枯草芽孢杆菌MK15及其发酵方法与用途与流程

本发明属于微生物发酵工程技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌mk15；本发明还涉及该枯草芽孢杆菌mk15发酵米糠工艺及产物抑制α-葡萄糖苷酶的用途。

背景技术：

枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）是我国农业部批准使用的有益菌种，常作为生物发酵剂，在生长过程中可产生蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶、纤维素酶等，常将其用于豆类水解成氨基酸、多肽及氨类化合物。2008年，朱运平等人用枯草芽孢杆菌发酵豆渣提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率达到90%，与本实验最优条件发酵米糠的产物的结果相似。2011年，张友维等人用枯草芽孢杆菌发酵花生，获得了具有抗氧化能力较强的花生多肽。2014年，shin等用bacillussubtiliscsyl91发酵了黑豆，显著提高了黑豆的抗氧化能力。2017年，罗斌等人用枯草芽孢杆菌发酵米糠制备活性肽。

米糠是稻米加工过程中的副产物，主要成分为种皮、糊粉层和牙胚，约占稻米质量的6%-8%，为可再生资源，其含有丰富的优质脂肪酸、维生素、γ-氨基丁酸和大量的膳食纤维等。根据资料显示，种植水稻的国家很多，区域很广，产量也很大，大部分集中在亚洲地区。中国是世界上最大的水稻种植国，米糠的年产量约为1800万吨。但是，以往大都用作牲畜的饲料或肥料，利用率低，如废弃还造成环境污染。ii型糖尿病，又叫非胰岛素依赖型糖尿病（niddm）,是胰岛素抵抗、胰岛素分泌不足或者两样都兼有造成的。由于ii型糖尿病的前期症状较轻，往往会被忽视，在我国糖尿病者中占95%以上为ii型，其病程长，并发症多，对人类健康威胁大。在医学上，可以通过增加胰岛素敏感、促进胰岛素分泌、抑制α-葡萄糖苷酶活性等方法来缓解和治愈ii型糖尿病。

α-葡萄苷酶抑制剂（简称agi）通过抑制肠粘膜刷状缘的糖苷酶活性来降低双糖水解为单糖的速度，从而减缓餐后血糖的上升，因此，能有效减缓糖尿病前期患者发展为糖尿病，对糖尿病的并发症也有很好的预防作用。α-葡萄糖苷酶抑制剂作为第4类公认的治疗糖尿病的药物，是较为重要的降血糖药物。除了治疗糖尿病外，agi还被发现可用于治疗高血压、血脂、肥胖以及抗病毒感染等。阿卡波糖是首个上市的糖苷酶抑制剂，在我国是常见的血糖药物，对血糖的控制效果也较好。但是，长期服用存在一定的副作用，如对肝脏造成损害和引起肠梗阻等。所以寻找天然、安全、经济的α-葡萄糖苷酶抑制剂药物是控制糖尿病的有效途径。目前，国外主要是将化学和生化相结合的方法，国内则多是从中药中提取等传统方法。从微生物发酵中提取，对活性成分进行分离和纯化的报道还比较少。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的菌株枯草芽孢杆菌mk15。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供了枯草芽孢杆菌mk15发酵米糠产α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法。

本发明所要解决的再一个技术问题是提供了枯草芽孢杆菌mk15发酵米糠产α-葡萄糖苷酶抑制剂的用途。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：本发明是一种枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）mk15，其保藏号为cgmccno.19743。

本发明公开的枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）mk15来自于四川泡菜。该菌株于2020年4月26日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmccno:19743。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发是还公开了一种枯草芽孢杆菌mk15发酵米糠产α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，其特点是，包括以下步骤：

（1）枯草芽孢杆菌mk15种子液接入发酵培养基发酵培养：发酵温度为35℃，发酵时间为48h-50h，ph为8.0，接种量为3%，摇床转速为180rpm，发酵装液量为50ml/250ml；所述的发酵培养基是：米糠5%、葡萄糖0.1%、nacl0.5%、尿素0.5%、ph8.0、自来水配制，115℃灭菌20min；

（2）取枯草芽孢杆菌mk15发酵液，4℃，8000rpm离心30min，取上清液过0.45μm滤膜；

（3）发酵产物的纯化：用hcl和naoh溶液调节ph去除米糠发酵产物中的酸性和碱性蛋白，用无水乙醇醇沉，再用sevage法去除剩余的蛋白，真空冷冻干燥机冻干，即得。

本发明所述的一种枯草芽孢杆菌mk15发酵米糠产α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，其进一步优选的特点是，种子液的制备方法是：从斜面刮取两环枯草芽孢杆菌mk15接入50ml种子培养基，37℃，180rpm，培养24h；种子培养基的组成为：牛肉浸膏3g/l、蛋白胨10g/l、nacl5g/l、ph7.0、自来水配制，121℃灭菌20min。

本发明所述的一种枯草芽孢杆菌mk15发酵米糠产α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，其进一步优选的特点是，发酵产物的纯化方法为：

（1）用氢氧化钠将米糠发酵液的ph值调至9.0，8000rpm离心30min，去除碱性蛋白；

（2）再用盐酸将ph值调至5.0去除酸性蛋白，然后将ph值调到7.0；

（3）用三倍体积的无水乙醇，4℃，醇沉24h，8000rpm离心30min后取沉淀，用蒸馏水复溶；

（4）用sevage法去除剩余蛋白，将样品溶液、氯仿、正丁醇之比调为25:5:1，混合物剧烈震荡30min，8000rpm，4℃，离心5min，去除蛋白质与氯仿，正丁醇生成的凝胶物；发酵产物用真空冷冻干燥机冻干。

本发明还公开了一种枯草芽孢杆菌mk15发酵产物的用途，所述的用途为将枯草芽孢杆菌mk15发酵产物用于α-葡萄糖苷酶抑制剂，所述的发酵产物是采用以上技术方案所述的方法制得。

发明人对本发明的研究方法主要体现在：

⑴单因子实验设计：在基础培养条件的基础上，分别选取不同的可能对米糠发酵产抑制剂起到促进作用的培养条件，经过发酵培养后，4℃，8000rpm离心30min后，取上清液过0.45μm滤膜，测量对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率。

⑵显著性因子的筛选：以α-葡萄糖苷酶抑制率为响应值，对单因子实验设计中能影响到米糠发酵的培养条件进行筛选，选取对产抑制率显著性增强的培养条件。采用中心组合设计：根据单因素实验结果选取的显著正效应的培养条件，为响应面优化实验因素的中心点，采用统计软件box-benhnken进行实验设计，以α-葡萄糖苷酶抑制率为响应值，对响应面模型进行方差分析，确定培养组合效应产生对α-葡萄糖苷酶活性抑制率的最大值。

验证实验：根据响应面优化实验结果，进行验证实验。

米糠发酵产物初步纯化：米糠发酵产物4℃，8000rpm离心30min后，用hcl和naoh溶液调节ph去除酸性和碱性蛋白，用三倍体积的无水乙醇醇沉，再用sevage法去除剩余的蛋白，用真空冷冻干燥机冻干备用。

通过sem对纯化后米糠发酵产物结构进行了表征：将米糠发酵产物的冻干粉取微量固定在观察台上，采用离子溅射方法镀金，放在扫描电镜下观察分析发现，米糠发酵产物呈现块状多孔分支链状态。

通过ft-ir对纯化后的米糠发酵产物结构进行表征：将米糠发酵产物冻干粉在80℃下烘干，在红外灯下，将微量样品和干燥的kbr粉末混匀并充分研磨后，用真空压片机压片，然后用红外光谱仪进行扫描，扫描范围为4000-400cm^-1。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种新的菌株枯草芽孢杆菌mk15，用枯草芽孢杆菌mk15发酵米糠，其产物对α-葡萄糖苷酶活性具有很强抑制作用。

经响应面法对发酵条件优化后，对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率达到了88.8%。通过对纯化后的米糠发酵产物结构进行了表征，脱水的米糠发酵产物可形成多孔块状结构；ft-ir的结果表明其为含有侧链的多糖类物质。

本发明方法以α-葡萄糖苷酶抑制率为响应值，首先采用单因子实验设计对可能影响到枯草芽孢杆菌mk15发酵培养的条件进行筛选，选取发酵培养条件改变时对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率产生显著增强的培养条件。进一步采用中心组合设计，以对α-葡萄糖苷酶的抑制率为响应值，通过响应面统计分析确定发酵培养条件的最优组合效应。

附图说明：

图1为培养温度对产α-葡萄糖苷酶抑制率的影响图；

图2为时间对产α-葡萄糖苷酶抑制率的影响图；

图3为ph对产α-葡萄糖苷酶抑制率的影响图；

图4为接种量对产α-葡萄糖苷酶抑制率的影响图；

图5为米糠添加量对产α-葡萄糖苷酶抑制率的影响图；

图6为转速对产α-葡萄糖苷酶抑制率的影响图；

图7为装液量对对产α-葡萄糖苷酶抑制率的影响图；

图8为培养ph与温度的交互作用的响应面图和等高线图；

图9为培养时间与温度的交互作用的响应面图和等高线图；

图10为培养ph与时间的交互作用的响应面图和等高线图；

图11为米糠发酵产物在5000x放大倍数下的sem图像；

图12为米糠发酵产物的红外色谱图（500-4000cm^-1）。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细阐述，以便于本领域的技术人员进一步的理解本发明，而不构成对其权利的限制。

实施列1，枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）mk15，其保藏号为cgmccno.19743。

（一）枯草芽孢杆菌mk15的米糠发酵产物的制备及纯化方法如下：

发酵种子的制备：从斜面刮取两环枯草芽孢杆菌mk15接入50ml种子培养基（na:牛肉浸膏3g/l、蛋白胨10g/l、nacl5g/l、ph7.0、自来水、121℃灭菌20min），37℃，180rpm，培养24h。

米糠发酵产物的制备：将种子液按3%的量接种至米糠发酵培养基（米糠5%、葡萄糖0.1%、nacl0.5%、尿素0.5%、ph8.0、自来水配制，115℃，灭菌20min）中，35℃，180rpm发酵48h后，8000rpm，4℃离心30min取上清液过0.45μm滤膜，测量对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率。

米糠发酵产物进行初步纯化：用氢氧化钠将米糠发酵液的ph值调至9.0，8000rpm离心30min，去除碱性蛋白，再用盐酸将ph值调至5.0去除酸性蛋白，然后将ph值调到7.0。用三倍体积的无水乙醇，4℃，醇沉24h，8000rpm离心30min后取沉淀，用蒸馏水复溶。用sevage法去除剩余蛋白，根据蛋白质在氯仿等有机溶剂变性而不溶于水的特点，将样品溶液、氯仿、正丁醇之比调为25:5:1，混合物剧烈震荡30min，8000rpm，4℃，离心5min，去除蛋白质与氯仿，正丁醇生成的凝胶物。将初步纯化的米糠发酵产物用真空冷冻干燥机冻干。

米糠发酵产物在5000x放大倍数下的sem图像参照图11；米糠发酵产物的红外色谱图（500-4000cm^-1）参照图12。

（二）米糠发酵产物的α-葡萄糖苷酶抑制活性测定：

α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定：在96孔板中加入50μl浓度0.5mph6.7磷酸盐溶液，30μl0.5mmpnpg底物溶液，50μl样品溶液，20μlα-葡萄糖苷酶溶液（用磷酸盐溶液将α-葡萄糖苷酶溶液配置成200u/ml），在37℃反应30min，加入50μl0.67mna2co3溶液终止反应，混匀后在405nm处测量吸光值，采用阿卡波糖作为阳性对照。空白组用磷酸盐溶液代替pnpg底物溶液和酶液，对照组用磷酸盐溶液代替样品溶液。

计算α-葡萄糖苷酶抑制活性公式：将吸光值代入以下公式

agi(%)=[a对照-（a样品-a空白）]/a对照×100%

式中：agi为α-葡萄糖苷酶抑制率，%；a样品为样品组的吸光度值；a空白为空白组的吸光度值；a对照为对照组的吸光度值。

（三）米糠发酵单因素实验

培养温度、时间、ph、接种量对α-葡萄糖苷酶活性的影响：

将枯草芽孢杆菌mk15活化后的种子液按3%的量接种到装有50ml发酵培养基的250ml的三角瓶中，180rpm，在不同温度（25-40℃）下发酵48h后，按照实施案列1-的方法制备成待测样品，按照实施列2的方法测试对α-葡萄糖苷酶的抑制率。

将枯草芽孢杆菌mk15种子液按3%的接种量接入发酵培养基中，在35℃，180rpm，培养不同时间（25-72h）取出测量对α-葡萄糖苷酶的抑制率。

将发酵培养基ph值调至6.0-10.0，并在最优条件下发酵，取发酵液离心后，过0.45μm滤膜后测量对α-葡萄糖苷酶的抑制率。

将枯草芽孢杆菌mk15种子液按照不同量添加到发酵培养基中，按照以上最优条件进行发酵48h。

米糠添加量、转速、装液量对α-葡萄糖苷酶活性的影响

发酵培养基中的米糠添加量分别为0-9%，ph为8.0，接种量为3%，温度为35℃、摇床转速为180rpm、发酵时间为48h，然后测定α-葡萄糖苷酶的抑制率，确定最佳米糠添加量。

在不同转速（120~220rpm），最优米糠添加量、温度、时间下进行培养，用标准的方法测对α-葡萄糖苷酶的抑制率，确定最佳ph。

将不同体积培养基（20-80ml）装入250ml三角瓶中，115℃灭菌20min，冷却后3%的接种量，温度为35℃，发酵48h。测量发酵液对α-葡萄糖苷酶的抑制率。

培养温度、时间、ph、接种量对α-葡萄糖苷酶活性的影响结果参见图1－图4。米糠添加量、转速、装液量对α-葡萄糖苷酶活性的影响结果参见图5－图7。

（四）响应面法优化米糠发酵工艺

在单因素实验的基础上，选取温度、时间、ph三个因素，α-葡萄糖苷酶抑制率为相应值，结合单因素实验结果，采用box-behnken响应面法设计中心组合实验，因素与水平见表1。

表1响应面因素与水平表

培养ph与温度、培养时间与温度、培养ph与时间的交互作用的响应面图和等高线参见图8－图10。

（五）米糠发酵产物表征结构

米糠发酵产物的超微结构观察：将米糠发酵产物的冻干粉取微量固定在观察台上，采用离子溅射方法镀金，放在扫描电镜下观察分析。

米糠发酵产物的红外色谱分析

将米糠发酵产物冻干粉在80℃下烘干，在红外灯下，将微量样品和干燥的kbr粉末混匀并充分研磨后，用真空压片机压片，然后用红外光谱仪进行扫描，扫描范围为4000-400cm^-1。

数据处理：采用designexpert8.0.6软件设计响应面、数据分析及建立回归模型，运用originpro2018、进行作图。