉；
(2)浸润：按照料液比1︰55mg/ml往孢子粉中加入超纯水，置于自封袋在超声8min。
(3)超高压处理：将自封袋抽真空100s密封，然后将自封袋经过超高压处理，保压时间10min，处理压力600mpa。
(4)热水提取：将超高压处理过的孢子粉在60℃环境下恒温水浴45min，抽虑后得到灵芝多糖的粗提液。
(5)灵芝多糖脱蛋白脱色素：按照1︰20(g/ml)的料液比，往灵芝多糖的粗提液中加入大孔树脂，放入35℃摇床中处理9h，抽虑后得上清液，即脱脂脱蛋白的多糖溶液；
(6)醇沉：将脱脂脱蛋白的多糖溶液进行旋转蒸发浓缩至原来体积的四分之一，往浓缩液中加入四倍体积的无水乙醇，在4℃环境下沉淀过夜后离心13min后得到多糖沉淀，最后将其冷冻干燥得到精制多糖粉末；
实施例5
(1)原料预处理：将破壁灵芝孢子粉在50℃的温度下干燥10h，然后按料液比1︰20(g/ml)的比例加入石油醚，在室温下进行脱脂处理10h，期间用200r/min均匀地搅拌。将抽滤得到的灵芝孢子粉置于通风橱挥发4h至无醚味，然后在50℃的温度下干燥，获得脱脂灵芝孢子粉；
(2)浸润：按照料液比1︰10mg/ml往脱脂灵芝孢子粉中加入超纯水，置于自封袋在超声5min。
(3)超高压处理：将自封袋抽真空90s密封，然后将自封袋经过超高压处理，保压时间6min，处理压力100mpa。
(4)热水提取：将超高压处理过的孢子粉在60℃环境下恒温水浴30min，抽虑后得到灵芝多糖的粗提液。
(5)灵芝多糖脱蛋白脱色素：按照1︰20(g/ml)的料液比，往灵芝多糖的粗提液中加入大孔树脂，放入30℃摇床中处理4h，抽虑后得上清液，即脱脂脱蛋白的多糖溶液；
(6)醇沉：将脱脂脱蛋白的多糖溶液进行旋转蒸发浓缩至原来体积的四分之一，往浓缩液中加入四倍体积的无水乙醇，在4℃环境下沉淀过夜后离心12min后得到多糖沉淀，最后将其冷冻干燥得到精制多糖粉末。
本发明采用超高压处理与热水浸提结合的方法从灵芝孢子粉中提取灵芝多糖，提取过程无高温或酸碱环境，仅一次提取就能达到较高的多糖提取率，节省了溶剂与工艺成本，且提取的灵芝多糖具有良好的抗氧化活性。本发明以较高的效率提取高质量的灵芝多糖，为灵芝多糖的提取技术提供了新方法，对灵芝产业的发展具有重要意义。
本发明的优势在于结合了超高压与热水提取的方法，节省了溶剂，效率高，杂质少，且提取与除杂工艺过程中无高温或酸碱环境，能够更好的保护多糖的结构。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，本发明的工艺同样适用于其他天然多糖的精制，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润色，这些改进和润色也应视为本发明的保护范围。