本发明涉及菌落计数培养基领域，具体涉及一种复合菌发酵饲料中乳酸菌及酵母菌计数用培养基及其制备方法和应用。
背景技术：
近年来，抗生素带来的负面问题日益严重，新抗生素的开发严重滞后。寻找替抗产品迫在眉睫，益生菌作为替抗产品之一，有着举足轻重的地位。
发酵饲料是以配合饲料为发酵底物，选择接种特定的有益微生物，人工控制温度、水分、需氧量等条件，通过微生物自身繁殖和代谢来生产的富含高活性益生菌及其代谢产物的饲料。评价发酵饲料的品质可以从多方面入手，其中重要一项就是发酵饲料中的活菌数。在发酵饲料中含有大量芽孢菌(枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌)、乳酸菌以及酵母菌等有益菌，测定它们的含量即可得出发酵饲料中的活菌量。
平板稀释法是测定饲料中芽孢菌、乳酸菌、酵母菌含量的常用方法，过程涉及3种不同平板，利用lb琼脂平板来测定芽孢菌，利用mrs琼脂来测定乳酸菌，利用ypd琼脂来测定酵母菌。传统的测定方法需要配置3种不同的培养基，准备工作量大繁杂，并且效率底，其中乳酸菌及酵母菌在mrs与ypd培养基中生长过程缓慢一般需要48h左右，且由于芽孢菌的生长较快，易在mrs琼脂、ypd琼脂培养基中生长，即使在厌氧条件下，当培养时间足够长时，同样会影响乳酸菌以及酵母菌的计数结果。因此，为了准确得到活菌量，在对发酵饲料进行菌量检测时，寻找一种合适的多用培养基是必需的。
技术实现要素：
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种可以将酵母菌与乳酸菌分别计数，可以有效抑制芽孢菌在该琼脂上的生长，避免由于芽孢菌的生长而影响乳酸菌及酵母菌的计数结果的复合菌发酵饲料中乳酸菌及酵母菌计数用培养基及其制备方法和应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种复合菌发酵饲料中乳酸菌及酵母菌计数用培养基，该培养基包括以下质量或体积浓度组分：有机物28-35g/l、番茄汁50-100ml/l、无机盐2-3.5g/l、x-gal1ml/l、琼脂15-18g/l，该培养基的ph值为5-6。
进一步地，所述的有机物包括胰蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸粉或葡萄糖中的一种或多种。
若选择胰蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸粉和葡萄糖，它们的质量浓度之比为(6-8):(6-7):(4-5):(12-15)。
进一步地，所述的无机盐包括磷酸氢二钾、硫酸镁或硫酸锰中的一种或多种。
若选择磷酸氢二钾、硫酸镁和硫酸锰，它们的质量浓度之比为(2-3):(0.2-0.4):(0.03-0.05)。
进一步地，所述的番茄汁采用以下方法制得：将新鲜的番茄清洗切碎，添加灭菌水，然后进行温煮，过滤，之后保存备用。
进一步地，所述的灭菌水与番茄的质量比为(0.5-2):1；所述的温煮的温度45-55℃，时间为10-15min；所述的保存的温度为1-5℃。
进一步地，该培养基的ph值为5.5。
本发明所涉及的固体培养基除了含有普通培养基所含成分外，还加入了番茄汁、x-gal显色剂，并且将该多用固体培养基的灭前ph调至5.5左右。番茄汁可以为微生物的生长提供碳源、蛋白质以及天然的生长因子，可以有效的促进乳酸菌在该多用固体琼脂上生长。x-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-α-d-吡喃半乳糖苷，是β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的显色底物，在β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。复合菌发酵饲料中常常添加的乳酸菌以乳杆菌为主，检测出发酵饲料中乳杆菌的含量即为其中乳酸菌的含量；乳杆菌在培养过程中分泌的半乳糖苷酶为x-gal的显色底物，在培养基中加入x-gal可以在固体平板中有效的区分乳杆菌。在发酵饲料中除了酵母菌与乳酸菌外，常含有芽孢菌(地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌)，由于芽孢菌的特性，在利用mrs和ypd平板进行乳酸菌及酵母菌计数时，芽孢菌也会在其中快速生长而影响其计数结果，孟加拉红作为真菌的计数琼脂常用于酵母菌的计数中，但在孟加拉红琼脂中酵母菌的生长时间较长，一般需要48小时，耗时长，出结果慢。在本发明中将多用固体培养基ph降低为5.5左右，在不影响乳酸菌以及酵母菌的培养同时能够有效抑制芽孢菌的在平板上的生长，排除了芽孢菌的干扰。
一种如上所述的复合菌发酵饲料中乳酸菌及酵母菌计数用培养基的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)按浓度份，将有机物、无机盐和琼脂加入到蒸馏水中，并定容；
(2)用盐酸将培养基ph调节至5-6，并高压灭菌；
(3)培养基冷却，按浓度份，在无菌环境中加入x-gal及番茄汁，摇匀，得到复合菌发酵饲料中乳酸菌及酵母菌计数用培养基。
进一步地，所述的高压灭菌的温度为115-121℃，时间为15-30min；所述的冷却的温度为50-55℃。
一种如上所述的复合菌发酵饲料中乳酸菌及酵母菌计数用培养基的应用，该培养基应用于复合菌发酵饲料中乳酸菌及酵母菌的计数。
进一步地，该应用方法为：将复合菌发酵饲料与生理盐水混合并稀释，然后接种到培养基中，对乳酸菌及酵母菌进行计数。
下表为本发明与现有技术的对比：
注：“+”表示生长，“-”表示抑制。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)与目前活菌计数相比，本发明通过设计一种多用培养基来对发酵饲料进行有效检测，在该培养基中加入了番茄汁，能够促进乳酸菌与酵母菌在该多用培养基中的生长，将培养时间缩短至24h左右；
(2)在该培养基中通过加入x-gal显色剂，利用其对乳酸菌的染色效果，可以便捷的在平板中将酵母与乳酸菌分别计数；
(3)此外，将该多用培养基在初始ph上进行了调整，在灭菌之前将ph调至5.5左右后，调整ph后可以有效抑制芽孢菌在该琼脂上的生长，避免由于芽孢菌的生长而影响乳酸菌及酵母菌的计数结果；
(4)本发明可以同时在一种培养基中同时检测出乳酸菌及酵母菌的含量，便捷了发酵饲料菌量检测操作，进而有效评价发酵饲料的品质。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
培养基配置
配方：胰蛋白胨：6-8g/l；酵母浸粉4-5g/l；牛肉浸粉：6-7g/l；葡萄糖：12-15g/l；番茄汁：50-100ml/l；x-gal：1ml/l；磷酸氢二钾：2-3g/l；硫酸镁：0.2-0.4g/l；硫酸锰：0.03-0.05g/l；琼脂：15-18g/l。
其中番茄汁的制备：新鲜番茄清洗切碎，按质量比1：1添加灭菌水，放不锈钢锅中温煮中打碎出汁，转速6000-8000rpm离心5min，利用移液枪吸取收集上清，放置于置于4℃，备用。
根据配方称取除x-gal和番茄汁外的其余组分，加入少于1000ml蒸馏水将其溶解后定容至1000ml，利用盐酸将其ph调整至5-6。115-121℃高压灭菌15-30分钟。将已灭菌的培养基冷却至50-55℃，在无菌环境中加入1mlx-gal溶液及50-100ml的番茄汁，摇匀。倾注在灭好的空平板中备用。
发酵饲料1：原料：玉米、豆粕、麸皮等；菌种：植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酿酒酵母；水分30-40％。为市售的傲农公司发酵饲料产品傲益宝发酵饲料(猪宝宝)。
发酵饲料2：原料：玉米、豆粕、麸皮等；菌种：植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酿酒酵母；水分30-40％。为市售的傲农公司发酵饲料产品傲益宝发酵饲料(蛋宝宝)。
发酵饲料3：原料：玉米、豆粕、麸皮等；菌种：植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酿酒酵母；水分30-40％。为市售的傲农公司发酵饲料产品傲益宝发酵饲料(刍宝宝)。
实施例1
一、配方：
胰蛋白胨：6g/l；酵母浸粉4g/l；牛肉浸粉：6g/l；葡萄糖：12g/l；番茄汁：50ml/l；x-gal：1ml/l；磷酸氢二钾：3g/l；硫酸镁：0.2g/l；硫酸锰：0.03g/l；琼脂：15g/l。
其中，番茄汁的配置：将新鲜的番茄清洗切碎，按照质量比1:1添加灭菌水，进行50℃温煮10-15分钟，再利用4-8层无菌纱布进行过滤，之后将其分装到灭过菌的三角瓶里。4℃保存备用。
根据配方称取除x-gal和番茄汁外的其余组分，加入少于1000ml蒸馏水将其溶解后定容至1000ml，利用盐酸将其ph调整至5.5。115℃高压灭菌30分钟。将已灭菌的培养基冷却至50-55℃，在无菌环境中加入1mlx-gal溶液及50ml的番茄汁，摇匀。倾注在灭好的空平板中备用。
二、验证试验
1、培养基制备
(1)ypd(现有技术)：称取蛋白胨：10g/l，酵母浸粉5g/l，葡萄糖：2g/l；氯化钠：5g/l，加入1000ml的蒸馏水进行加热至琼脂溶解，121℃，20min灭菌备用。
(2)mrs(现有技术)：称取蛋白胨：10g/l，牛肉膏：10g/l，酵母粉：5g/l，葡萄糖20g/l，乙酸钠：5g/l，柠檬酸二铵：2g/l，吐温80ml/l，磷酸氢二钾：2g/l，七水硫酸镁：0.58g/l，一水硫酸锰：0.25g/l，琼脂18g/l，加入1000ml的蒸馏水进行加热至琼脂溶解，121℃，15min灭菌备用。
(3)孟加拉红(现有技术)：称取蛋白胨：5g/l，葡萄糖10g/l，磷酸氢二钾：1g/l，无水硫酸镁：0.5g/l，孟加拉红：0.033g/l，氯霉素：0.1g/l，琼脂：20g/l，加入1000ml的蒸馏水进行加热至琼脂溶解，121℃，15min灭菌备用。
(4)多用培养基：按照实施例1方法制备。
2、试验设计
(1)称取10g发酵饲料1，并将其与90ml灭菌的生理盐水于锥形瓶中，而后至于摇床中摇20min，使其充分混匀，获得10-1的样品混悬液。吸取1ml的该样品悬液采用无菌生理盐水进行10倍稀释，依次获得稀释10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7倍的样品稀释液。
(2)分别吸取1ml的稀释倍数为10-5，10-6，10-7的样品分别加入三个配置好的mrs固体琼脂平板中，利用涂布棒将其于平板上均匀涂开，每个浓度的样品稀释液设置三个重复，将涂好的平板倒置于蜡烛缸中，在37℃的培养箱中培养，待肉眼可清晰见到分离清楚的菌落时将平皿取出。
(3)分别吸取1ml的稀释倍数为10-5，10-6，10-7的样品分别加入三个配置好的孟加拉红琼脂平板和ypd琼脂平板中，利用涂布棒将其于平板上均匀涂开，每个浓度的样品稀释液设置三个重复，将涂好的平板倒置于37℃的培养箱中培养，待肉眼可清晰见到分离清楚的菌落时将平皿取出。
(4)分别吸取1ml的稀释倍数为10-5，10-6，10-7的样品分别加入三个配置好的实施例1中的多用固体培养基平板中，利用涂布棒将其于平板上均匀涂开，每个浓度的样品稀释液设置三个重复，将涂好的平板倒置于蜡烛缸中，在37℃的培养箱中培养，待肉眼可清晰见到分离清楚的菌落时将平皿取出。
三、计数结果
表1.1发酵饲料1中乳酸菌计数结果对比
表1.2发酵饲料1中酵母菌计数结果对比
试验结果：通过传统计数平板与本发明的多用培养基对发酵饲料1进行计数结果对比可以得出：利用多用培养基对发酵饲料1中的乳酸菌与酵母菌进行计数的结果与利用mrs培养基和孟加拉平板进行计数的结果无明显差异，且加快两株菌在多用培养基上的生长，提高计数效率。
实施例2
一、配方：
胰蛋白胨：7g/l；酵母浸粉4.5g/l；牛肉浸粉：6.5g/l；葡萄糖：14g/l；番茄汁：80ml/l；x-gal：1ml/l；磷酸氢二钾：2g/l；硫酸镁：0.3g/l；硫酸锰：0.04g/l；琼脂：18g/l。
番茄汁的配置：将新鲜的番茄清洗切碎，按照质量比1:1添加灭菌水，进行50℃温煮10-15分钟，再利用6层无菌纱布进行过滤，之后将其分装到灭过菌的三角瓶里。4℃保存备用。
根据配方称取除x-gal和番茄汁外的其余组分，加入少于1000ml蒸馏水将其溶解后定容至1000ml，利用盐酸将其ph调整至5.5。121℃高压灭菌20分钟。将已灭菌的培养基冷却至50-55℃，在无菌环境中加入1mlx-gal溶液及50ml的番茄汁，摇匀。倾注在灭好的空平板中备用。
二、验证试验
1、培养基制备
(1)ypd(现有技术)：称取蛋白胨：10g/l，酵母浸粉5g/l，葡萄糖：2g/l；氯化钠：5g/l，加入1000ml的蒸馏水进行加热至琼脂溶解，121℃，20min灭菌备用。
(2)mrs(现有技术)：称取蛋白胨：10g/l，牛肉膏：10g/l，酵母粉：5g/l，葡萄糖20g/l，乙酸钠：5g/l，柠檬酸二铵：2g/l，吐温80ml/l，磷酸氢二钾：2g/l，七水硫酸镁：0.58g/l，一水硫酸锰：0.25g/l，琼脂18g/l，加入1000ml的蒸馏水进行加热至琼脂溶解，121℃，15min灭菌备用。
(3)孟加拉红(现有技术)：称取蛋白胨：5g/l，葡萄糖10g/l，磷酸氢二钾：1g/l，无水硫酸镁：0.5g/l，孟加拉红：0.033g/l，氯霉素：0.1g/l，琼脂：20g/l，加入1000ml的蒸馏水进行加热至琼脂溶解，121℃，15min灭菌备用。
(4)多用培养基：按照实施例2方法制备。
2、实验设计
除了称取的发酵饲料样品不同，为发酵饲料样品2，其余与实施例1相同。
三、计数结果
表2.1发酵饲料2中乳酸菌计数结果对比
表2.2发酵饲料2中酵母菌计数结果对比
试验结果：通过传统计数平板与本发明的多用培养基对发酵饲料2进行计数结果对比可以得出：利用多用培养基对发酵饲料2中的乳酸菌与酵母菌进行计数的结果与利用mrs培养基和孟加拉平板进行计数的结果无明显差异，且加快两株菌在多用培养基上的生长，提高计数效率。
实施例3
一、配方：
胰蛋白胨：8g/l；酵母浸粉5g/l；牛肉浸粉：7g/l；葡萄糖：15g/l；番茄汁：100ml/l；x-gal：1ml/l；磷酸氢二钾：2.5g/l；硫酸镁：0.4g/l；硫酸锰：0.05g/l；琼脂：17g/l。
番茄汁的配置：将新鲜的番茄清洗切碎，按照质量比1:1添加灭菌水，进行50℃温煮10-15分钟，再利用8层无菌纱布进行过滤，之后将其分装到灭过菌的三角瓶里。4℃保存备用。
根据配方称取除x-gal和番茄汁外的其余组分，加入少于1000ml蒸馏水将其溶解后定容至1000ml，利用盐酸将其ph调整至5.5。115℃高压灭菌30分钟。将已灭菌的培养基冷却至50-55℃，在无菌环境中加入1mlx-gal溶液及50ml的番茄汁，摇匀。倾注在灭好的空平板中备用。
二、验证试验
1、培养基制备
(1)ypd(现有技术)：称取蛋白胨：10g/l，酵母浸粉5g/l，葡萄糖：2g/l；氯化钠：5g/l，加入1000ml的蒸馏水进行加热至琼脂溶解，121℃，20min灭菌备用。
(2)mrs(现有技术)：称取蛋白胨：10g/l，牛肉膏：10g/l，酵母粉：5g/l，葡萄糖20g/l，乙酸钠：5g/l，柠檬酸二铵：2g/l，吐温80ml/l，磷酸氢二钾：2g/l，七水硫酸镁：0.58g/l，一水硫酸锰：0.25g/l，琼脂18g/l，加入1000ml的蒸馏水进行加热至琼脂溶解，121℃，15min灭菌备用。
(3)孟加拉红(现有技术)：称取蛋白胨：5g/l，葡萄糖10g/l，磷酸氢二钾：1g/l，无水硫酸镁：0.5g/l，孟加拉红：0.033g/l，氯霉素：0.1g/l，琼脂：20g/l，加入1000ml的蒸馏水进行加热至琼脂溶解，121℃，15min灭菌备用。
(4)多用培养基：按照实施例3方法制备。
2、实验设计
除了称取的发酵饲料样品不同，为发酵饲料样品3，其余与实施例1相同。
三、计数结果
表3.1发酵饲料3中乳酸菌计数结果对比
表3.2发酵饲料3中酵母菌计数结果对比
试验结果：通过传统计数平板与本发明的多用培养基对发酵饲料3进行计数结果对比可以得出：利用多用培养基对发酵饲料3中的乳酸菌与酵母菌进行计数的结果与利用mrs培养基和孟加拉平板进行计数的结果无明显差异，且加快两株菌在多用培养基上的生长，提高计数效率。
综上，本发明将多用培养基的计数结果分别与mrs琼脂和孟加拉琼脂的结果进行比对，无明显差异；且由于多用培养基中的乳酸菌显色反应及ph的调节，可以减少乳酸菌、酵母菌、芽孢菌之间的计数影响，同时在一种培养基中同时检测出乳酸菌及酵母菌的含量，提高计数效率，便捷了发酵饲料菌量检测操作，进而有效评价发酵饲料的品质。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。