一种硒砂瓜生物防治菌株的筛选方法与流程

本发明涉及生物防治技术领域，具体涉及一种硒砂瓜生物防治菌株的筛选方法。

背景技术：

硒砂瓜是大宗水果，宁夏有近100万亩压砂地，是宁夏中卫市的主要经济作物，由于长期连作，各种病害普遍发生，其中危害最严重的是硒砂瓜枯萎病，病原菌为尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)，从根部侵入硒砂瓜体内，在维管束组织内繁殖并向枝蔓扩散，在整个植株体内均可分离出病原菌，菌丝堵塞维管束以及产生真菌毒素使整个硒砂瓜植株枯萎。由于土壤对化学药剂的吸附作用，一般的化学防治效果均不理想，研究人员从宁夏硒砂瓜枯死病株上分离获得的尖孢镰刀菌，致病力非常强，只要菌丝碰到硒砂瓜根就能侵入硒砂瓜根部，并引发枯萎病，宁夏甘肃等地的压砂瓜连作障碍的防治是公认世界性难题，主要表现在以下两个方面。

一是实践证明化学农药不能防治硒砂瓜枯萎病。瓜农用了农资市场上能够买到的商品杀菌剂，但无法解决解决硒砂瓜枯萎病死秧问题。

二是传统的生物防治菌剂亦难有效防控硒砂瓜枯萎病。传统的方法是采用对峙方法来筛选具有拮抗作用的菌株，具体做法是在微生物培养基上接种病原微生物，同时接种待测的菌株，两者间隔1-3厘米，经过几天培养后，如果病原菌菌落与待测菌株菌落之间始终不能接触，而病原菌菌落在其它方向的生长半径超过病原菌与待测菌株之间的距离，则表明该待测菌株具有拮抗(抑制)病原菌的能力。一般情况下都会选择拮抗能力强的菌株作为生物防治用。

理论上采用拮抗菌株作为生防菌株，但在实际应用中，具有拮抗能力的微生物能够杀死或抑制病原菌，是拮抗效果发生在微生物培养基上，培养基上能够拮抗病原菌，但在植物体上或植物体内却很难拮抗或抑制病原菌，主要原因包括有：1、植物提供的营养条件与培养基提供的营养条件相差极大，拮抗菌和病原菌的生长速度与培养基上不同；2、植物与微生物的相互作用极为复杂，微生物及其代谢产物可能会加强或削弱植物的免疫能力。有些微生物虽然不能拮抗病原菌，但也有可能刺激植物对某些病原菌产生免疫从而达到防病的效果。由此可见，培养基上出现的拮抗性与生防效果之间没有必然联系。

技术实现要素：

为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种硒砂瓜生物防治菌株的筛选方法，该筛选方法操作简单，不依赖传统的拮抗指标作为筛选依据，以活的硒砂瓜植株作为平台，通过“生防菌株-硒砂瓜植株-枯萎病菌”三者之间的相互作用，直接观察硒砂瓜是否发病，获得能够保护硒砂瓜不受枯萎病侵染的生防菌株，防病效果佳。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种硒砂瓜生物防治菌株的筛选方法，包括如下步骤：

s1：用pda培养基平板培养致病菌，得到致病菌培养物，备用；

s2：利用种植硒砂瓜的土壤制作土壤浸出培养基，然后将土壤浸出培养基灭菌处理，再放入培养皿中，将培养皿摆成斜面，使得土壤浸出培养基凝固后形成斜面培养基；

s3：将硒砂瓜种子用进行消毒，然后用无菌水漂洗种子；再将消毒后的硒砂瓜种子用无菌的湿纱布包裹，恒温催芽；

s4：将步骤s3发芽后的硒砂瓜种子放置于步骤s2的土壤浸出培养基表面，然后将待测生防菌株滴加到发芽种子的根部，恒温培养；

s5：将步骤s1制得的致病菌培养物打孔，并放置于步骤s4的硒砂瓜种子根部附近，并设置没有放置待测生防菌株的土壤浸出培养基作为阳性对照组，设置没有放置待测生防菌株、没有接种致病菌培养物的土壤浸出培养基作为阴性对照组，然后将上述土壤浸出培养基根部遮光，恒温培养；

s6：培养结束后，阳性对照组出现致病症状后，检查硒砂瓜种子，若硒砂瓜种子保持健康，则硒砂瓜种子对该致病菌具有防病作用。

本发明硒砂瓜生物防治菌株的筛选方法操作简单，不依赖传统的拮抗指标作为筛选依据，以活的硒砂瓜植株作为平台，通过“生防菌株-硒砂瓜植株-枯萎病菌”三者之间的相互作用，直接观察硒砂瓜是否发病，获得能够保护硒砂瓜不受枯萎病侵染的生防菌株，防病效果佳。

其中，以植物作为关键筛选平台，不同于传统的平板对峙法以微生物培养基为平台；而且，以完整的活体植物作为关键材料，并在植物培养箱中进行培养，不同于离体组织，如剪下的叶片或剪下的根，处于不断生长的完整植物与离体的植物组织的免疫反应是不一样的，因而本发明采用活体植物种子作为筛选平台，更能反映真实的生防效果，准确筛选出能应用于农作生产的菌株。

其中，所述硒砂瓜种子可选自金城5号硒砂瓜种子。

其中，步骤s4中，硒砂瓜种子发芽至胚根长约1.5-2cm，则将发芽后的硒砂瓜种子放置于土壤浸出培养基表面，每个培养基表面放置5-6棵；而步骤s5中，致病菌培养物用无菌的打孔器制成含菌丝的小圆碟片，再用无菌镊子将含菌丝碟片放在距离硒砂瓜种子根部5mm处，如附图1所示。

其中，步骤s5中，阳性对照组为不放置待测生防菌株的土壤浸出培养基，只接种致病菌培养物；阴性对照组为没有放置待测生防菌株、没有接种致病菌培养物的土壤浸出培养基；而本发明的实验组则为放置待测生防菌株并接种致病菌培养物的土壤浸出培养基。

更为优选的，上述生物防治菌株的筛选方法可以适用于各类植物病害生防菌株的筛选，不局限于西瓜枯萎病。

优选的，所述步骤s2中，土壤浸出培养基的制备包括如下步骤：

取180-220g的硒砂瓜种植土壤，加500-1000ml的纯净水，搅拌15-30min，静置50-70min，将上清液倒入干净的烧杯，加0.3-0.8g蔗糖和0.05-0.15g酵母浸粉，搅拌均匀，定容到1000ml，最后加8g/l的琼脂，搅拌均匀，制得土壤浸出培养基。

本发明通过上述步骤制备土壤浸出培养基，使得营养成分与土壤环境相似，来培养微生物，使得筛选出的生防菌株能在田间土壤种子中发挥生防作用。但传统在微生物培养基上获得的菌株，在土壤条件下不一定能够生长，因此很难发挥生防作用，这也是传统的方法筛选出来的菌株很少能够用于生产实际的原因之一。

其中，所述采用8g/l的琼脂制作的培养基表面较软，使得硒砂瓜种子能微微陷入培养基中，从而将硒砂瓜种子固定稳定；而培养基中一般采用15g/l的琼脂，但15g/l琼脂制作的培养基表面太硬，使得硒砂瓜种子容易滑落，固定不稳。

优选的，所述步骤s2中，土壤浸出培养基的灭菌处理采用蒸汽灭菌方式。

优选的，所述蒸汽灭菌的温度为116-125℃，时间为12-18min。

本发明通过采用蒸汽灭菌方式，并严格控制蒸汽灭菌的温度和时间，能对土壤浸出培养基中的微生物进行杀灭，避免后续步骤s4和步骤s5的筛选生防菌株过程中，微生物对待测生防菌株产生防治影响。

优选的，所述步骤s3中，硒砂瓜种子的消毒处理采用质量分数为0.05-0.2％的氯化汞消毒1-3分钟，然后用无菌水漂洗种子6-8次；能将硒砂瓜种子表面的微生物进行消毒灭杀，避免后续筛选生防菌株过程中，微生物影响待测生防菌株的防治作用。

优选的，所述步骤s3中，恒温催芽的温度条件为28-32℃，适宜硒砂瓜种子的发芽生长，促进萌芽。

优选的，所述步骤s4中，恒温培养的温度为25-30℃，培养时间为20-28h；能促进待测生防菌株在发芽种子的根部生长、繁殖，实现对发芽种子的根部的保护、防治。

优选的，所述步骤s5中，恒温培养的条件为：14-18h的光照处理，光照强度为4500-5500lx，温度为25-30℃；然后6-10h黑暗处理，温度为15-20℃。上述恒温培养的条件为模拟昼夜环境，排除由于光照和温度等条件造成对待测生防菌株的筛选影响。

优选的，所述步骤s6后，还包括步骤s7：将具有防病作用的菌株进行盆栽生防试验及田间生防试验，试验通过后的菌株则用于生防产品生产。

通过盆栽生防试验及田间生防试验，能核实该生防菌株能在农作生产中起到较佳的生防作用。

其中，所述盆栽生防试验具体操作为：将生防菌株配成1x10⁶cfu/ml菌悬液，每500g土壤施入100ml菌液。在28℃温箱中培养24h，使生防菌株在土壤中定殖。24h后再接种1x10⁶/ml的孢子悬浮液，然后将根长约1.5厘米的硒砂瓜种子根部植入含菌土壤，将上述处理的硒砂瓜种子根部置于植物培养箱中培养。

培养条件：16h光照，28℃,5000lx；8h黑暗，18℃。14天后观察发病情况。

本发明的有益效果在于：本发明硒砂瓜生物防治菌株的筛选方法操作简单，不依赖传统的拮抗指标作为筛选依据，以活的硒砂瓜植株作为平台，通过“生防菌株-硒砂瓜植株-枯萎病菌”三者之间的相互作用，直接观察硒砂瓜是否发病，获得能够保护硒砂瓜不受枯萎病侵染的生防菌株，防病效果佳。

其中，以植物作为关键筛选平台，不同于传统的平板对峙法以微生物培养基为平台；而且，以完整的活体植物作为关键材料，并在植物培养箱中进行培养，不同于离体组织，如剪下的叶片或剪下的根，处于不断生长的完整植物与离体的植物组织的免疫反应是不一样的，因而本发明采用活体植物种子作为筛选平台，更能反映真实的生防效果，准确筛选出能应用于农作生产的菌株。

附图说明

图1是本发明筛选方法中步骤s5接种致病菌培养物的实验组土壤浸出培养基的图片。

具体实施方式

为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例及附图1对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。

实施例1

一种硒砂瓜生物防治菌株的筛选方法，包括如下步骤：

s1：用pda培养基平板培养致病菌，得到致病菌培养物，备用；

s2：利用种植硒砂瓜的土壤制作土壤浸出培养基，然后将土壤浸出培养基灭菌处理，再放入培养皿中，将培养皿摆成斜面，使得土壤浸出培养基凝固后形成斜面培养基；

s3：将硒砂瓜种子用进行消毒，然后用无菌水漂洗种子；再将消毒后的硒砂瓜种子用无菌的湿纱布包裹，恒温催芽；

s4：将步骤s3发芽后的硒砂瓜种子放置于步骤s2的土壤浸出培养基表面，然后将待测生防菌株滴加到发芽种子的根部，恒温培养；

s5：将步骤s1制得的致病菌培养物打孔，并放置于步骤s4的硒砂瓜种子根部附近，并设置没有放置待测生防菌株的土壤浸出培养基作为阳性对照组，设置没有放置待测生防菌株、没有接种致病菌培养物的土壤浸出培养基作为阴性对照组，然后将上述土壤浸出培养基根部遮光，恒温培养；

s6：培养结束后，阳性对照组出现致病症状后，检查硒砂瓜种子，若硒砂瓜种子保持健康，则硒砂瓜种子对该待测菌株具有防病作用。

所述步骤s2中，土壤浸出培养基的制备包括如下步骤：

取200g的硒砂瓜种植土壤，加800ml的纯净水，搅拌23min，静置60min，将上清液倒入干净的烧杯，加0.5g蔗糖和0.1g酵母浸粉，搅拌均匀，定容到1000ml，最后加8g/l的琼脂，搅拌均匀，制得土壤浸出培养基。

所述步骤s2中，土壤浸出培养基的灭菌处理采用蒸汽灭菌方式。

所述蒸汽灭菌的温度为121℃，时间为15min。

所述步骤s3中，硒砂瓜种子的消毒处理采用质量分数为0.1％的氯化汞消毒2分钟，然后用无菌水漂洗种子7次。

所述步骤s3中，恒温催芽的温度条件为30℃。

所述步骤s4中，恒温培养的温度为28℃，培养时间为24h。

所述步骤s5中，恒温培养的条件为：16h的光照处理，光照强度为4500-5500lx，温度为28℃；然后8h黑暗处理，温度为18℃。

所述步骤s6后，还包括步骤s7：将具有防病作用的菌株进行盆栽生防试验及田间生防试验，试验通过后的菌株则用于生防产品生产。

实施例2

本实施例与上述实施例1的区别在于：

所述步骤s2中，土壤浸出培养基的制备包括如下步骤：

取180g的硒砂瓜种植土壤，加500ml的纯净水，搅拌15min，静置50min，将上清液倒入干净的烧杯，加0.3g蔗糖和0.05g酵母浸粉，搅拌均匀，定容到1000ml，最后加8g/l的琼脂，搅拌均匀，制得土壤浸出培养基。

所述步骤s2中，土壤浸出培养基的灭菌处理采用蒸汽灭菌方式。

所述蒸汽灭菌的温度为116℃，时间为12min。

所述步骤s3中，硒砂瓜种子的消毒处理采用质量分数为0.08％的氯化汞消毒1分钟，然后用无菌水漂洗种子6次。

所述步骤s3中，恒温催芽的温度条件为28℃。

所述步骤s4中，恒温培养的温度为25℃，培养时间为28h。

所述步骤s5中，恒温培养的条件为：14h的光照处理，光照强度为4500-5500lx，温度为25℃；然后10h黑暗处理，温度为15℃。

实施例3

本实施例与上述实施例1的区别在于：

所述步骤s2中，土壤浸出培养基的制备包括如下步骤：

取190g的硒砂瓜种植土壤，加600ml的纯净水，搅拌18min，静置55min，将上清液倒入干净的烧杯，加0.4g蔗糖和0.08g酵母浸粉，搅拌均匀，定容到1000ml，最后加8g/l的琼脂，搅拌均匀，制得土壤浸出培养基。

所述步骤s2中，土壤浸出培养基的灭菌处理采用蒸汽灭菌方式。

所述蒸汽灭菌的温度为118℃，时间为13min。

所述步骤s3中，硒砂瓜种子的消毒处理采用质量分数为0.12％的氯化汞消毒1分钟，然后用无菌水漂洗种子6次。

所述步骤s3中，恒温催芽的温度条件为29℃。

所述步骤s4中，恒温培养的温度为26℃，培养时间为6h。

所述步骤s5中，恒温培养的条件为：15h的光照处理，光照强度为4500-5500lx，温度为16℃；然后9h黑暗处理，温度为16℃。

实施例4

本实施例与上述实施例1的区别在于：

所述步骤s2中，土壤浸出培养基的制备包括如下步骤：

取210g的硒砂瓜种植土壤，加900ml的纯净水，搅拌26min，静置65min，将上清液倒入干净的烧杯，加0.6g蔗糖和0.13g酵母浸粉，搅拌均匀，定容到1000ml，最后加8g/l的琼脂，搅拌均匀，制得土壤浸出培养基。

所述步骤s2中，土壤浸出培养基的灭菌处理采用蒸汽灭菌方式。

所述蒸汽灭菌的温度为123℃，时间为16min。

所述步骤s3中，硒砂瓜种子的消毒处理采用质量分数为0.16％的氯化汞消毒3分钟，然后用无菌水漂洗种子8次。

所述步骤s3中，恒温催芽的温度条件为31℃。

所述步骤s4中，恒温培养的温度为29℃，培养时间为22h。

所述步骤s5中，恒温培养的条件为：17h的光照处理，光照强度为4500-5500lx，温度为19℃；然后7h黑暗处理，温度为18℃。

实施例5

本实施例与上述实施例1的区别在于：

所述步骤s2中，土壤浸出培养基的制备包括如下步骤：

取220g的硒砂瓜种植土壤，加1000ml的纯净水，搅拌30min，静置70min，将上清液倒入干净的烧杯，加0.8g蔗糖和0.15g酵母浸粉，搅拌均匀，定容到1000ml，最后加8g/l的琼脂，搅拌均匀，制得土壤浸出培养基。

所述步骤s2中，土壤浸出培养基的灭菌处理采用蒸汽灭菌方式。

所述蒸汽灭菌的温度为125℃，时间为18min。

所述步骤s3中，硒砂瓜种子的消毒处理采用质量分数为0.2％的氯化汞消毒3分钟，然后用无菌水漂洗种子8次。

所述步骤s3中，恒温催芽的温度条件为32℃。

所述步骤s4中，恒温培养的温度为30℃，培养时间为20h。

所述步骤s5中，恒温培养的条件为：18h的光照处理，光照强度为4500-5500lx，温度为30℃；然后6h黑暗处理，温度为20℃。

实施例6

本实施例与上述实施例1的区别在于：

所述盆栽生防试验具体操作为：

将压砂地土壤用121℃灭菌1小时，冷却后分装到无菌的组培瓶中备用，每瓶500克。

然后将生防菌株配成1x10⁶cfu/ml菌悬液，每500g土壤施入100ml菌液。在28℃温箱中培养24h，使生防菌株在土壤中定殖。24h后再接种1x10⁶/ml的孢子悬浮液，然后将根长约1.5厘米的硒砂瓜种子根部植入含菌土壤，将上述处理的硒砂瓜种子根部置于植物培养箱中培养。

培养条件：16h光照，28℃,5000lx；8h黑暗，18℃。14天后观察发病情况。

同时设置发病对照，即土壤中拌入尖孢镰刀菌。

经观察发病情况，本实施例生防试验组的发病率为4.3％，单纯接种尖孢镰刀菌的发病对照组的发病率为100％，生防试验的有效性为95.7％。

对比例1

本对比例与上述实施例6的区别在于：

所述盆栽生防试验具体操作为：

将压砂地土壤用121℃灭菌1小时，冷却后分装到无菌的组培瓶中备用，每瓶500克。

然后将致病菌配成1x10⁶cfu/ml的孢子悬浮液，每500克土壤施入100ml菌悬液。在28℃温箱中培养24小时，使致病菌在土壤中定殖。24小时后再接种100毫升1x10⁶/ml的生防菌液，然后将根长约1.5厘米的硒砂瓜种子根部植入含菌土壤，将上述处理的硒砂瓜种子根部置植物培养箱中培养。

培养条件：16h光照，28℃,5000lx；8h黑暗，18℃。14天后观察发病情况。

同时设置发病对照，即土壤中拌入尖孢镰刀菌。

经观察发病情况，本对比例生防试验组的发病率为68.2％，单纯接种尖孢镰刀菌的发病对照组的发病率为100％，生防试验的有效性为31.8％。

对比例2

本对比例与上述实施例6的区别在于：

所述盆栽生防试验具体操作为：

将压砂地土壤用121℃灭菌1小时，冷却后分装到无菌的组培瓶中备用，每瓶500克。

然后将尖孢镰刀菌孢子制成2x10⁶/ml的孢子悬浮液，将生防菌株配制成2x10⁶cfu/ml菌悬液，将上述两种菌液按1：1比例混合。每500克土壤施入100ml混合菌液。将根长约1.5厘米的硒砂瓜种子根部植入含菌土壤，将上述处理的硒砂瓜种子根部置植物培养箱中培养。

培养条件：16h光照，28℃,5000lx；8h黑暗，18℃。14天后观察发病情况。

同时设置发病对照，即土壤中拌入尖孢镰刀菌。

经观察发病情况，本对比例生防试验组发病率12.7％，单纯接种尖孢镰刀菌的发病对照组的发病率为100％，说明生防试验的有效性达87.3％。

上述实施例6、对比例1-2的盆栽试验结果表明，实施例6先让生防菌在土壤中繁殖24小时，生防效果最好，达到95.7％；而对比例2将生防菌与致病菌同时施入土壤，生防效果达87.3％，生防效果有所下降；但对比例1让致病菌先在土壤中定殖，生防效果显著降低。

上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。