一种粗制鲨鱼肝油中提取角鲨烯的方法与流程

本发明属于油脂加工领域，具体涉及一种从鲨鱼肝油中提取(富集)角鲨烯的方法。

背景技术：

角鲨烯是由6个异戊二烯连接而成的高度不饱和的直链三萜类化合物，别名鲨萜、三十碳六烯、鱼肝油萜或角鲨油素，系统命名为2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯，分子式为c30h50，常温下为淡黄色或无色油状液体。角鲨烯具有提高缺氧耐受力功能、抑制微生物生长、抗菌消炎、调节胆固醇代谢等生物活性功效。临床上被用于防治心脏病、癌症、肝炎及各种缺氧性疾病，外敷可缓解鼻炎、扁桃体炎、痛风及哮喘等疾病。这是一种具有抗衰老、抗癌作用的无毒性的强化剂，被广泛应用于食品、医药及化妆品等行业中。角鲨烯来源广泛，存在于微生物、植物种籽、微藻、鲨鱼肝脏及人体皮脂中。但是，目前所发现植物来源中角鲨烯含量过低，实际生产与使用难度较高，进而限制了角鲨烯的开发利用。而由于角鲨烯突出的生理活性功能，其用途越来越广泛，相应的市场需求量也在日益扩大。为了满足实际工业生产需求，鲨鱼肝油仍是生产高纯度角鲨烯的主要原料。

目前，利用粗制鲨鱼肝油进行角鲨烯分离与纯化的方法主要有：酯化分离法、溶剂提取法、超临界流体萃取法、超声辅助提取法、水蒸气提取法、脂肪酶选择性水解法、分子蒸馏法、吸附分离法等。超临界流体萃取与分子蒸馏法的设备投入高、操作相对复杂，对操作者要求高。酯化分离法与水蒸气提取法所制备角鲨烯纯度不高，往往需要与其他方法相结合。而脂肪酶选择性水解法对于反应体系要求较高，不适合大批量生产。所以，仍需要提供一种生产成本低、操作简便、纯度高的角鲨烯制备方法。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种从粗制鲨鱼肝油中富集角鲨烯的方法，采用本发明的方法能制备高纯度(≥42％)角鲨烯以满足市场对角鲨烯的需求。

为解决上述技术问题，本发明提供一种粗制鲨鱼肝油中提取角鲨烯的方法(粗制鲨鱼肝油中制备高纯度角鲨烯的方法)，包括以下步骤：

1)、粗制鲨鱼肝油精制：

将粗制鲨鱼肝油分别进行脱胶、脱酸、脱色、脱臭，得精制鲨鱼肝油；

2)、不皂化物的提取：

按照精制鲨鱼肝油：氢氧化钾-乙醇溶液＝1：(5±0.5)的体积比，在精制鲨鱼肝油中加入浓度为0.5～2.5mol/l的氢氧化钾-乙醇溶液，于60～80℃反应40～80min；

反应所得液经后处理，得不皂化物；

3)、分子蒸馏：

不皂化物于刮膜式分子蒸馏装置中进行分子蒸馏，得分子蒸馏产物；

4)、过柱：

选用硅胶层析柱；

将分子蒸馏产物用二氯甲烷溶解后，上样过柱，分子蒸馏产物的上样量为3g，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝9:1体积比的混合液，洗脱流速为2ml/min；

所得洗脱液中含有富集后角鲨烯(高纯度角鲨烯)。

作为本发明的粗制鲨鱼肝油中提取角鲨烯的方法的改进，所述步骤3)为：

于刮膜式分子蒸馏装置中，不皂化物(100g)进料速率为1.5ml/min，压力0.1pa，预热温度65℃，蒸发温度180℃，刮膜转速200rpm；于分子蒸馏装置的轻相处获得分子蒸馏产物。

作为本发明的粗制鲨鱼肝油中提取角鲨烯的方法的进一步改进，所述步骤1)为：

1.1)、脱胶：

在粗制鲨鱼肝油中加入为粗制鲨鱼肝油重量1％的脱胶剂，于80℃、磁力搅拌转速500rpm下搅拌30min，脱胶剂为体积浓度85％磷酸水溶液；

然后，离心(10000g10min)；得脱胶油(脱胶后鲨鱼肝油)；

1.2)、碱法脱酸：

在脱胶油中加入碱液，于40℃、转速500rpm，搅拌20min；碱液为质量浓度20％naoh水溶液；

碱液的重量w总添加量＝w理论值+w超量碱；w理论值＝7.13×10^-4×w脱胶油×av，w超量碱＝4％×w脱胶油，

av为脱胶油的酸价，w脱胶油为脱胶油的重量，w总添加量为碱液的重量；

然后，离心(10000g10min)，热水洗涤(95℃热水)，得脱胶脱酸油；

1.3)、吸附脱色：

在脱胶脱酸油中加入为脱胶脱酸油重量10％的活性白土，于70℃、转速500rpm下搅拌20min；

然后，离心(10000g10min)；得脱胶脱酸脱色油；

1.4)、旋转蒸发脱臭：

将脱胶脱酸脱色油于220℃、转速70rpm、压力0.06mpa下搅拌60min，得精制鲨鱼肝油。

作为本发明的粗制鲨鱼肝油中提取角鲨烯的方法的进一步改进，所述步骤2)的后处理为：

在反应所得物液中加入水后用正己烷萃取，所得萃取液经清洗(10％乙醇水溶液清洗)、旋蒸，得不皂化物。

作为本发明的粗制鲨鱼肝油中提取角鲨烯的方法的进一步改进，所述步骤4)中，每40ml为1个收集单位，共获得20个收集单位；优选第10收集单位。

作为本发明的粗制鲨鱼肝油中提取角鲨烯的方法的进一步改进，步骤2)中：

氢氧化钾-乙醇溶液中，氢氧化钾浓度为1.5mol/l；

反应温度70℃，反应时间为60min。

在本发明中，所用的层析柱采用以下方法制备而得：

称取粒径为100-200目的硅胶与蒸馏水按照1：5的重量比混合，加入浓盐酸，调节ph至2左右并保持10min后，用蒸馏水洗涤至洗脱液为中性。然后置于105℃条件下活化24h。采用干法装柱，待硅胶界面不再下降后，用二氯甲烷洗脱除柱子中的杂质并平衡2h，静置待用。

对富集后样品(过柱所得的洗脱液)进行gc分析(利用气相色谱定量分析跟踪)，测定其中角鲨烯含量；具体如下：

称取一定量样品溶于正己烷，过滤待测。

气相色谱条件：hp-5毛细管色谱柱(30m×0.32mm，0.25μm)；升温程序：初温160℃，以15℃/min升至220℃，保持2min；然后以5℃/min升温至280℃，保持20min；最后以5℃/min升温至300℃，保持2min。进样口温度为250℃，分流比1:10。进样口温度300℃，进样量1μl，载气流速为1ml/min。每组样品重复测试3次。

本发明中，针对步骤2)的“不皂化物的提取”，试验设计的参数及结果如表1所示。

表1、试验设计及结果

通过对上述实验结果的分析，在碱浓度为1.5mol/l，反应温度70℃，时间60min，角鲨烯纯度为42.65％。

本发明具有如下技术优势：

1、对粗制鲨鱼肝油进行精制处理，减少油脂中杂质对角鲨烯纯度的影响，能有效地提高其品质，对后续制备高纯度角鲨烯就有积极作用，且精制前后并未减少角鲨烯总量。

2、以精制鲨鱼肝油为原料，采用溶剂提取法制备不皂化物。

3、采用100-200目硅胶对分子蒸馏物中的角鲨烯做进一步分离纯化。

本发明采用溶剂提取法、分子蒸馏法及吸附分离法相结合对粗制鲨鱼肝油中角鲨烯进行分离富集，相比于传统的酯交换法、超临界流体法、tlc等，本发明的方法操作更加简便、对设备要求较低且纯度能显著提高，有望将其投入工业化生产中。本发明为高纯度角鲨烯的工业化制备提供了一定的理论基础。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为从粗制鲨鱼肝油中制备高纯度角鲨烯的生产流程图；

图2为不同洗碱浓度对角鲨烯含量的影响图；

图3为不同温度对角鲨烯含量的影响图；

图4为不同反应时间对角鲨烯含量的影响

图5为角鲨烯标准品气相色谱图；

图6为角鲨烯标准曲线图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合实例对本发明进一步详细说明，但本发明所要求的保护范围并不局限于实施例描述的范围。

实施例1、从粗制鲨鱼肝油中制备高纯度角鲨烯的方法，依次进行以下步骤：

1)、粗制鲨鱼肝油精制：

分别进行脱胶、脱酸、脱色、脱臭：

1.1)、脱胶：

在粗制鲨鱼肝油中加入为粗制鲨鱼肝油重量1％的脱胶剂，于温度80℃、磁力搅拌转速500rpm下搅拌30min，脱胶剂为体积浓度85％磷酸水溶液；

然后，10000g离心10min；得脱胶油(脱胶后鲨鱼肝油)；

1.2)、碱法脱酸：

在脱胶油中加入碱液，于温度40℃、转速500rpm，搅拌20min；碱液为质量浓度20％naoh水溶液；

碱液的重量w总添加量＝w理论值+w超量碱；w理论值＝7.13×10^-4×w脱胶油×av，w超量碱＝4％×w脱胶油，

av为脱胶油的酸价，w脱胶油为脱胶油的重量，w总添加量为碱液的重量；

然后，10000g离心10min后，加入温度为95℃热水洗涤，每次洗涤热水用量约占脱胶油油重10％，水洗至洗脱液为中性；得脱胶脱酸油。

1.3)、吸附脱色：

在脱胶脱酸油中加入为其重量10％的活性白土，于温度70℃、转速500rpm下搅拌20min；

然后，10000g离心10min；得脱胶脱酸脱色油。

1.4)、旋转蒸发脱臭：

将脱胶脱酸脱色油，于温度220℃、转速70rpm、压力0.06mpa下搅拌60min，得精制鲨鱼肝油。

2)、不皂化物的提取：

称取精制鲨鱼肝油于三颈烧瓶中，加入一定浓度(0.5、1.0、1.5、2.0及2.5mol/l)氢氧化钾-乙醇溶液，精制鲨鱼肝油：氢氧化钾-乙醇溶液＝1：5的体积比，于70℃反应60min。

待反应结束后，从冷凝管顶部加入蒸馏水冷却至室温，蒸馏水的用量约等同于精制鲨鱼肝油的体积用量；接着倒入分液漏斗中，用正己烷萃取3次后合并萃取液；然后用体积浓度为10％乙醇水溶液清洗萃取液至洗脱液为中性，若在清洗过程中出现乳浊现象，须加少量无水乙醇破乳；无水乙醇的用量只需保证乳浊现象消失即可；最后将萃取液经无水硫酸钠脱水，并进行旋蒸(旋蒸温度为65℃，压力为0.1pa)直至恒重，得不皂化物，充氮后低温保存备用。

3)、分子蒸馏：

称取不皂化物100g装入刮膜式分子蒸馏装置中，进料速率为1.5ml/min，压力0.1pa，预热温度65℃，蒸发温度180℃，刮膜转速：200rpm。

于分子蒸馏装置的轻相处获得分子蒸馏产物。

4)、层析柱的制作：

称取粒径为100-200目的硅胶与蒸馏水按照1：5的重量比混合，加入浓盐酸，调节ph至2左右并保持10min后，用蒸馏水洗涤至洗脱液为中性。

然后置于105℃条件下活化24h。采用干法装柱，待硅胶界面不再下降后，用二氯甲烷洗除柱子中的杂质并平衡2h，静置待用。

5)过柱：称取步骤4)所得的分子蒸馏产物用二氯甲烷溶解后，上样过柱。

洗脱剂为二氯甲烷与甲醇复配(9:1,v/v)，分子蒸馏产物上样量为3g，洗脱流速为2ml/min。每40ml为1个收集单位(即，每40ml收集1管)，利用气相色谱定量分析跟踪。

共获得20个收集单位的洗脱液。

6)、gc分析角鲨烯：对步骤5)所得的富集后样品(洗脱液)进行gc分析测定其中角鲨烯含量。称取一定量样品溶于正己烷(即，将步骤5)第10收集单位的0.1g样品溶于2ml正己烷)，过滤(过0.22μm滤径的滤膜)待测。

气相色谱条件：hp-5毛细管色谱柱(30m×0.32mm，0.25μm)；升温程序：初温160℃，以15℃/min升至220℃，保持2min；然后以5℃/min升温至280℃，保持20min；最后以5℃/min升温至300℃，保持2min。进样口温度为250℃，分流比1:10。进样口温度300℃，进样量1μl，载气流速为1ml/min。

获得出峰时间为15.017min时的峰面积；每组样品重复测试3次。

7)、角鲨烯标准曲线的绘制

角鲨烯标准品气相分析结果如图5所示，角鲨烯的出峰时间大约在15.017min。

以角鲨烯纯品替代步骤5)所得的富集后样品，设定0、50、100、200、400、800μg/μl这5个浓度，按照上述步骤6)的气相色谱条件进行检测，角鲨烯标准曲线如图6所示，横坐标为角鲨烯浓度(μg/ml)，纵坐标为峰面积，线性回归方程为：y＝1.9214x+6.089，r²＝0.9999。

将富集后样品检测所得的峰面积带入上述曲线方程式，得富集后样品中角鲨烯浓度。

以粗制鲨鱼肝油替代步骤5)所得富集后样品，按照上述步骤6)的气相色谱条件进行检测，检测所得的峰面积带入上述曲线方程式，得粗制鲨鱼肝油中角鲨烯浓度。

结果如下：富集后样品中，角鲨烯纯度如图2所述。粗制鲨鱼肝油中，角鲨烯含量为8.50％。

由图2可知，角鲨烯纯度随着碱浓度的增加呈现先上升后下降的趋势。在低浓度时，精制鲨鱼肝油无法完全皂化，会导致过多的脂肪酸残留，水洗过程中无法去除，从而使角鲨烯含量偏低；随着碱浓度的不断增加，使皂化反应进行的更加完全，能更好的富集角鲨烯。然而，过量的碱就可能会破坏样品中角鲨烯含量。在碱浓度为1.5mol/l时，角鲨烯纯度在达到最高，为42.65％。因此，选定碱浓度为1.5mol/l进行下一步的优化。

因此，采用本发明的方法方法能有效制备高纯度的角鲨烯。

实施例2、从粗制鲨鱼肝油中制备高纯度的方法：

步骤2)的“不皂化物的提取”中，改成：选用1.5mol/l氢氧化钾-乙醇溶液，将反应温度设定为60、65、70、75及80℃；

其余等同于实施例1。

所得结果如图3所示。

由图3可知，反应温度在60℃至70℃范围内，角鲨烯纯度随着温度的升高而增加，但随着温度的继续升高，角鲨烯纯度呈现逐渐下降的趋势。分析其原因可能是，当温度较低时，皂化反应速率慢，导致皂化不彻底，残留过多的脂肪酸，从而降低了角鲨烯的含量；但当温度过高时，高温、碱性的反应环境易导致角鲨烯结构破损，而使角鲨烯纯度下降。在温度为70℃，角鲨烯纯度在达到最高。因此，反应温度为70℃进行后续优化。

实施例3、从粗制鲨鱼肝油中制备高纯度的方法：

步骤2)的“不皂化物的提取”中，改成：选用1.5mol/l氢氧化钾-乙醇溶液、70℃条件下反应一定时间(40、50、60、70及80min)。其余等同于实施例1。

结果如图4所示。

由图4可知，角鲨烯纯度随着反应时间的增加呈现先升高后降低的趋势。分析原因可能是，反应时间过短，皂化反应不完全；时间过长，高温、碱性的环境会破坏大量的角鲨烯，从而降低了角鲨烯纯度。在时间为60min，角鲨烯纯度在达到最高。因此，反应时间为60min进行后续优化。

实施例4、优选技术方案：

步骤2)中，氢氧化钾-乙醇溶液中，氢氧化钾浓度为1.5mol/l；反应温度70℃，反应时间为60min。

其余同实施例1。角鲨烯纯度为42.65％。

对比例1、

取消步骤1)；

将步骤2)“不皂化物的提取”改为：称取粗制鲨鱼肝油于三颈烧瓶中，加入2.5mol/l氢氧化钾-乙醇溶液，90℃反应80min。粗制鲨鱼肝油：氢氧化钾-乙醇溶液＝1：5的体积比。

待反应结束后，从冷凝管顶部加入蒸馏水冷却至室温，再将反应液倒入分液漏斗中，并用乙酸乙酯萃取3次后合并萃取液。其余等同于实施例1。

所得产物中，角鲨烯最高纯度为30.67％。

对比例2、

将实施例4步骤3)的“分子蒸馏”改为：不皂化物用量100g，进料速率为2.0ml/min，压力0.1pa，预热温度70℃，蒸发温度200℃，刮膜转速：200rpm。其余等同于实施例4。

所得产物中，角鲨烯最高纯度为35.98％。

对比例3、将实施例4步骤5)的“过柱”改为：洗脱剂为正己烷：乙酸乙酯的复配(100:1,v/v)，上样量为2.5g，洗脱流速为3ml/min；每10ml为1个收集单位。其余等同于实施例4。

所得产物中，角鲨烯最高纯度为38.05％。

对比例4、将实施例4的步骤1)改为，“脱胶”为：脱胶剂为85％柠檬酸，添加量为油重1％；“脱酸”为，碱液的重量w总添加量＝w理论值；将“脱色”改为活性白土添加量占油重1％。其余等同于实施例4。

所得产物中，角鲨烯最高纯度为32.11％。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。