专利名称：一种亲和色谱填料及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种亲和色谱填料及其制备方法与应用，特别涉及该亲和色谱填料在分离、纯化溶菌酶方面的应用。
背景技术：
溶菌酶(lysozyme)是由129个氨基酸残基组成的碱性球蛋白，分子量为14.3KD。由于溶菌酶具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效，被广泛应用于食品、医疗及生物工程等诸多领域，因此，分离、纯化溶菌酶的研究日益受到关注。在以往溶菌酶的制备技术研究中，盐析、凝胶过滤、离子交换色谱及亲和色谱等方法均已被采用。其中亲和色谱法利用酶与其配基之间的专一亲和特性，可有效地精制目的酶，且步骤简单，因而应用亲和色谱方法纯化溶菌酶一直是研究的热点。
亲和色谱是用于生物大分子的分离与纯化的一种液相色谱模式，它是根据生物大分子与其配基间所具有的高亲和力而设计的一种高选择性的色谱分离方法。1967年Axen等人首次将具有伯氨基的分子键合到以CNBr活化的多糖基质上。此后，大量的亲和色谱填料被开发并生产出来，使亲和色谱成为了实验室中广泛应用的一种分离纯化的手段。1978年，Ohlso等人提出了高效亲和色谱的概念，以小粒径高效基质取代软胶，大大提高了亲和色谱的分离效率。
在亲和色谱中，首先须将配基以共价键连接于不溶性载体相上，得到具有固定化配基的亲和色谱填料。将这种亲和色谱填料填充成亲和色谱柱。若将含有目标蛋白质的混合物加到柱上，则只有能与固定化配基表现出明显亲和作用的蛋白质被保留；其他不能识别固定化配基的组分则不受阻碍地流过色谱柱床。然后，改变溶剂的组成便可将目标蛋白质从固定化配基上解离和洗脱下来。
与其他经典的蛋白质分离方法比较，亲和色谱有许多突出的优点亲和色谱几乎可应用于任何两种有特异性相互作用的生物分子的分离；亲和色谱是选择性最高的色谱模式，在许多场合下，亲和色谱是纯化倍数最高的操作，可大大减少操作所需时间、步骤和成本；操作条件温和，有利于稳定蛋白质的结构和活性，提高蛋白质的活性回收率；适于分离复杂生物体系中低浓度的蛋白质组份。
对于亲和色谱而言，选择合适的亲和配基是最重要的一环。高效亲和色谱的配基可分为两大类非专一性亲和配基和生物专一性相互作用配基。非专一性配基如染料、类染料、固定化和氨基酸类似物等。它们的特点在于便宜易得，容易键合且键合量大，易于大规模生产，缺点是专一性差，选择性较低。专一性配基主要是利用抗原—抗体、酶—底物、酶—抑制剂等的生物专一性作用。它们往往有高的选择性，但其成本高，来源困难。在亲和色谱中配基必须具备以下条件在一定条件下，能和欲分离的生物大分子进行专一性结合，所形成复合物的解离常数一般在10-4-10-8mol/L之间；配基和生物大分子结合后，在一定条件下又能解离，而且解离后不能破坏生物大分子的生物活性；配基上必须含有可被利用的官能团，以便用适宜的化学方法将其偶联到固相载体上，且偶联后不应影响配基和欲分离生物大分子的专一性结合。
发明内容
本发明的目的是提供一种亲和色谱填料。
本发明所提供的亲和色谱填料，由固相载体和与其连接的配基组成，其中，所述配基为卡那霉素。
卡那霉素为一种广泛应用的氨基糖苷类抗生素，利用其分子上的氨基，可通过很多方法，如溴化氰法、N-羟基琥珀酰亚胺酯法及羰基二咪唑活化法等，将其键合至各种载体上，例如，键合于球形、无定型、薄膜或纤维状的硅胶，可控孔径玻璃，合成高分子微球，天然高分子凝胶(琼脂糖、葡聚糖等)或纤维素上，便可制备出亲和色谱填料并据以制备出相应的亲和色谱柱。
由本发明的亲和色谱填料制备的亲和色谱柱也属于本发明的保护范围。
本发明的另一个目的是提供一种制备上述亲和色谱填料的方法。
本发明所提供的制备上述亲和色谱填料的方法，是以重量份数比为2∶1至15∶1的固相载体和卡那霉素为原料，利用卡那霉素的氨基将其键合至固相载体上，得到亲和色谱填料。
所述制备亲和色谱填料的方法，具体可包括以下步骤(1)对固相载体进行预处理；(2)取2至15重量份的经过预处理的固相载体，200℃油浴下抽真空，冷却后加入40-750重量份的含有质量百分含量为2-10％的3-环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷的甲苯溶液，回流2-8h，甲醇洗涤后，以甲醇为溶剂索氏提取2-12h，得到键合了环氧基团的固相载体；(3)在键合了环氧基团的固相载体中，加入含有一重量份的卡那霉素的磷酸钾缓冲液，30-80℃下反应12-56h，得到亲和色谱填料。
其中，步骤(3)中所述磷酸钾缓冲液的浓度为0.5-3mol/L，pH值为7至8。
所述方法中，还包括如下后处理的步骤键合了环氧基团的固相载体与卡那霉素在30-80℃下反应12-56h后，过滤，洗涤，抽干，加入10-300重量份的pH值为7至8的2mol/L Tris-HCl缓冲液，室温下反应1.5-5h，过滤，用水洗涤，最后用甲醇洗涤，真空下烘干。
步骤(1)中的预处理可按如下方法进行在2至15重量份的固相载体中，加入100-1500重量份的质量百分浓度为5-15％的HCl溶液，浸泡5-20h后回流2-8h，去除Cl-，干燥。
由本发明的亲和色谱填料制备的亲和色谱柱可以从复杂的体系中，例如，从新鲜蛋清中专一性地将溶菌酶分离出来，SDS-PAGE分析证明其纯度可达90％以上。固定化的卡那霉素与溶菌酶的相互作用的解离常数可达3.52×10-5mol/L。这种新的亲和色谱填料与已有的亲和色谱填料，例如使用金属离子、染料以及糖类分子等为配基的填料相比，具有专一作用力强、安全性高、原料易得、价格低廉的特点。可用于从各种物料和体系中将其中所含的溶菌酶加以分离、纯化，也可将其用于溶菌酶的分析与测定。
图1A为过空白柱的溶菌酶的色谱1B为过本发明的亲和柱的溶菌酶的色谱2为pH条件对亲和色谱分离的影响图3为不同蛋白质在亲和柱上保留行为的比较图4为利用前沿色谱法测定固定化卡那霉素与溶菌酶复合物的解离常数图5为方法重现性实验图6为新鲜鸡蛋清在卡那霉素固定化的亲和柱上的亲和色谱7为SDS-PAGE分析结果图8为图7中2、3、4泳道谱带的激光密度扫描9为溶菌酶的活性分析具体实施方式
下述实施例中的方法如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、以硅胶为载体、卡那霉素为配基的亲和色谱填料及亲和色谱柱的制备1、以硅胶为载体、卡那霉素为配基的亲和色谱填料的制备取粒径为5μm、孔径300的硅胶1.5g，置于圆底烧瓶中，加入100mL 10％HCl溶液，浸泡18h后在120℃回流8h，以二次去离子水洗至无Cl-(洗涤液滴加AgNO3至无浑浊)，120℃烘干。于100mL圆底烧瓶中加入1.5g预处理过的硅胶，200℃油浴下抽真空，并维持3h。冷却后加入50mL 5％的3-环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷(GPS)甲苯溶液，120℃回流8h，热甲醇洗涤3次后，以甲醇为溶剂索氏提取12h，室温下真空干燥。取1.5g键合了环氧基团的硅胶置于25mL圆底烧瓶中，将0.2g卡那霉素溶于10mL磷酸钾缓冲液(2mol/L，pH7.9)后，加入圆底烧瓶中，60℃下摇床反应48h。反应物过滤，以大量水洗涤，抽干。加入30mL 2mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.9)，室温下振荡反应3h，过滤，用大量水洗涤，最后用甲醇洗涤2次，真空下烘干备用。得到以硅胶为载体、以卡那霉素为配基的亲和色谱填料。
2、以硅胶为载体、不接配基的空白色谱填料的制备取粒径为5μm、孔径300的硅胶1.5g，置于圆底烧瓶中，加入100mL10％HCl溶液，浸泡18h后在120℃回流8h，以二次去离子水洗至无Cl-(洗涤液滴加AgNOc至无浑浊)，120℃烘干。于100mL圆底烧瓶中加入1.5g预处理过的硅胶，200℃油浴下抽真空，并维持3h。冷却后加入50mL 5％的3-环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷(GPS)甲苯溶液，回流8h，热甲醇洗涤3次后，以甲醇为溶剂索氏提取12h，室温下真空干燥。取1.5g键合了环氧基团的硅胶置于25mL圆底烧瓶中，加入10mL磷酸钾缓冲液(2mol/L，pH7.9)于圆底烧瓶中，60℃下摇床反应48h。反应物过滤，以大量水洗涤，抽干。加入30mL 2mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.9)，室温下振荡反应3h，过滤，用大量水洗涤，最后用甲醇洗涤2次，真空下烘干备用。得到以硅胶为载体、不接卡那霉素配基的空白色谱填料。
3、匀浆法装柱取4×70mm的不锈钢柱管洗净备用。1g以硅胶为载体、以卡那霉素为配基的亲和色谱填料，悬浮于充填缓冲液中，在15Mpa压力下以匀浆法装柱，制备出亲和色谱柱。以同样方法制备出空白亲和色谱柱。
实施例2、分离溶菌酶1、溶菌酶在空白柱和亲和柱上的色谱保留行为将亲和色谱柱或空白柱连接于高效液相色谱仪上，样品为溶菌酶。流动相A液为50mM磷酸钾缓冲液+100mM NaCl(pH 7.0)，B液为50mM磷酸钾缓冲液+500mM NaCl(pH 7.0)。流速0.5mL/min；梯度条件0-15min A液，15-30min B液，30-45minA液；检测波长280nm。比较了以硅胶为载体、以卡那霉素为配基的亲和色谱柱及未键合配基的空白柱与溶菌酶的亲和作用。结果如图1所示，表明溶菌酶在空白柱上没有保留，而在亲和柱上可保留且在换为B液时重新被洗脱下来，说明键合卡那霉素配基的亲和柱与溶菌酶有专一性作用。
2、pH条件对亲和色谱分离的影响pH对于溶菌酶与固定化卡那霉素的相互作用有很大的影响，实验了不同pH条件下亲和色谱分离效果的影响，其色谱条件同步骤1。结果如图2所示，表明pH为7.0时溶菌酶的吸附量为最大，强酸或强碱条件下均不利于溶菌酶与固定化配基的相互作用，所以最佳pH选择为pH 7.0，当pH为7.0时，洗脱峰型好，积分面积最大；且硅胶适用于在偏酸性条件下应用，溶菌酶活性在7.0时最高。
3、不同蛋白质在亲和柱上的保留行为将溶菌酶(LZM)、鸡卵清白蛋白(CEA)、鸡免疫球蛋白(CIgG)、人血清白蛋白(HSA)、血红蛋白(hemoglobin)、转铁蛋白(Transferrin)、Y-球蛋白(Y-globin)、肌球蛋白(Myoglobin)、胃蛋白酶(Pepsin)、胰蛋白酶(Trypsin)和核糖核酸酶(RNase A)等蛋白质分别进样到卡那霉素亲和柱上并在相同的洗脱条件下洗脱，观察其亲和色谱行为。其中，蛋白浓度为1.0mg/mL，进样量为50μL，其他色谱条件同步骤1。结果如图3所示，表明以卡那霉素为配基的亲和柱对除溶菌酶以外的所有蛋白质均没有特异和非特异性吸附，这对于从复杂的实际样品中分离纯化溶菌酶十分有利。
4、利用前沿色谱法测定固定化卡那霉素与溶菌酶复合物的解离常数将亲和色谱柱连接于高效液相色谱仪上，样品为溶菌酶，浓度如下a.4.31×10-6mol/l；b.8.62×10-6mol/l；c.1.72×10-5mol/l；d.2.58×10-5mol/l。流动相为50mM磷酸钾缓冲液+100mM NaCl(pH 7.0)，洗脱液为50mM磷酸钾缓冲液+500mM NaCl(pH 7.0)，流速0.5mL/min，死体积约为3min。以前沿色谱法测定固定化卡那霉素与溶菌酶的亲和常数(图4)。若以解离常数KD表示，KD＝3.52×10-5mol/L。由解离常数可知，固定化配基与溶菌酶具有较强的亲和相互作用。通常亲和色谱的固定化配基与其互补生物大分子之间适宜的解离常数一般在10-4～10-8mol/L，而实验测得的解离常数恰好处于这一范围中间。图4中的插图1/(V-V0)对[P0](溶菌酶的相应进样浓度)作图，线性回归方程与相关系数也列于插图中。
5、方法重复性实验在同一根高效亲和色谱柱上连续进样溶菌酶，色谱条件同步骤1，第一针进样平衡液(50mM磷酸钾缓冲液+100mM NaCl(pH 7.0))50μL，其余进样均为溶菌酶(浓度1mg/mL)50μL，考察该方法的重现性，结果如图5所示，表明重复进样的洗脱峰面积的相对标准偏差为1.6％(n＝7)，说明本方法具有良好的重现性。
6、利用高效亲和柱从新鲜蛋清中分离溶菌酶实验前取新鲜鸡蛋清5mL，用平衡液(50mM磷酸钾缓冲液+100mM NaCl(pH 7.0))稀释两倍后，0.45μm的滤膜过滤，准确吸取50μL滤液直接进样。色谱条件如下流动相A液为50mM磷酸钾缓冲液+100mM NaCl(pH 7.0)，B液为50mM磷酸钾缓冲液+1M NaCl(pH 7.0)；流速0.5mL/min；梯度条件0-35min A液，35-60min 10％B液，60-80min B液，80-90min A液；其他条件同步骤1。结果如图6所示，0-35minA液和35-60min 10％B液，将杂蛋白洗脱，而特异性吸附的溶菌酶用50mM磷酸钾缓冲液+1.0M NaCl(pH 7.0)的洗脱液洗脱，再用平衡液(A液)淋洗色谱柱以恢复至最初的基线，然后可进行下一次进样。
7、亲和色谱纯化的溶菌酶的表征收集步骤6中溶菌酶洗脱峰的中心部分的组分，透析脱盐后冻干浓缩，应用BIO-RAD电泳系统(Richmond，CA，USA)对溶菌酶的纯度进行表征，在二巯基苏糖醇(DTT)降解条件下于含量为12％的凝胶上以SDS-PAGE分析所收集的亲和色谱分离的组分，并应用考马斯亮蓝R-250染色凝胶，进行SDS-PAGE分析(图7)。结果如图7所示，得到单一条带，表明通过卡那霉素亲和色谱洗脱后所得的溶菌酶组分有较高的纯度。图7中，泳道1.蛋白质分子量标准；2.标准品溶菌酶；3.鸡蛋清；4.经亲和柱分离纯化鸡蛋清得到的溶菌酶。应用Shimadzu双波长密度扫描仪(Shimadzu，Tokyo，Japan)完成图7中凝胶上第2、3、4泳道蛋白带的定量。结果表明蛋白纯度为93％(图8)。这一结果说明，经卡那霉素亲和柱可实现一步纯化分离溶菌酶，在选择的实验条件下，蛋清中其他蛋白对于卡那霉素亲和柱的非特异性吸附是可以忽略的。
8、溶菌酶的抑菌活性实验将溶壁微球菌Micrococcus lysodeikticus(购自中国科学院微生物研究所，菌种编号11634)的菌种在培养基中活化，传代两次后离心收集，然后用pH6.2的磷酸钠缓冲溶液配制成一定吸光度的溶液后，迅速加入一定量的溶菌酶酶液，以U-3010光度计(Hitachi，Japan)在405nm波长下监测吸光度变化，溶菌酶对溶壁微球菌的降解作用将导致光密度的降低，降低值可以反映溶菌酶的活性。结果如图9所示，可计算出经亲和柱分离纯化鸡蛋清得到的溶菌酶与标准品溶菌酶的抑菌活性分别为71326U/mg和72450U/mg。上述实验结果表明经卡那霉素亲和柱纯化分离得到的溶菌酶保持了良好的活性。图9中，a.不加溶菌酶；b.经亲和柱分离纯化鸡蛋清得到的溶菌酶抑菌活性；c.标准品溶菌酶抑菌活性。
权利要求
1.亲和色谱填料，由固相载体和与其连接的配基组成，其特征在于所述配基为卡那霉素。
2.根据权利要求1所述的亲和色谱填料，其特征在于所述固相载体包括硅胶，可控孔径玻璃，高分子微球，天然高分子凝胶和纤维素。
3.一种制备权利要求1或2所述亲和色谱填料的方法，是以重量份数比为2∶1至15∶1的固相载体和卡那霉素为原料，利用卡那霉素的氨基将其键合至固相载体上，得到亲和色谱填料。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述固相载体包括硅胶，可控孔径玻璃，高分子微球，天然高分子凝胶和纤维素。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述制备亲和色谱填料的方法具体包括以下步骤(1)对固相载体进行预处理；(2)取2至15重量份的经过预处理的固相载体，200℃油浴下抽真空，冷却后加入40-750重量份的含有质量百分含量为2-10％的3-环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷的甲苯溶液，回流2-8h，甲醇洗涤后，以甲醇为溶剂索氏提取2-12h，得到键合了环氧基团的固相载体；(3)在键合了环氧基团的固相载体中，加入含有一重量份的卡那霉素的磷酸钾缓冲液，30-80℃下反应12-56h，得到亲和色谱填料。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤(3)中所述磷酸钾缓冲液的浓度为0.5-3mol/L，pH值为7至8。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于所述方法中，还包括如下后处理的步骤键合了环氧基团的固相载体与卡那霉素在30-80℃下反应12-56h后，过滤，洗涤，抽干，加入10-300重量份的pH值为7至8的2mol/L Tris-HCl缓冲液，室温下反应1.5-5h，过滤，用水洗涤，最后用甲醇洗涤，真空下烘干；步骤(1)中的预处理可按如下方法进行在2至15重量份的固相载体中，加入100-1500重量份的质量百分浓度为5-15％的HCl溶液，浸泡5-20h后回流2-8h，去除Cl-，干燥。
8.由权利要求1或2所述亲和色谱填料制备的亲和色谱柱。
9.权利要求1或2所述亲和色谱填料在分离、纯化、分析和鉴定溶菌酶中的应用。
10.权利要求8所述亲和色谱柱在分离、纯化、分析和鉴定溶菌酶中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种亲和色谱填料及其制备方法与应用。本发明所提供的亲和色谱填料，由固相载体和与其连接的配基组成，其中，所述配基为卡那霉素。该亲和色谱填料的制备方法，是以重量份数比为2∶1至15∶1的固相载体和卡那霉素为原料，利用卡那霉素的氨基将其键合至固相载体上，得到亲和色谱填料。该亲和色谱填料可用于从各种物料和体系中将其中所含的溶菌酶加以分离、纯化，也可将其用于溶菌酶的分析与测定。
文档编号G01N30/80GK1811410SQ20051000287
公开日2006年8月2日 申请日期2005年1月27日 优先权日2005年1月27日
发明者刘阳, 李克安, 刘锋 申请人:北京大学