本发明属于生物检测技术领域，涉及一种稳定性好的n-乙酰-β-d-氨基葡萄糖苷酶检测试剂盒、制备方法及用途
背景技术：
n-乙酰-β-d-氨基葡萄糖苷酶(简称nag)是一种位于溶酶体内的酸性水解酶，又称尿酶，相对分子量约为140000。广泛分布于人体各组织中，但在前列腺和肾脏近端肾小管中含量最高。nag分子量约为130～140kd，在正常情况下，血清中nag不能通过肾小球滤过从尿中排泄。尿中nag的升高是肾脏疾病的早期表现，是肾小管损害的敏感指标。肾移植患者，尿nag测定可早期发现排斥反应，一般在临床指征前1-3天即有尿nag增高。80年代后期在糖尿病肾病领域的应用研究不断增加，其中值得注意的是糖尿病肾病早期尿nag的升高可早于malb的增加，这提示糖尿病肾小管损伤可早于肾小球损害。目前已形成一个新观点，即主张把malb和肾小管标记蛋白(nag等)作为早期发现和监控糖尿病合并症的常规指征。另外，尿nag的监测在多种肾实质疾患中有不同程度的升高，是肾脏损害的较敏感指征，增高见于急慢性肾炎，休克引起的肾功能衰竭、肾病综合症、中毒性肾病等。研究表明，糖尿病、高血压肾小球早期损伤、药物肾毒性以及感染休克、肾移植排异反应等造成的肾小管损害时，尿中nag的活性显著增高，且早于其它尿酶，因此对肾小管损害的早期诊断有较大价值。
目前，nag测定是应用率最高的尿液酶学诊断项目，其对肾小管损伤的反应很灵敏，此外，用尿液作为标本，是一种无创伤检查，适合于日常检验和连续动态分析，也便于人群筛查的应用。nag在临床应用中的测定方法主要包括放免分析法、荧光分析法和紫外-可见分光光度法等，其中，分光光度法以合成色原底物为方法学主流。在nag的作用下，底物发生分解，通过测定底物的分解产物在特定波长下的吸光度来判断nag的浓度。市面上一般会采用5-[4-(3-甲氧基-苯甲烯-绕丹宁)]-3-乙酸铵-n-乙酰氨基-β-d-葡萄糖苷这个底物，但目前运用这个底物配制的试剂普遍存在着稳定性欠佳、分析灵敏度低等缺点。
技术实现要素：
为了解决现有nag检测试剂稳定性欠佳、灵敏度低的技术问题，本发明提供了一种稳定性好的n-乙酰-β-d-氨基葡萄糖苷酶检测试剂盒，选择以6-甲基-2-硫代吡啶-n-乙酰-β-d-葡萄糖苷为底物，配以合适的反应体系、缓冲液和ph值，可以让底物更加稳定、抗干扰能力更好、灵敏度更高。
本发明还提供了一种稳定性好的n-乙酰-β-d-氨基葡萄糖苷酶检测试剂盒的制备方法及用途。
本发明通过以下技术方案实现：
一种稳定性好的n-乙酰-β-d-氨基葡萄糖苷酶检测试剂盒，包括试剂1和试剂2，所述试剂1包括柠檬酸、乙酸钠、离子制剂、抗坏血酸氧化酶和pc-300；所述试剂2包括tirs、稳定剂、亚铁氰化钾、表面活性剂、mpt-nag、pc-300和脂蛋白酯酶。
其中，所述试剂1中，各成分浓度为：
柠檬酸：30-120moml/l、乙酸钠：50-150moml/l、离子制剂：0.5-20moml/l、抗坏血酸氧化酶：1-10ku/l、pc-300：1-5ml/l，ph＝4.80-5.20。
进一步的，所述试剂2中，各成分浓度为：
tirs：50-200moml/l、稳定剂：10-100g/l、亚铁氰化钾：0.05-1.5g/l、表面活性剂：0.5-5g/l、mpt-nag：45-150moml/l、pc-300：1-5ml/l、脂蛋白酯酶：1-10ku/l，ph＝7.4-7.9。
优选的，所述试剂1中，各成分浓度为：
柠檬酸：30moml/l、乙酸钠：50moml/l、离子制剂：1.0moml/l、抗坏血酸氧化酶：5ku/l、pc-300：1ml/l，ph＝4.80；
所述试剂2中，各成分浓度为：
tirs：50moml/l、稳定剂：10g/l、亚铁氰化钾：0.1g/l、表面活性剂：1g/l、mpt-nag：50moml/l、pc-300：1ml/l、脂蛋白酯酶：3ku/l，ph＝7.4。
进一步的，所述离子制剂包括氯化钠、氯化钾、硫酸钾、硫酸钠、氯化镁和硫酸镁中的任意一种或多种。
进一步的，所述表面活性剂包括tritox-405、emulgena60、triton-100和genapolx-080中的任意一种。
进一步的，所述稳定剂包括甘油，乙二醇，peg6000，peg8000和peg20000中的任意一种。
一种稳定性好的n-乙酰-β-d-氨基葡萄糖苷酶检测试剂盒的制备方法，包括：
将试剂1的原料柠檬酸、乙酸钠、离子制剂、抗坏血酸氧化酶和pc-300配制成溶液，并采用酸液活碱液调节ph值至4.80-5.20，得到的试剂1各成分浓度为：
柠檬酸：30-120moml/l、乙酸钠：50-150moml/l、离子制剂：0.5-20moml/l、抗坏血酸氧化酶：1-10ku/l、pc-300：1-5ml/l；
将试剂2的原料tirs、稳定剂、亚铁氰化钾、表面活性剂、mpt-nag、pc-300和脂蛋白酯酶配制成溶液，并采用酸液活碱液调节ph值至7.4-7.9，得到的试剂2各成分浓度：
tirs：50-200moml/l、稳定剂：10-100g/l、亚铁氰化钾：0.05-1.5g/l、表面活性剂：0.5-5g/l、mpt-nag：45-150moml/l、pc-300：1-5ml/l、脂蛋白酯酶：1-10ku/l。
进一步的，所述酸液为盐酸，所述碱液为naoh溶液。
一种稳定性好的n-乙酰-β-d-氨基葡萄糖苷酶检测试剂盒在n-乙酰-β-d-氨基葡萄糖苷酶检测中的用途。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明一种稳定性好的n-乙酰-β-d-氨基葡萄糖苷酶检测试剂盒，本发明的试剂盒通过添加抗坏血酸氧化酶、亚铁氰化钾、脂蛋白酯酶，可有效抗干扰，添加稳定剂增强试剂的稳定性，延长试剂的保质期，添加离子制剂和表面活性剂可以加快试剂反应，得到的试剂盒可以让底物更加稳定、抗干扰能力更好、灵敏度更高。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
本发明实施例提供的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
本发明采用了6-甲基-2-硫代吡啶-n-乙酰-β-d-葡萄糖苷(mpt)底物法检测人体血清或尿液中n-乙酰-β-d-氨基葡萄糖苷酶的活性，试剂长期稳定、灵敏度高、方便检测。然而现有mpt-nag检测试剂热破后抗干扰能力下降，本发明旨在解决试剂在热破后仍然能保持良好的抗干扰能力。
基于此，本发明将底物mpt-nag放入试剂2中，选择合适的反应体系、缓冲液和ph值，可以让底物更加稳定、抗干扰能力更好、灵敏度更高。
具体的，本发明一种稳定性好的n-乙酰-β-d-氨基葡萄糖苷酶检测试剂盒，包括试剂1和试剂2，所述试剂1包括柠檬酸、乙酸钠、离子制剂、抗坏血酸氧化酶和pc-300；所述试剂2包括tirs、稳定剂、亚铁氰化钾、表面活性剂、mpt-nag、pc-300和脂蛋白酯酶。
其中，所述试剂1中，各成分浓度为：
柠檬酸：30-120moml/l、乙酸钠：50-150moml/l、离子制剂：0.5-20moml/l、抗坏血酸氧化酶：1-10ku/l、pc-300：1-5ml/l，ph＝4.80-5.20。
进一步的，所述试剂2中，各成分浓度为：
tirs：50-200moml/l、稳定剂：10-100g/l、亚铁氰化钾：0.05-1.5g/l、表面活性剂：0.5-5g/l、mpt-nag：45-150moml/l、pc-300：1-5ml/l、脂蛋白酯酶：1-10ku/l，ph＝7.4-7.9。
所述离子制剂包括氯化钠、氯化钾、硫酸钾、硫酸钠、氯化镁和硫酸镁中的任意一种或多种。所述表面活性剂包括tritox-405、emulgena60、triton-100和genapolx-080中的任意一种。所述稳定剂包括甘油，乙二醇，peg6000，peg8000和peg20000中的任意一种。
本发明采用mpt-nag检测法，样本中n-乙酰-β-d-氨基葡萄糖苷酶(nag)催化底物6-甲基-2-硫代吡啶-n-乙酰-β-d-葡萄糖苷(mpt-nag)，水解生成6-甲基-2-硫代吡啶(mpt)，mpt在特定波长处的吸光度上升速率与nag活性呈正相关。
本发明中，抗坏血酸氧化酶必须加入到试剂1中，当试剂1和血清孵育时，可以在试剂2未加入之前，有效清除血清中的维生素c的干扰。
亚铁氰化钾必须加入到试剂2中，亚铁氰化钾不能和aso酶共存，加入到试剂2中可以有效清除血清中胆红素对试剂测值的干扰。
离子制剂可以有效激活试剂中的酶以及底物，加快试剂反应。
表面活性剂：tritox-405、emulgena60、triton-100、genapolx-080，能和稳定剂一起作用，让底物溶解彻底，加快试剂反应。
稳定剂(甘油，乙二醇，peg6000，peg8000，peg20000)，能和表面活性剂一起作用，让底物溶解彻底，加快试剂反应，也能让底物在试剂中更加稳定，延长试剂的保质期。底物6-甲基-2-硫代吡啶-n-乙酰-β-d-葡萄糖苷需放置在试剂2中试剂才更稳定。
试剂中加入脂蛋白酯酶，可以消除甘油三酯的干扰。
本发明的试剂盒通过添加抗坏血酸氧化酶、亚铁氰化钾、脂蛋白酯酶，可有效抗干扰，添加稳定剂增强试剂的稳定性，延长试剂的保质期，添加离子制剂和表面活性剂可以加快试剂反应，得到的试剂盒可以让底物更加稳定、抗干扰能力更好、从而灵敏度更高。
下面将结合实施例、对比例及实验数据对本申请一种稳定性好的n-乙酰-β-d-氨基葡萄糖苷酶检测试剂盒进行详细说明。
实施例
本发明设置6个对比例和1个实施例。
对比例1：传统的用5-[4-(3-甲氧基-苯甲烯-绕丹宁)]-3-乙酸铵-n-乙酰氨基-β-d-葡萄糖苷为底物的试剂盒，参照对比文件cn105203533b配置试剂；
对比例2：底物mpt-nag放在r1中。
对比例3：缺少乙二醇；
对比例4：缺少tritox-405；
对比例5：r2的ph为8.5；
对比例6：r2的ph为6.5。
1.对比例和实施例试剂盒的成分如表1所示：
表1各对比例和实施例试剂盒的成分表
2.性能评价：分别对以上对比例和实施例进行如下测试：
(1)精密度：重复测定同一样本20次，计算cv(％)，cv≤3.4％算满足要求；
(2)线性范围：测定5-1000u/l范围样本，计算相关系数，r≤0.9900算满足要求；
(3)准确度：测第三方质控品，计算测定平均值与靶值的偏差，≤10％算满足要求；
(4)功能灵敏度：测定nag浓度为1u/l、2.5u/l、5u/l、10u/l的低浓度样本，每个样本测定10次，计算均值、标准差、偏差、变异系数，cv小于10％且偏差小于10％能满足使用需求。
(5)稳定性：将试剂在37度放置7天，再评价以上指标：精密度、线性范围、准确度、功能灵敏度；
(6)干扰评价：
用纯化水稀释干扰物质，按照1：9的比例分别添加到空白对照血清中(空白对照血清为正常人混合血清，不加入任何干扰物质，其值在医学决定水平附近)，使得加入血清后的最终浓度满足为要评价的浓度，再用对比例和实施例组，分别测定空白血清和加入不同浓度干扰物质的血清，每份样本测定3次，计算均值，与空白对照血清测值计算偏差，即为干扰度。若干扰度小于10％，则为抗干扰，否则为不抗干扰。
血清中的一般干扰物质及浓度为：抗坏血酸1.0g/l、胆红素0.5g/l、甘油三酯≤10g/l。
测试结果如表2、3所示：
表2抗干扰数据
表3性能评估数据汇总
表4灵敏度数据汇总
试剂热破7天后：
本发明实施例1、2热破前后的灵敏度数据汇总
从上述实验结果可知，各对比例和实施例的试剂抗干扰能力在热破前都是差不多的，但是热破后只有比照组4(对比例4热破后)和实施例1、2抗干扰能力没有受到影响。比照组3热破前后，因稳定性不好导致热破后试剂准确度很差，但是比照组4的精密度不好，分析灵敏度热破前后都没有实施例1、2好。比照组5和比照组6热破后抗干扰能力下降，热破后线性和灵敏度都受到了影响。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。