一种高稳定性ALP测定试剂盒及其制备方法和用途与流程

本发明属于疾病检测试剂领域，涉及一种高稳定性alp测定试剂盒及其制备方法和用途。

背景技术：

碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，alp)是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶。碱性磷酸酶主要用于阻塞性黄疸、胆汁淤积性肝炎等的检查。患这些疾病时，肝细胞过度制造alp，经淋巴道和肝窦进入血液，同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍，反流入血而引起血清碱性磷酸酶明显升高。但由于骨组织中此酶亦很活跃，因此，孕妇、骨折愈合期、骨软化症、佝偻病、骨质疏松、肝脓肿、肝结核、肝硬变、白血病、甲状腺机能亢进时，血清碱性磷酸酶亦可升高，应加以鉴别。

碱性磷酸酶在临床上主要有以下几方面的应用：(1)生理性增高：儿童在生理性的骨骼发育期，碱性磷酸酶活力可比正常人高1～2倍。(2)病理性升高：骨骼疾病如佝偻病、软骨病、骨恶性肿瘤、恶性肿瘤骨转移等；肝胆疾病如肝外胆道阻塞、肝硬化、毛细胆管性肝炎等；其他疾病如甲状旁腺机能亢进。(3)病理性降低：见于重症慢性肾炎、儿童甲状腺机能不全、贫血等。

碱性磷酸酶的测定方法主要有以下几种：β-甘油磷酸钠法、磷酸苯二钠比色法以及磷酸对硝基酚连续监测法。磷酸苯二钠比色法与更早的β-甘油磷酸钠法相比具有较大的进步。磷酸苯二钠比色法水解速度快，故保温时间较短，且该法灵敏度较高，显色稳定，不需去蛋白，操作简单、快速。但与磷酸对硝基酚连续监测法相比，准确度、精密度较低，操作比较繁琐，灵敏度低；酶单位不是国际单位；受胆红素和溶血的干扰。

碱性磷酸酶是一组在碱性条件下水解磷酸单酯类化合物或者转移磷酸单酯的磷酰基至其他物质的酶，正常成人alp升高多与骨骼或者肝胆疾病等情况有关。对于碱性磷酸酶的检测，市面运用较多的是磷酸对硝基酚连续监测方式，一般会选用以磷酸对硝基苯酚(4-npp)为底物，2-氨基-2-甲基-1-丙醇(amp)为磷酸酰基的受体物质，增进酶促反应速率。4-npp在碱性溶液中为无色，在alp催化下，4-npp分裂出磷酸基团，生成游离的对硝基苯酚(4-np)，后者在碱性溶液中转变成醌式结构，呈现较深的黄色。在波长405nm处监测吸光度增高速率，计算alp活性单位。市面上alp试剂开瓶一般做到14天，偏差就会超过10％，试剂稳定性差，保存期短。

技术实现要素：

为了解决alp检测试剂开瓶后稳定性差的技术问题，本发明提供了一种高稳定性alp测定试剂盒，alp试剂开瓶后稳定性好，可做到开瓶30天，偏差不超过10％，大大延长了alp试剂的开瓶周期，提高了试剂质量，方便客户使用。

本发明还提供了一种高稳定性alp测定试剂盒的制备方法和用途。

本发明通过以下技术方案实现：

一种高稳定性alp测定试剂盒，包括试剂1和试剂2，所述试剂1的组分包括amp缓冲液、hedta、叠氮钠和第一离子制剂，所述试剂2的组分包括amp缓冲液、4-npp、叠氮钠、第二离子制剂和保护剂。

其中，所述试剂1中各组分浓度为：amp缓冲液：15ml/l～28ml/l、hedta：1.5mmol/l-12mmol/l、叠氮钠：0.01-0.1wt％、第一离子制剂：0.05-50mmol/l，ph＝10.4-10.7。

进一步的，所述试剂2中各组分浓度为：amp缓冲液：15ml/l～28ml/l、4-npp：40-60g/l、叠氮钠：0.01-0.1wt％、第二离子制剂：0.05-50mmol/l、保护剂：10-1000mmol/l，ph＝10.4-10.7。

进一步的，所述第一离子制剂包含以下物质中的任意一种或两种：

谷氨酸钠、乙二胺四乙酸二钠、酒石酸氢钾、硫酸钠、磷酸钾、硫酸锌、硫酸镁、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化铵、氯化镁、硫酸镁、硫酸锂、硫酸铵、醋酸镁和碳酸钾。

进一步的，所述第二离子制剂包含以下物质中的任意一种或两种：

谷氨酸钠、乙二胺四乙酸二钠、酒石酸氢钾、硫酸钠、磷酸钾、硫酸锌、硫酸镁、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化铵、氯化镁、硫酸镁、硫酸锂、硫酸铵、醋酸镁和碳酸钾。

进一步的，所述保护剂包含蔗糖，木糖醇，甘露醇和山梨醇中的任意一种或两种。

一种高稳定性alp测定试剂盒的制备方法，包括：

称取试剂1所需原料：amp缓冲液、hedta、叠氮钠和第一离子制剂；

将原料amp缓冲液、hedta、叠氮钠和第一离子制剂配制成溶液，并通过酸液或碱液调节ph，得到的试剂1各组分浓度为：

amp缓冲液：15ml/l～28ml/l、hedta：2mmol/l、叠氮钠：0.01wt％、第一离子制剂：0.05-50mmol/l，ph＝10.50。

所述试剂2的组分包括amp缓冲液、4-npp、叠氮钠、第二离子制剂和保护剂；

将原料amp缓冲液、4-npp、叠氮钠、第二离子制剂和保护剂配制成溶液，并通过酸液或碱液调节ph，得到的试剂1各组分浓度为：

amp缓冲液：15ml/l～28ml/l、4-npp：

40g/l、叠氮钠：0.01wt％、第二离子制剂：0.05-50mmol/l、保护剂：10-1000mmol/l，ph＝10.50。

进一步的，所述酸液为盐酸，碱液为氢氧化钠。

进一步的，所述amp缓冲液中，amp的有效浓度为100％。

一种高稳定性alp测定试剂盒在碱性磷酸酶的测定中的用途。

本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

本发明一种高稳定性alp测定试剂盒，通过控制试剂中amp缓冲液浓度，并在试剂1和2中添加离子制剂，提高试剂开瓶后的稳定性，可做到开瓶30天，偏差不超过10％，大大延长了alp试剂的开瓶周期，提高了试剂质量，方便使用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1是本发明实施例及对比例试剂盒开瓶后alp测试偏差图。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

本发明实施例提供的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：

对于碱性磷酸酶的检测，市面运用较多的是磷酸对硝基酚连续监测方式，一般会选用以磷酸对硝基苯酚(4-npp)为底物，2-氨基-2-甲基-1-丙醇(amp)为磷酸酰基的受体物质，增进酶促反应速率。市面上一般也会采用amp这个缓冲体系的方式，alp在amp缓冲液中表现出较高活性，血清alp测定反应需要在碱性条件下进行。申请人发现，alp检测试剂开封后会因吸收空气中的二氧化碳而使ph降低，影响测定结果的准确性，导致试剂开瓶后一般达到14天，偏差就会超过10％，试剂稳定性差，保存期短。

本发明中，hedt是为了控制离子浓度，试剂1中加入的第一离子制剂的离子大部分是与hedta结合；叠氮钠在一定程度上能够为试剂起到防腐的作用。

基于此，本申请提供了一种新的alp测定试剂盒，包括试剂1和试剂2，所述试剂1的组分包括amp缓冲液、hedta、叠氮钠和第一离子制剂，所述试剂2的组分包括amp缓冲液、4-npp、叠氮钠、第二离子制剂和保护剂。

其中，所述试剂1中各组分浓度为：amp缓冲液：15ml/l～28ml/l、hedta：2mmol/l、叠氮钠：0.01wt％、第一离子制剂：0.05-50mmol/l，ph＝10.50。

进一步的，所述试剂2中各组分浓度为：amp缓冲液：15ml/l～28ml/l、4-npp：40g/l、叠氮钠：0.01wt％、第二离子制剂：0.05-50mmol/l、保护剂：10-1000mmol/l，ph＝10.50。

进一步的，所述第一离子制剂包含以下物质中的任意一种或两种：

谷氨酸钠、乙二胺四乙酸二钠、酒石酸氢钾、硫酸钠、磷酸钾、硫酸锌、硫酸镁、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化铵、氯化镁、硫酸镁、硫酸锂、硫酸铵、醋酸镁和碳酸钾。

进一步的，所述第二离子制剂包含以下物质中的任意一种或两种：

谷氨酸钠、乙二胺四乙酸二钠、酒石酸氢钾、硫酸钠、磷酸钾、硫酸锌、硫酸镁、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化铵、氯化镁、硫酸镁、硫酸锂、硫酸铵、醋酸镁和碳酸钾。

进一步的，所述保护剂包含蔗糖，木糖醇，甘露醇和山梨醇中的任意一种或两种。

本发明的原理在于：

试剂1和2中都用到有amp缓冲液(15ml/l～28ml/l)，amp缓冲液浓度越高，在试剂开瓶过程中越容易吸收二氧化碳，本发明适当降低amp缓冲液浓度，有利于延缓因amp缓冲液吸收二氧化碳引起试剂ph值降低而引起测试偏低的情况。并在试剂1和2中添加离子制剂，可以和amp缓冲液协同作用，对酶起到激活作用，同时也能加快反应速度，提高反应度，这是由于锌离子是alp的结构离子，镁离子等离子是alp的激活剂，添加离子可以激活alp的，增强反应。在试剂2中添加保护剂可以保护底物4-nnp。

因此，本发明的alp检测试剂盒具有优异的稳定性，可做到开瓶30天，alp检测结果偏差不超过10％，大大延长了alp试剂的开瓶周期，提高了试剂质量，方便客户使用。

下面将结合实施例、对照例及实验数据对本申请的一种高稳定性alp测定试剂盒进行详细说明。

实施例

1.本发明设置2个实施例及5个对比例，实施例及各对比例的试剂盒组成如表1所示：

表1各对比例和实施例试剂盒成分表

2.对实施例和各对比例的试剂盒试剂的开瓶稳定性进行评价。

2.1评价实施方案如下：

实验仪器：hitachi7180/7100

实验参数：

方法：速率法温度：37℃

主波长：405nm副波长：505nm

样本量：6μlr1：240μl

r2：60μl反应方向：正向

反应时间：10min定标方式：两点定标

2.2性能评价：分别对以上对比例和实施例试剂进行如下测试：

(1)精密度：重复测定同一样本20次，计算cv(％)，cv≤3.4％算满足要求；

(2)线性范围：测定5-1000u/l范围样本，计算相关系数，r≤0.9900算满足要求；

(3)准确度：测第三方质控品，计算测定平均值与靶值的偏差，≤10％算满足要求；

(4)开瓶稳定性：将试剂开瓶放置在生化仪上，每个一天测值三次质控，计算平均值及偏差，若偏差超过10％，则不满足要求。

测试结果如表2、3所示。

表2性能评价汇总

由表2可知，对比例1-对比例5开瓶时间都无法维持到30天，且对比例1、2的准确度不满足要求，对比例4及精密度不满足要求，实施例1、2开瓶稳定性能做到30天，且各项性能均可满足要求。

具体的，各对比例和实施例的开瓶数据如表3及图1所示：

表3开瓶数据

本发明中，实施例1、2及对应的各对比例中：

对比例1：(amp在保护范围内，不加离子、不加保护剂)，没有离子和保护剂，准确度不好，开瓶不好

对照2：(amp在保护范围内，不加离子和加保护剂)没有离子准确度不好，没有离子的搭配，加入一定浓度的保护剂，也起不到稳定性的作用，因而开瓶还是不好。

对照3：(amp在保护范围内，加离子和不加保护剂)准确度可以了，没有保护剂开瓶还是不好

对照4：(amp不在保护范围内，浓度过低，加离子和加保护剂)amp作为底物，底物太少，反应度过低，稍微的波动对测纸影响比较大，精密度就不好，过少的底物不利于正常反应，开瓶效果就不好。

对照5：(amp不在保护范围内，浓度过高，加离子和加保护剂)amp浓度太高，容易吸收二氧化碳，开瓶不好

实施例1：(amp在保护范围内，选用离子和保护剂)指标满足要求。

实施例2：(amp在保护范围内，选用离子和保护剂)指标满足要求。

试剂外观：对比例1-对比例9还有实施例1和实施例2中，对比例7试剂外观r1中有絮状物沉淀，其他组试剂外观均为无色透明液体。

由表1-3可知，本发明通过调节amp缓冲液浓度，并添加离子制剂和保护剂，能够有效提高alp试剂开瓶后的稳定性，延长开瓶周期。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。