一种与大白菜花色相关的分子标记及其应用的制作方法

本发明涉及作物分子标记辅助育种技术领域，具体涉及一种大白菜橘红色花基因br-or的高通量检测标记及其在育种中的应用。

背景技术：

花色是植物适应环境的表型性状之一。花色一般指花瓣的颜色，可作为虫媒植物引诱昆虫进行授粉的一个重要视觉信号，对植物生存繁衍具有重要意义。花色可以影响蚜虫取食，生产中选育不同花色的作物品种具有降低蚜虫传病的作用，也可以维持花瓣的能量平衡，避免花器官受伤害。花色在植物品种选育以及生长发育方面均有一定的影响，在提高种子纯度、去除杂株、鉴定天然异交率和检验种间性状转移等方面也有重要的作用。对于观赏性植物来说，花色不仅决定植物的观赏价值，也直接影响着其商业价值。

大白菜(brassicarapal.ssppekinensis)是我国栽培面积最大的蔬菜作物之一，在我国蔬菜作物中占有重要地位，其花色主要有黄色花、桔红色花和白色花。大白菜的花色可以作为其育种的标示性状用以早期淘汰不需要的材料，以加快育种选育进度。大白菜橘红色花性状是由1对隐性基因控制的质量性状，并且橘红色花和球心色性状完全连锁，即花色为橘红色的其球色也为橘红色，在转育过程中根据花色就能筛选到橘红心材料(张德双等，2003，大白菜花色和球色遗传规律的研究，华北农学报，18(2)：81-84.)。开发与橘红色花连锁的分子标记，不仅可以用于大白菜橘红色花的分子标记辅助育种，而且可以用于大白菜橘红心的分子育种，具有重要的应用价值。

前人研究表明大白菜橘红花基因br-or的候选基因为编码类胡萝素异构酶的brcrtiso(bra031539)，并且开发了不同类型的分子标记。feng等(2012)获得了5个与br-or连锁的ssr标记，br-or基因两侧的紧密连锁标记syau19和syau15覆盖了4.6cm的区域(fengetal.,2012，mappingofor,ageneconferringorangecolorontheinnerleafofthechinesecabbage(brassicarapal.ssp.pekinensis),molecularbreeding,29:235-244.)。李佩荣等(2014)针对候选基因bra031539第一外显子上6个碱基的缺失变异设计了基于聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的indel标记(李佩荣等，2014，大白菜橘红心类胡萝卜素组分及其基因分析，园艺学报，41(3)：469-478)。zhang等(2015)针对候选基因bra031539启动子区域88bp的变异设计了indel标记(zhangetal.,2015,molecularcharacterizationandtranscriptomeanalysisoforangeheadchinesecabbage(brassicarapal.ssp.pekinensis),planta,241:1381-1394)。li等(2017)针对候选基因bra031539第一内含子的变异设计了indel标记(lietal.,2017,transcriptomeanalysisoforangeheadchinesecabbage(brassicarapal.ssp.pekinensis)andmolecularmarkerdevelopment,internationaljournalofgenomics,6835810:1-8.)。lee等(2014)针对bra031539第一外显子和第二外显子的变异设计了indel标记(leeetal.,2014,associationofmolecularmarkersderivedfromthebrcrtiso1genewithprolycopene-enrichedorange-coloredleavesinbrassicarapa,theoreticalappliedgenetics,127:179-191.)。

尽管前人针对橘红花基因br-or不同位置的变异了开发了不同的分子标记，但是开发的标记多为基于凝胶电泳的标记，耗时耗力价格成本较高，开发的标记不具有通用性。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于，鉴定或者辅助鉴定大白菜花色，以期为橘红色花色的大白菜育种的分子标记筛选和聚合育种奠定基础。

为了解决上述技术问题，本发明提供了鉴定或辅助鉴定大白菜花色的方法，包括检测待测大白菜的基因型，根据待测大白菜的基因型鉴定或辅助鉴定大白菜花色；所述基因型为大白菜基因组中br-or-a09-37676461位点的基因型；所述br-or-a09-37676461位点是大白菜基因组中的一个snp位点，其核苷酸种类为c或t，为序列表中seqidno.4的第101位核苷酸。

其中，所述br-or-a09-37676461位点的基因型为cc基因型时，大白菜的花色为橘红色或者候选为橘红色；所述br-or-a09-37676461位点的基因型为ct基因型或者tt基因型时，大白菜的花色为黄色或者候选为黄色；其中，所述cc基因型表示大白菜基因组中所述br-or-a09-37676461位点的核苷酸种类为c的纯合型；所述tt基因型表示大白菜基因组中所述br-or-a09-37676461位点的核苷酸种类为t的纯合型；所述ct基因型表示大白菜基因组中所述br-or-a09-37676461位点的核苷酸种类为c和t的杂合型。

本发明提供了下述a1-a5的任一种应用，

a1.检测大白菜基因组中br-or-a09-37676461位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定大白菜花色中的应用；所述br-or-a09-37676461位点是大白菜基因组中的一个snp位点，其核苷酸种类为c或t，为序列表中seqidno.4的第101位核苷酸。

a2.检测大白菜基因组中br-or-a09-37676461位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定大白菜花色产品中的应用；所述br-or-a09-37676461位点是大白菜基因组中的一个snp位点，其核苷酸种类为c或t，为序列表中seqidno.4的第101位核苷酸。

a3、检测大白菜基因组中br-or-a09-37676461位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定大白菜叶球心颜色中的应用；所述br-or-a09-37676461位点是大白菜基因组中的一个snp位点，其核苷酸种类为c或t，为序列表中seqidno.4的第101位核苷酸。

a4、检测大白菜基因组中br-or-a09-37676461位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定大白菜叶球心颜色产品中的应用；所述br-or-a09-37676461位点是大白菜基因组中的一个snp位点，其核苷酸种类为c或t，为序列表中seqidno.4的第101位核苷酸。

a5.检测大白菜基因组中br-or-a09-37676461位点的多态性或基因型的物质在大白菜育种或制备大白菜育种产品中的应用；所述br-or-a09-37676461位点是大白菜基因组中的一个snp位点，其核苷酸种类为c或t，为序列表中seqidno.4的第101位核苷酸。

本发明还提供了含有检测大白菜基因组中br-or-a09-37676461位点的多态性或基因型的物质的产品，为c1)-c5)中任一种产品：

c1)检测与大白菜花色相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；

c2)鉴定或辅助鉴定大白菜花色的产品；

c3)检测与大白菜叶球心颜色相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；

c4)鉴定或辅助鉴定大白菜叶球心颜色的产品；

c5)用于大白菜育种的产品。

上述应用、方法和产品中，所述大白菜育种为培育花色为橘红色的大白菜或选育花色为橘红色的大白菜。所述大白菜育种为培育叶球心颜色为橘红色的大白菜或选育叶球心颜色为橘红色的大白菜。

上述应用、方法和产品中，所述检测大白菜基因组中br-or-a09-37676461位点的多态性或基因型的物质为如下d1)、d2)或d3)：

d1)所述检测大白菜基因组中br-or-a09-37676461位点的多态性或基因型的物质含有扩增包括所述br-or-a09-37676461位点在内的大白菜基因组dna片段的pcr引物；

d2)所述检测大白菜基因组中br-or-a09-37676461位点的多态性或基因型的物质为含有所述pcr引物的pcr试剂；

d3)含有d1)所述pcr引物或d2)所述pcr试剂的试剂盒。

上述应用、方法和产品中，所述pcr引物为p1或p2：

p1、所述pcr引物为由核苷酸序列是序列表中seqidno.1的第22-39位的单链dna、核苷酸序列是序列表中seqidno.2的第22-39位的单链dna和核苷酸序列是序列表中seqidno.3的单链dna组成的引物组；

p2、所述pcr引物为由序列表中seqidno.1所示的单链dna、序列表中seqidno.2所示的单链dna和由序列表中seqidno.3所示的单链dna的引物组。

上述待测大白菜为大白菜y959m-5与大白菜r16-11的杂交后代群体，例如，以橘红花色大白菜y959m-5(p1)作为母本，以黄色花色大白菜r16-11(p2)作为父本，对两个材料进行杂交获得f1代种子，f1材料自交获得f2代种子，选取f2代种子培养得到的植株即为y959rf2群体。

本发明通过bsa-seq技术检测到与橘红色花基因br-or显著相关的snp位点br-or-a09-37676461，并开发了kasp标记br-or-kasp1，该标记可以高通量检测br-or的基因型，能够高效率、低成本应用于大白菜橘红色花和橘红色叶球心的分子标记辅助育种，具有非常重要的意义。

附图说明

图1为橘红花基因br-or的bsa-seq定位结果；

图2为利用标记br-or-kasp1对4个橘红色花和4个黄色花材料进行kasp基因分型。

图3为利用标记br-or-kasp1对40个橘红色和40个黄色花dh系进行kasp基因分型。

图4为利用标记br-or-kasp1对y959rf2群体进行kasp基因分型。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实验材料

下述实施例中的大白菜r16-11(杨双娟等，2020，大白菜抽薹相关基因brflc1的kasp标记开发，核农学报，34(2):0265-0272)公众可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的大白菜y510-9(大白菜kasp反应体系的优化与建立，2018，园艺学报)公众可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的涉及的材料名称和对应的市售商品名称以及花瓣颜色如下表所示。

表1.98种白菜材料名称和对应的市售商品名称

实施例1与大白菜花色相关的snp位点的发现

1.橘红花基因br-or的定位

1.1供试材料和性状调查

选取54份橘红色花材料和44份黄色花材料，于开花盛期调查每份材料花瓣的颜色。

1.2dna提取

采用改良ctab法分别提取步骤1.1中54份橘红色花材料和44份黄色花材料的基因组dna。具体步骤为：取新鲜叶片于2.0mleppendorf离心管中，向每管放入钢珠1粒(直径为5mm)，之后加1000μl2％ctab提取缓冲液，在组织破碎仪(型号:德国retschmm400)上以30次/秒的频率破碎1min。65℃温浴1h，待冷却后加入500μl24:1的氯仿/异戊醇抽提液，上下摇动30次，静置分层，离心(12000r/min)10min，吸取400μl上清液至新的1.5ml离心管中，之后加400ul异丙醇沉淀dna，上下混匀后离心(12000r/min)5min，弃上清，然后加70％乙醇750μl清洗dna沉淀，离心(12000r/min)2min，弃上清，室温晾干dna，加入100μlddh2o溶解dna，置于-20℃冰箱中备用。

1.3橘红花基因br-or的定位

将步骤1.2中提取的54份橘红花色和44份黄色花材料的基因组dna分别等量混合，构建橘红花和黄花两个极端基因混池，利用bsa-seq技术对两个混池进行全基因组重测序。以大白菜chiifu-401-42基因组序列(v1.5)作为参考序列，利用bwa(v0.7.17)软件将两个混池的cleanreads分别比对到参考基因组上，使用samtools(v1.9)和bcftools(v1.9)进行snpcalling，获得各样本的snp位点。分别计算橘红花混池和黄花混池的snp-index，然后用橘红花混池的snp-index减去黄花混池的snp-index，得到两个混池之间的△snp-index，以1mb为窗口，50kb为步长进行滑窗分析确定橘红花基因的候选区间。通过显著性分析，将橘红花基因定位在a09染色体36.75-38.25mb区间内(图1)，区间长度为1.5mb。该区间包含前人报道的橘红心基因br-or的候选基因brcrtiso(bra031539)(37,676,627-37,679,733bp)。前人研究关注的性状是大白菜叶球球心颜色性状，并且所用的研究群体为双亲遗传群体，橘红色花和球心色性状完全连锁。本发明关注的性状是大白菜花瓣颜色性状，所用的研究群体是自然群体，利用bsa-seq技术在a09染色体末端快速检测到主效基因，并且包含前人研究的橘红心基因br-or，故认为橘红花色基因和橘红心基因是同一个基因，候选基因都是brcrtiso(bra031539)。

2.橘红色花基因br-or的kasp分子标记

2.1分析橘红花混池和黄花混池在候选基因bra031539编码区域(37,676,627-37,679,733bp)以及启动子区域的snp变异及两个混池之间的△snp-index，发现启动子区域37,676,461bp位置处存在t/csnp变异，对应序列1中的第101位核苷酸，用y表示第101位核苷酸可以为t或者c，将所述snp位点命名为br-or-a09-37676461。所述snp位点br-or-a09-3767646在两个混池之间的△snp-index值为0.71，与橘红色花性状显著相关。

2.2针对snp位点br-or-a09-37676461设计kasp标记br-or-kasp1，包括三条引物：br-or-kasp1fa：5'-gaaggtcggagtcaacggattgtaatatcctgcacttct-3'；br-or-kasp1fb：5'-gaaggtgaccaagttcatgctgtaatatcctgcacttcc-3'；br-or-kasp1r：5'-caaaaaaatgtttggtgaagaac-3'。br-or-kasp1fa和br-or-kasp1fb为两条等位基因特异性正向引物，br-or-kasp1fa为黄花基因型的特异引物，br-or-kasp1fb为橘红花基因型的特异引物，5'端分别加上hex和fam荧光序列标签序列(下划线部分)。br-or-kasp1r为一条共同的反向引物。

2.3选取4份橘红色花材料y959m-5、y698-17、y662-1、y947m-13和4份黄色花材料yw81、y177-12、y510-9、r16-11来验证kasp标记br-or-kasp1。这8份材料均为游离小孢子培养获得的dh(doubledhaploid，双单倍体)纯系材料。

采用改良ctab法分别提取4份橘红色花材料(y959m-5、y698-17、y662-1和y947m-13)和4份黄色花材料(yw81、y177-12、y510-9和r16-11)的基因组dna。分别以4份橘红色花材料(y959m-5、y698-17、y662-1和y947m-13)和4份黄色花材料(yw81、y177-12、y510-9和r16-11)的基因组dna为模板，以步骤2.2中的kasp标记br-or-kasp1为引物进行pcr扩增，扩增条件如下：

kasp-pcr反应在96孔pcr仪(eppendorfmastercyclerpro)上进行，反应体系8μl：1.5μldna(60ng·μl-1)，4μlkaspmastermix(2×)，0.14μl引物混合物(由浓度为100μmol·l-1的crs-kasp1fa、crs-kasp1fb、crs-kasp1r与ddh2o按12:12:30:46的体积比混合得到)，其余用ddh2o补齐。

kasp-pcr扩增程序为：第一阶段94℃变性15min；第二阶段94℃变性20s，61℃退火60s，共10个循环(从第二个循环开始，每个循环降低0.6℃，)；第三个阶段94℃变性20s，55℃退火60s，共26个循环；第四阶段37℃1min。

2.4将步骤2.3中kasp-pcr扩增产物用罗氏荧光定量pcr仪lightcycler480instrumentii(lc480ii)进行终点法荧光信号读取。利用lc480softwarev1.5.1分析snp分型结果：聚合在x轴附近的显示蓝色的基因型为连接fam荧光标签序列的等位基因型，即大白菜基因组中的一个snp位点br-or-a09-3767646核苷酸种类为c的纯合型，命名为基因型cc；聚合在y轴附近的显示绿色的基因型为连接hex荧光标签序列的等位基因型，即大白菜基因组中的一个snp位点br-or-a09-3767646核苷酸种类为t的纯合型，命名为基因型tt；中间显示红色的基因型为两种等位基因的杂合型,即大白菜基因组中的一个snp位点br-or-a09-3767646核苷酸种类为c和t的杂合型，命名为基因型ct。

利用标记br-or-kasp1对4份橘红色花材料y959m-5、y698-17、y662-1、y947m-13和4份黄色花材料yw81、y177-12、y510-9、r16-11进行基因型鉴定，结果如图2和表2所示，4个橘红色花材料的信号点为蓝色，5'末端连接fam荧光标签序列的引物竞争性扩增，聚合在x轴附近，即为大白菜基因组中的snp位点br-or-a09-3767646基因型为cc的大白菜；4个黄色花材料的信号点为绿色，5'末端连接hex荧光标签序列的引物竞争性扩增，聚合在y轴附近，即为大白菜基因组中的snp位点br-or-a09-3767646基因型为tt的大白菜(如图2所示)。br-or-kasp1标记能够显著区分两种纯合基因型，标记开发成功。

表28种不同品种的大白菜的花色与基因的关系

实施例2kasp标记的br-or-kasp1应用1

选取40份橘红花和40份黄色花大白菜材料，通过游离小孢子培养获得的dh(doubledhaploid，双单倍体)纯系材料。

分别按照改良ctab法提取40份橘红花和40份黄色花大白菜材料的基因组dna。依照上述kasp反应体系，利用标记br-or-kasp1对40份橘红色花和40份黄色花大白菜材料进行基因型鉴定。结果显示，标记br-or-kasp1可以显著将所有材料划分为2组，40份纯合橘红色花材料的信号点为蓝色，聚合在x轴附近；40份纯合黄色花材料的信号点为绿色，聚合在y轴附近，如图3所示。对照基因型与花色的关系，如表3所示，基因型和表型完全一致。表明标记br-or-kasp1可以用于橘红色花和橘红色叶球心的分子标记辅助筛选。

表340份橘红花和40份黄色花大白菜材料的基因型与花色

实施例3kasp标记的br-or-kasp1应用

1.y959rf2群体的构建，以橘红花色大白菜y959m-5(p1)作为母本，以黄色花色大白菜r16-11(p2)作为父本，对两个材料进行杂交获得f1代种子，f1材料自交获得f2代种子，选取f2代种子培养得到的植株即为y959rf2群体。

选取y959rf2群体中的31个橘红花色单株和64个黄色花单株，分别改良ctab法提取每株植株的基因组dna。依照上述kasp反应体系，利用标记br-or-kasp1对y959rf2群体的31个橘红花色单株和64个黄色花单株进行基因型鉴定。结果如表4和图4所示。

表4y959rf2群体中31个橘红花色单株和64个黄色花单株的基因型与花色

结果显示，标记br-or-kasp1可以显著将所有材料划分为3组，31个单株的信号点为蓝色，聚合在x轴附近，为纯合橘红色花材料；18个单株的信号点为绿色，聚合在y轴附近，为纯合黄色花材料；46个单株的信号点为红色，聚合在对角线附近，为杂合黄色花材料。所有单株的基因型和表型完全一致，橘红色花单株为隐性纯合基因，聚集在x轴；黄色花单株或者为显性纯合基因，聚集在y轴，或者为杂合类型，聚集在对角线，该标记可以高通量、低成本地用于大白菜橘红色花和橘红色叶球心的分子标记辅助选择。

本发明通过bsa-seq技术检测到与橘红色花基因br-or显著相关的snp位点br-or-a09-37676461，并开发了kasp标记br-or-kasp1，该标记可以高通量检测br-or的基因型，能够高效率、低成本应用于大白菜橘红色花和橘红色叶球心的分子标记辅助育种，具有非常重要的意义。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110>河南省农业科学院园艺研究所

<120>一种与大白菜花色相关的分子标记及其应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>39

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gaaggtcggagtcaacggattgtaatatcctgcacttct39

<210>2

<211>39

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gaaggtgaccaagttcatgctgtaatatcctgcacttcc39

<210>3

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

caaaaaaatgtttggtgaagaac23

<210>4

<211>201

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gacattacggcccaaaattaatgaataatcaacggccacgattagaagtcactaaaataa60

agtttttttctctttttttttttgtaatatcctgcacttcygagtgttcttcaccaaaca120

tttttttgtccttccatgtgatgaaaaccaattttccaaattcggatgaaaggacaacac180

tttttaaatctgtctgaagaa201