一种融合有VEGF的丝素蛋白移植物及其制备方法与流程

本发明涉及生物医学材料技术领域，尤其涉及一种融合有vegf的丝素蛋白移植物及其制备方法。

背景技术：

血管内皮生长因子(vegf)是一种潜在的选择性内皮细胞有丝分裂原，可以促进血管的生成，但也可以增加血管的通透性。在神经系统中，vegf的mrna在大脑毛细血管丰富区域的神经元中被发现，此外脊髓损伤部位的星形胶质细胞中也有vegf的诱导表达，vegf在神经系统损伤后的位置和表达方式与vegf作为血管生成因子的作用相吻合。随着研究的深入，人们发现其他类似的促血管生成因子，如碱性成纤维生长因子(bfgf)、血小板衍生生长因子(pdgf)等，vegf同样被证明拥有神经营养和促进神经系统细胞生长的作用。研究发现在培养的神经节中加入vegf能够促进神经细胞存活、轴突生长以及雪旺细胞的增殖。

血管遍布全身，提供氧气和营养物质同时清除代谢物，是机体重要的支持系统。在再生组织和器官中更快、更有效的血管生成能够提高它们的生存几率以及生理功能。而在再生医学和组织工程领域，研究的重点也越来越多地集中在为再生组织和器官建立血液供应。周围神经损伤是一个常见的全球性临床问题，严重影响患者的生活质量，造成巨大的社会经济负担。虽然周围神经系统在损伤后比中枢神经系统具有更强的轴突再生能力，但自发的周围神经修复几乎是不完整的，功能恢复较差。周围神经再生的影响因素有很多，包括损伤的类型和程度、损伤修复的时间和方式以及患者的综合情况等，其中血液供血不足是重要的制约和瓶颈因素之一，尤其是长距离周围神经损伤。研究发现血管内皮细胞能够引导周围神经轴突的再生，这也证实了神经再生与血管生成的直接关系。目前组织工程学血管化主要是在组织工程材料中包埋血管生成因子或是通过血管内皮细胞的移植来实现的，但鉴于血管生成因子在体内的不稳定性，材料包埋法促血管生成的作用较为有限，而细胞移植的操作较为复杂，因此如何更简单获得能够长效稳定发挥促血管生成作用的新型神经移植物具有重要的科学意义。

丝素蛋白是一种常见的天然生物高分子材料，它具有良好的生物相容性，优良的力学性质，可控的生物降解性，已被广泛的应用于组织工程领域，目前尚没有将丝素蛋白与血管内皮生长因子融合构建移植物的报道。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种融合有vegf的丝素蛋白移植物及其制备方法，将血管内皮生长因子(vegf)活性肽段与丝素蛋白轻链相结合构成融合蛋白，以此融合蛋白为基础进行丝素蛋白的自组装获得了一种既能稳定地促进血管生成又能发挥神经保护功能、促进神经再生的新型移植物。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：一种融合有vegf的丝素蛋白移植物的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)重组表达载体的构建：合成包含有丝素蛋白轻链以及vegf的基因片段，连接至pet-30表达载体，完成重组表达载体的构建；

(2)融合蛋白的表达及纯化：将步骤(1)获得的重组表达载体转入bl21大肠杆菌，37℃诱导表达后超声破碎，使用ni-nta纯化融合蛋白并鉴定，得到融合蛋白；

(3)蚕丝丝素纤维的获取：取桑蚕丝，置于0.2％的碳酸钠溶液中煮沸30分钟，取出后用三蒸水充分洗涤，重复此步骤2-4次，得到脱去外部丝胶的丝素纤维，置于超净台晾干备用；

(4)丝素蛋白溶液的制备：将丝素纤维放入硫氰酸锂溶液中进行溶解，溶解后的溶液装入透析袋，以三蒸水为透析液透析60-80小时，得到丝素蛋白溶液；

(5)丝素纤维网的制备：将步骤(3)获得的丝素纤维用编织机编织成丝素纤维网；

(6)将步骤(5)获得的丝素纤维网置入模具中，将步骤(2)获得的融合蛋白以及步骤(4)获得的丝素蛋白溶液混合，得到混合蛋白溶液，将混合蛋白溶液倒入模具中置于-70℃冷冻干燥，丝素蛋白、融合蛋白和丝素纤维网自组装形成神经导管；

(7)变形处理：将步骤(6)获得的神经导管进行变形处理，三蒸水洗涤后晾干，最终获得了具有vegf活性的丝素蛋白神经移植物。

优选地，所述步骤(4)中，透析袋的截留分子量为12～16kda。

优选地，所述步骤(4)中，硫氰酸锂溶液的浓度为9mol/l。

优选地，所述步骤(6)中，混合蛋白溶液的浓度为5％-10％。

优选地，所述步骤(7)中，神经导管变形处理为浸泡在60％乙醇中处理10～14h。

本发明还提供了一种融合有vegf的丝素蛋白移植物，由所述的制备方法制备而成。

本发明具有以下有益效果：

本发明中构建的融合蛋白为丝素蛋白轻链与vegf相融合，当将融合蛋白加入到丝素蛋白溶液中时，融合蛋白能与丝素蛋白重链以及p25蛋白进行自组装，从而将vegf活性肽段固定于丝素移植物中，能够长时间稳定地发挥其促血管生成作用。

本发明构建的具有vegf活性的移植物不仅具有神经保护以及促进神经再生的作用，同时还具有促血管生成的作用，新生的血管能够为神经组织再生提供足够的养分以及信号分子的传递，进一步促进损伤部分神经组织的再生。

本发明中使用的材料主体为丝素蛋白，在整个移植物的加工过程中没有使用交联剂、表面活性剂等毒性物质，具有良好的生物相容性，利于细胞的粘附、增殖以及迁移。

附图说明

图1为本发明含vegf的丝素蛋白促血管内皮细胞成血管的代表性图。

图2为本发明含vegf的丝素蛋白促血管内皮细胞成血管的统计分析图。

图3为本发明含vegf的丝素蛋白促drg神经元轴突生长的代表性图。

图4为本发明含vegf的丝素蛋白促drg神经元轴突生长的统计分析图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

参照图1-图4，实施例一

一种融合有vegf的丝素蛋白移植物的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)重组表达载体的构建：合成包含有丝素蛋白轻链以及vegf的基因片段，连接至pet-30表达载体，完成重组表达载体的构建；

(2)融合蛋白的表达及纯化：将步骤(1)获得的重组表达载体转入bl21大肠杆菌，37℃诱导表达后超声破碎，使用ni-nta纯化融合蛋白并鉴定，得到融合蛋白；

(3)蚕丝丝素纤维的获取：取50g桑蚕丝，置于2l的0.2％的碳酸钠溶液中煮沸30分钟，取出后用三蒸水充分洗涤，重复此步骤2次，得到脱去外部丝胶的丝素纤维，置于超净台晾干备用；

(4)丝素蛋白溶液的制备：将步骤(3)获得的丝素纤维12g放入50ml的9m的硫氰酸锂溶液中进行溶解，设置溶解温度为40℃，搅拌直至丝素纤维全部溶解，随后将获得的丝素蛋白溶液用三蒸水进行透析，透析袋截留分子量为12kda，4℃透析72h，获得纯化的丝素蛋白溶液；

(5)丝素纤维网的制备：将步骤(3)获得的丝素纤维用编织机编织成丝素纤维网；

(6)将步骤(5)获得的丝素纤维网置入模具中，将步骤(2)获得的融合蛋白以及步骤(4)获得的丝素蛋白溶液混合，得到混合蛋白溶液，混合蛋白溶液的浓度配置为5％(w/v)，将混合蛋白溶液倒入模具中置于-70℃冷冻干燥，丝素蛋白、融合蛋白和丝素纤维网自组装形成神经导管；

(7)变形处理：将步骤(6)获得的神经导管浸泡在60％乙醇中进行变形处理12h，三蒸水洗涤后晾干，最终获得了具有vegf活性的丝素蛋白神经移植物。

本发明还提供了一种融合有vegf的丝素蛋白移植物，由所述的制备方法制备而成。

实施例二

一种融合有vegf的丝素蛋白移植物的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)重组表达载体的构建：将丝素蛋白轻链与vegf活性肽段融合后通过酶切连接构建至表达载体pet-30a(+)，测序验证重组表达载体pet-fibl-vegf的成功构建。

(2)融合蛋白的表达及纯化：将步骤(1)获得的重组表达载体转入bl21大肠杆菌中构建表达菌株，调取单个阳性克隆至1mllb液体培养基中，37℃过夜培养，第二天按照1：1000比例扩大至50ml，150rpm摇至菌液od600约为1.0后加入终浓度为1mm的iptg于37℃诱导表达16h。

其中，离心收集菌沉，超声破碎后使用ni-nta分离纯化带有his标签的目的蛋白，sds-page和wb鉴定目的蛋白的表达。

(3)蚕丝丝素纤维的获取：取60g桑蚕生丝放入3l的0.2％碳酸钠溶液中煮沸30分钟，取出后用三蒸水充分洗涤，重复此步骤3次，得到脱去外部丝胶的丝素纤维，置于超净台晾干备用。

(4)丝素蛋白溶液的制备：将13g丝素纤维放入70ml的9m的硫氰酸锂溶液中进行溶解，设置溶解温度为50℃，搅拌直至丝素纤维全部溶解，随后将溶解后的丝素蛋白溶液装入透析袋，透析袋的截留分子量为14kda，以三蒸水为透析液4℃透析72小时，得到纯化的丝素蛋白溶液。

(5)丝素纤维网的制备：将步骤(3)获得的丝素纤维用编织机编织成丝素纤维网。

(6)将步骤(5)获得的丝素纤维网置入模具中，将纯化的融合蛋白与丝素蛋白混合，得到混合蛋白溶液，并进行浓缩至7％(w/v)，将其倒入模具中置于-70℃冷冻干燥，通过丝素蛋白溶液与融合蛋白自组装形成神经导管。

(7)将步骤(6)获得的神经导管浸泡在60％乙醇中进行变形处理12h，三蒸水洗涤后晾干，最终获得了具有vegf活性的移植物。

本发明还提供了一种融合有vegf的丝素蛋白移植物，由所述的制备方法制备而成。

实施例三

一种融合有vegf的丝素蛋白移植物的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)重组表达载体的构建：将丝素蛋白轻链与vegf活性肽段融合后通过柔性linker连接后经过酶切连接构建至表达载体pet-30a(+)，测序验证重组表达载体pet-fibl-l-vegf的成功构建。

(2)融合蛋白的表达及纯化：将步骤(1)获得的重组表达载体转入bl21大肠杆菌中构建表达菌株，调取单个阳性克隆至1mllb液体培养基中，37℃过夜培养，第二天按照1：1000比例扩大至50ml，150rpm摇至菌液od600约为1.0后加入终浓度为1mm的iptg于37℃诱导表达16h；

其中，离心收集菌沉，超声破碎后使用ni-nta分离纯化带有his标签的目的蛋白，sds-page和wb鉴定目的蛋白的表达。

(3)蚕丝丝素纤维的获取：取80g桑蚕生丝放入4l的0.2％碳酸钠溶液中煮沸30分钟，取出后用三蒸水充分洗涤，重复此步骤4次，得到脱去外部丝胶的丝素纤维，置于超净台晾干备用。

(4)丝素蛋白溶液的制备：将15g丝素纤维放入80ml的9m的硫氰酸锂溶液中进行溶解，设置溶解温度为60℃，搅拌直至丝素纤维全部溶解，随后将溶解后的丝素蛋白溶液装入透析袋，透析带的截留分子量为16kda，以三蒸水为透析液4℃透析72小时，得到纯化的丝素蛋白溶液。

(5)丝素纤维网的制备：将步骤(3)获得的丝素纤维用编织机编织成丝素纤维网。

(6)将步骤(5)获得的丝素纤维网置入模具中，将纯化的融合蛋白与丝素蛋白混合，得到混合蛋白溶液，并进行浓缩至8％(w/v)，将其倒入模具中置于-70℃冷冻干燥，通过丝素蛋白溶液与融合蛋白自组装形成神经导管。

(7)将步骤(6)获得的神经导管浸泡在60％乙醇中进行变形处理12h，三蒸水洗涤后晾干，最终获得具有vegf活性的移植物。

本发明还提供了一种融合有vegf的丝素蛋白移植物，由所述的制备方法制备而成。

实施例四

一种融合有vegf的丝素蛋白移植物的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)构建重组表达载体，将丝素蛋白轻链与两个通过柔性linker连接的vegf活性肽段融合后经过酶切连接构建至表达载体pet-30a(+)，测序验证重组表达载体pet-fibl-vegf-l-vegf的成功构建。

(2)将重组载体转化至bl21大肠杆菌中构建表达菌株，调取单个阳性克隆至1mllb液体培养基中，37℃过夜培养，第二天按照1：1000比例扩大至50ml，150rpm摇至菌液od600约为1.0后加入终浓度为1mm的iptg于37℃诱导表达16h。

其中，离心收集菌沉，超声破碎后使用ni-nta分离纯化带有his标签的目的蛋白，sds-page和wb鉴定目的蛋白的表达。

(3)取50g桑蚕生丝放入2l的0.2％碳酸钠溶液中，煮沸处理30分钟以去除外部的丝胶，此过程重复3次，三蒸水多次洗涤，将丝素纤维置于超净台晾干。

(4)将获得丝素纤维12g加入至50ml的9m的硫氰酸锂溶液中，设置溶解温度为40℃，搅拌直至丝素纤维全部溶解，随后将获得的丝素蛋白溶液用三蒸水进行透析，透析袋截留分子量约为16kda，4℃透析72h，获得纯化的丝素蛋白溶液。

(5)将步骤(3)获得的丝素纤维用编织机编织成丝素纤维网。

(6)将步骤(5)获得的丝素纤维网置入模具中，将纯化的融合蛋白与丝素蛋白混合后进行浓缩至10％(w/v)，倒入模具中置于-70℃冷冻干燥，通过丝素蛋白溶液与融合蛋白自组装形成神经导管。

(7)将步骤(6)获得的神经导管浸泡在60％乙醇中进行变形处理12h，三蒸水洗涤后晾干，最终获得具有vegf活性的移植物。

本发明还提供了一种融合有vegf的丝素蛋白移植物，由所述的制备方法制备而成。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。