专利名称：一种辣椒ap2/erf转录因子基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种辣椒AP2/ERF转录因子基因及其应用，属于植物基因工程技术领域。
背景技术：
长期的进化过程中植物形成了一套复杂的生理生化机制适应外界环境的刺激对其生长和发育带来的影响。在病原菌侵染时，植物可以通过内在的免疫系统产生快速的防御反应。植物固有的免疫系统主要由微生物或病原相关分子模式激发的免疫反应(MAMP-or P AMP-triggered immunity, PTI)及效应蛋白激发的免疫反应(effector-triggeredimmunity, ETI)构成。PTI是通过植物细胞表面模式识别受体(pattern recognitionreceptors, PRRs)介导的在侵染部位产生快速防御反应的应答机制,是一种非寄主抗性。病原菌可通过分泌效应蛋白进入植物细胞阻断PTI，促进自身的侵染和增殖，导致植物产生效应因子激活的感病性(effector triggered susceptibility, ETS)。植物又通过与病原菌协同进化出抗性蛋白(Resistance protein, R protein)特异识别某些病原菌的效应蛋白，激活了效应物引发的免疫反应ETI，产生了更加有效和持久的抗病性反应。PTI和ETI介导的免疫应答均伴随有大量防御反应相关基因表达的改变。研究表明，拟南芥在几种非病原细菌作用下PAMP诱导表达的基因中约1/4编码WRKY、ERF /AP2和zinc finger等转录因子和蛋白激酶。植物的防御反应过程是由复杂、相互关联的信号网络所调控的。植物内源激素(SA、JA, ABA和乙烯等)，离子流，活性氧，MAPK级联反应及转录因子在植物抗逆防御反应信号网络中起重要作用。植物抗病过程中特定的防御反应基因相关抗逆途径的启动或一些正常表达的基因的暂时关闭都是由复杂的信号网络所调控的。植物对病原菌及各种逆境的应答过程是以对逆境信号的感知为起始，最终信号传递至细胞核，在分子水平上表现为胁迫相关基因适时适量的诱导或抑制表达。这一过程中转录因子在信号传递及防御反应相关基因的表达调控过程中起重要作用。转录因子可以通过与特定基因启动子上的顺式作用元件结合或与其他相关蛋白互作从而调整基因的表达。大量研究表明AP2/ERF，WRKY, NAC,bZIP/HD-ZIP等转录因子超家族成员参与了植物响应包括病原菌在内的逆境的防御反应过程，这些转录因子的过量表达不仅可以显著改善植物对特定逆境的抗性，还可以通过同时激活多个下游抗病基因、抗逆基因的表达，达到对植物综合抗性改良的目的。因此，对转录因子的结构、功能及调控机制的分析在植物抗逆基因工程中具有重要的应用价值。辣椒annuum L.)是一种重要的爺科蔬菜和工业原料作物,在我国其种植面积仅次于大白菜，但产值却最高。在南方地区由于多见高温高湿天气，包括青枯病在内的毁灭性土传病害发生特别严重，并且具有发病速度快、防治困难、为害严重的特点，对辣椒的产量和质量造成极大影响，轻则减产，重则绝收。仅利用常规育种手段选育品种耗时较长，效率较低，而且育成抗病品种的抗性丧失快，而培育和推广应用广谱、高效、持久抗性的抗病品种是生产中解决辣椒病害问题最为经济有效的对策，开展辣椒抗病分子机制研究则是有效开展辣椒抗性遗传改良的重要基础。APETALA2/ETHYLENE RESPONSE FACTOR (AP2/ERF)转录因子在植物中以多基因家族的形式存在，不同成员在植物生长发育、对激素及生物和非生物逆境的应答过程起重要的调控作用。所有的ERF (Ethylene response factor)转录因子均包含一个由58 70个氨基酸残基组成的AP2/ERF保守功能域。根据保守功能域的相似性，sakuma等人将拟南芥AP2/ERF超家族划分为五个亚家族，DREB，ERF, AP2, RAV及其它，其中ERF亚族65个成员包括了所有与植物抗病相关的AP2/ERF转录因子。当病原菌侵染时，ERF转录因子可以以单体的方式同GCC-box结合激活防御反应相关基因的表达。GCC-box包含有保守的A￡CC￡C￡C基序，最早发现于乙烯诱导的PR基因启动子区域的乙烯响应元件(ethylene response element, ERE)中。随后,在大量病程相 关基因、SA、ET或JA诱导表达的基因启动子区域均发现有相应的基序。部分ERF类转录因子还可以同冷、高盐、和干旱诱导基因启动子区域的CRT/DRE元件(CRT: C repeat, DRE:dehydration-responsive element,保守核心序列为A/GCCGAC)结合调节相应基因的表汰。与顺式作用元件结合的特点表明该转录因子家族成员可能单独或同时参与植物对生物及非生物逆境的胁迫应答过程。例如，番茄ERF转录因子TSRF1、烟草NtERF5结合GCC-box，转基因植株分别增强了对细菌性病原菌和病毒的抗性。辣椒CaPFl，CaERFLPl可以同时与GCC-box及CRT/DRE顺式作用元件结合，两个基因的过量表达可增强转基因植株对病原菌侵染和非生物逆境的抗性[26，36]。大量研究表明植物内源激素如水杨酸(salicylic acid, SA)、茉莉酸(jasmonicacid, JA)及乙烯(ethylene，ET)等防御反应相关信号分子在植物抗逆信号网络起重要作用。ERF转录因子家族成员在各种植物激素介导的信号转导途径网络中起重要调控作用。研究表明，ERF转录因子可以同时受ET和JA诱导，参与植物对病原菌的广谱抗性。部分ERF转录因子还同时参与了 SA，JA/ET信号途径。如A汾 /7，番茄汾F基因竹#及7ii7同时受SA，JA, ET的诱导，作为正调节子参与相应的信号通路。此外，ERF转录因子还参与了一条未知的抗病信号转导途径。过量表达烟草植株显著增强了对烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)的抗性,而该基因的表达水平不受SA, JA, ET影响。但是迄今为止，对ERF转录因子的功能和作用机制的研究还主要集中在水稻、拟南芥、烟草等少数模式植物上，对于非模式植物辣椒中ERF转录因子参与的植物抗病过程及调节机制的研究还相当有限，仅有少量的基因被报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种辣椒AP2/ERF转录因子基因及其在烟草抗青枯病基因工程中的应用，将大力促进包括烟草在内的茄科植物抗青枯病基因工程的发展。本发明人从SA处理的辣椒均一化cDNA文库中分离获得了一个ERF阳性克隆，为编码AP2/ERF转录因子的基因，将其命名为CaERF105基因，CaERF105 C端含有两个特殊的MAP激酶磷酸化位点。荧光定量PCR分析表明该基因的表达水平受SA、乙烯利、茉莉酸甲酯和青枯菌的诱导。本发明提供的辣椒AP2/ERF转录因子基因，其CDNA序列如SEQ ID No. I所示。所述基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示。
所述的辣椒AP2/ERF转录因子基因在烟草抗青枯病基因工程中的应用。序列表中的序列I由1052个核苷酸组成，自5’端第I至111位核苷酸为5’端非编码区(5’ -UTR)，第112位至927位核苷酸为编码序列，第928至930位核苷酸为终止密码子，第931至1052位核苷酸为3，端非编码区(3’ -UTR)。序列表中的序列2由292个氨基酸残基组成，包含一个AP2/ERF结构域(自序列2的氨基末端第123至181氨基酸残基，一个ERF家族IX b亚族特有CMIX2基序(自序列2的氨基末端第I至19氨基酸残基)及两个MAP激酶磷酸化位点(CMIX5和CMIX6)(分别为自序列2的羧基末端第255至262氨基酸残基及自第235至238氨基酸残基)。含有上述基因的重组表达载体也属于本发明的包含内容。本发明提供的辣椒CaERF105基因表达水平受青枯菌侵染及包括SA，JA, ETH在内植物激素诱导表达。 本发明提供的重组表达载体是经Gateway技术获得的。具体是将辣椒CaERF105基因经BP反应转入pDONR 入门载体后再经LR反应导入pK7WG2质粒所获得的。将所述超表达载体转化EHA105农杆菌，采用叶盘遗传转化法侵染烟草得到转基因烟草，可提高转基因烟草对青枯病侵染的抗性。本发明的显著优点
与野生型烟草相比，本发明的辣椒基因在烟草中的超表达可显著提高转基因烟草的抗青枯病能力，在茄科植物抗青枯病基因工程中具有十分重要的应用价值。
图I为辣椒CaERF105的序列分析；辣椒CaERF105与烟草NtERF5 (Q40478. I)，番茄 S1ERF5 (AAS72389),拟南芥 AtERF5 (BAA97I5Ll)及 AtERF105 (Q8VY90. I)氨基酸序列的比较，其中双上划线表示保守的DAN结合域(AP2/ERF domain);上划线氨基酸残基PKKRSF所示为推定的核定位信号；星号所示为ERF家族特有的丙氨酸和天冬氨酸；点所示为保守的WLG基序；方框所示为ERF家族IX b亚族特有CMIX2，CMIX5，CMIX6保守序列。图2为CaERF105在包括SA’ MeJA, ETH在内植物激素及青枯菌侵染后的表达模式分析；
图3为CaERF105与GCC-box顺式作用元件的瞬间表达分析；
图4为CaERF105的亚细胞定位分析；
1，2为荧光检测；3，4为明场图片；5，6为叠加图片。图5为植物表达载体pK7WG2- CaERF105 ；
图6为35S:: CaERF105与野生型植株对青枯菌抗性的比较；
野生型烟草植株及35S: : CaERF105转基因植株在IO8 cfu/mL青枯菌浸根处理21 d后的表型分析。
具体实施例方式以下实施例并不仅限于本发明，目的在于更好的理解本发明。下述实施例中所涉及的试剂如无特殊说明，均为常规生化试剂。辣椒{Capsicum annuum L.)为福建省本地品种选育的自交系。
实施例I、CaERF 105全长cDNA的分离
以拟南芥 ERF104 (At5g61600)的氨基酸为探针，从 GenBank (www. ncbi. nlm. gov/)中比对获得辣椒EST序列，通过DNAMAN进行重叠群分析，分别获得包含有ERF蛋白保守域的共有序列，应用PRMER5软件根据共有序列设计特异性引物。在5 mM SA处理的辣椒均一化cDNA文库(文库构建以SA处理O h，l h，3 h，6 h，12 h，24 h，48 h辣椒植株总RNA等量混合为初始材料)中检测到有目的条带的引物如下forward -F: 5 ; -CAACGAACGCAAGCCATCT -3 ;，reverse -R:5 ; -GCCTTAGCCGCATCCAC-3 ;。扩增循环数为35个循环，PCR反应条件为94°C预变性5 min，94°C变性30 s，52°C退火30 s,72°C延伸20 s,72°C延伸10 min。依据(Munroe et al. , 1995)等人的方法，基 于PCR技术利用96孔板从文库中获得目的基因阳性克隆。阳性克隆依据SMARTtmcDNA文库构建试剂盒操作说明进行内删除，将λ TriplEx2噬菌体质粒转化为pTriplEx2质粒。以基因异性引物和载体两侧引物分别检测克隆入pTriplEx2载体的阳性克隆的大小，并委托上海英骏生物技术公司测序。载体两侧引物如下
forward, 5' -CTCGGGAAGCGCGCCATTGTG-3'reverse, 5' -ATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGCC-3'
最终获得序列表中序列I所示的核苷酸序列。CaERF105由1052个核苷酸组成，自5’端第I至111位核苷酸为5’端非编码区(5’ -UTR)，第112位至927位核苷酸为编码序列，第928至930位核苷酸为终止密码子，第931至1052位核苷酸为3’端非编码区(3，-UTR)ο编码分子量为30. 54 kDa的蛋白。序列表中的序列2由292个氨基酸残基组成，包含一个AP2/ERF结构域(自序列2的氨基末端第123至181氨基酸残基，一个ERF家族IX b亚族特有CMIX2基序(自序列2的氨基末端第I至19氨基酸残基)及两个MAP激酶磷酸化位点(CMIX5和CMIX6)(分别为自序列2的羧基末端第255至262氨基酸残基及自第235至238氨基酸残基)。利用Blastn (http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)进行序列同源性比较，DNAMAN 软件 SubLoc I. O(http://www. bioinfo, tsinghua. edu. cn/SubLoc/), WoLFPSORTChttp: //wolfpsort. org/)及 PredictproteinChttp: //www. predict protein, org/)对基因序列及编码的蛋白质结构及亚细胞定位预测。利用Mega5. 01软件进行分子进化分析，采用邻接法(Neighbor-Joining, N-J)构建系统发育树,使用1000次重复自展检验评估系统发育树拓扑结构的稳定性。结果表明CaERF105与番茄S1ERF5 (AAS72389)同源性为67%,与烟草NtERF5 (序列号为BBA07323)同源性为65%，与拟南芥ERF105转录因子(序列号At5g51190)之间有52%的同源性(图I)。实施例2、CaERF105表达模式分析
实验材料为25 d生长期一致的辣椒植株，分别以5 mM水杨酸(Salicylic acid，SA)、0. I mM茉莉酸甲酯(methyl-jasmonic acid,MeJA)溶于10%乙醇溶液喷洒叶片，(相应的对照为10%乙醇溶液)。以10 mM乙烯利(Eth印hon)溶于水喷洒叶片，相应对照为水。取八周大的辣椒植株以108cfu/mL青枯菌进行灌根处理。处理植株的叶片和相应的对照植株叶片在不同时间(0-48/96 h)采集，并立即液氮速冻置于_70°C以供后续分析。选用高质量的等量RNA参照TaKaRa公司PrimerScript RT reagent Kit进行反转录。反转录后的单链cDNA稀释10倍后取I μ L作为模板。内参基因为辣椒acii/ 基因。采用ABI7500荧光定量PCR仪进行实时定量RT-PCR分析，每个样品进行三次重复。20 μ LPCR 扩增体系为 10 μ L 2 X SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa，大连)，正反向引物为 O. 2 μ M,模板cDNA为5-10 ng，加入ROX Reference Dye II(50X)进行校正。PCR反应条件为95°C30 s，95°C 5 s，60°C 34 s，共40个循环。相对表达量采用2_ΔΔΜ (Livak)法计算。其中各种处理下每一个时间点的AACt=ACT (测定样本)-ACT (校准样本)，ACT (测定样本)=CT (测定样本目标基因)-CT (测定样本内参基因)，ACT (校准样本)=CT(校准样本目标基因)-CT (校准样本内参基因)。
如图2所示，本发明提供的辣椒基因表达水平在青枯菌处理下24及36h表达量与同时间点对照相比显著提高。在5mM SA处理下，基因表达水平分别在12及24 h时与对照比显著提高。外源MeJA作用下6 h前，基因表达量与对照相比无明显差异，在处理6 h时达到最大值，12 h时与对照相比同样为显著提高。与SA和MeJA处理不同，乙烯利处理下除6 h外，基因表达水平在I h至24 h间与对照相比都为显著提高，且在处理3 h达到最大值(约为对照组的7倍)。说明本发明提供的辣椒CaERF105基因很可能参与了辣椒对青枯菌的防御反应过程。实施例3、CaERF105与GCC-box及CRT/DRE顺式作用元件的瞬间表达分析
本发明采用BiolisticPDS-1000/He (BioRad)基因枪进行基因枪轰击法进行瞬间表达分析。撕取洋葱表皮内表皮(I cmX Icm)平铺于固体MS上培养(2%琼脂，3%蔗糖，pH5. 8)，25°C黑暗下培养I d。10 μ g包含有目的基因的PK7WG2质粒与10μ g pBT10-GUS-2GCC质粒同时轰击洋葱表皮，铺于MS上黑暗下培养18 h后经X-Gluc染色显微镜下观察并拍照。如图3所示，经X-Gluc染色后，CaERF105同pBT10_GUS_2GCC共同转化的洋葱表皮可以检测到⑶S基因的表达，而与ρΒΤΙΟ-GUS共同转化的洋葱表皮检测不到⑶S基因的表达，表明CaERF105可结合GCC-box顺式作用元件。pBT10-GUS-2GCC载体构建方法如下
设计两条含2XGCC盒的反向互补寡核苷酸链GCC-F 5 ; - CTAGTdO^mAAGAGGACCCAGAATG46O7( CrAAAGAGGACCCAGAATT -3 ; , GCC-R 3 ; - CTAGAATTCTGGGTCCTCTTTgg^g^tTGATTCTG GGTCCTCTTKKtKKtTGA -5 ;(下划线为添加的SpeI和XbaI酶切位点，斜体所示为GCC-box或CRT/DRE核心序列)。分别将两条寡核苷酸链溶于pH8. O的TE至终浓度为100 μ M，并以1:1的浓度混合，95°C变性30 s移除所有可能的二级结构，72°C 2 min,37°C
2min，25°C 2 min，缓慢降至室温，冰上储存，即为带有粘性末端的双链DNA。以TE 1/100稀释至0.5 4 11后与及^ !11，油<31双酶切后的？81'10-6^载体连接。连接体系为lyL双酶切后的 ρΒΤΙΟ-GUS 载体(50 ng/yL),l μ L 退火稀释的双链 DNA(0. 5 μ Μ), I. 5 μ LlOXT4DNA ligase buffer,0. 5 μ L BSA (10 mg/mL),10. 4 μ L nuclease-free H2O,O. 6 μ L T4DNA ligase (350 U/yL)。之后将反应产物转化DH10B感受态。以所得质粒为模板进行PCR验证。经测序无误后提取质粒用于瞬间表达分析。实施例4、CaERF105亚细胞定位分析
本发明采用实施例3中所述方法。将10 Ug包含有目的基因的pMDC83-GFP质粒与10mg/mL钨粉包埋转化洋葱下表皮细胞。GFP荧光波长为488 nm，取白光与蓝色激发光的同一视野下细胞进行图像采集，并以PMDC83空载体作为阴性对照。如图4所示pMDC83-GFP质粒单独转化时在蓝色激发光下GFP荧光弥散的分布与整个胞质和细胞核，相反35S::CaERF105-GFP准确的定位于的细胞核中，表明基因表达产物定位于细胞核。含仏汾的防基因的pMDC83-GFP质粒具体实施方案同实施例4。实施例5、植物表达载体pK7WG2- CaERF105的构建
本发明采用gateway技术(Walhout et al. , 2000),构建双子叶植物转基因用超表达载体。双子叶植物过量表达载体采用PD0NR207作为入门载体，目的载体为带有2 X CaMV35S启动子的pK7WG2载体(实施例4中为pMDC83质粒)，扩增CaERF105 ORF区域采用的引物为
forward, 5' - AAAAAGCAGGCT TCATG GGTTCCCCACAAGAGAA -3/ ;reverse, 5' - AGAAAGCTGGGTCTT ATATCATGACAAGCTGAG -3/
外侧接头引物为
attBl: 5 ; - GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3 ;attB2: 5 ; - GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT -3 ;
以筛选获得的阳性克隆质粒为模板，以forward/reverse为引物(10 μ M),通过Primer STAR HS DNA polymerase (Takara)进行扩增，在目的基因两侧加入attB接头。25 μ LPCR体系扩增程序为95°C预变性2 min，94°C变性15 s，55°C退火30 s，68°C延伸60s/90 s，扩增循环数为10个循环。取第一轮扩增的产物10 μ L为模板，以attBl/attB2接头引物进行第二套扩增程序，50 μ LPCR体系扩增程序为95°C预变性I min，94°C变性15 s,45°C退火30 s，68°C延伸60 s/90 s，扩增循环数为5个循环；94°C变性15 s，55°C退火30s，68°C延伸60 s/90 s，扩增循环数为20个循环，68°C延伸5 min。在1%琼脂糖凝胶上回收attB-PCR产物。通过BP反应将目的基因克隆到入门载体pD0NR207。8 μ L反应体系为attB-PCR 产物 15-150 ng, pD0NR207 质粒 150 ng, BP Clonase enzyme mix 2 μ L TE 补至8 UL0 25°C温浴I h过夜后加入I 4 1^蛋白酶1(，371消化10 1^11，之后将反应产物转化DHlOB感受态。带有目的基因的pD0NR207入门克隆经测序确认无误后进行LR反应将目的基因克隆到目的载体PMDC32。10 μ L反应体系为入门克隆50-150 ng，pMDC32质粒150ng, TE 补至 8 μ L , LR Clonase enzyme mix 2 μ L。25°C温浴 I h 后加入 I μ L 蛋白酶K，37°C消化10 min，之后将反应产物转化DH10B感受态。以所得质粒为模板进行PCR验证。实施例色、CMRFW5基因烟草遗传转化及抗性分析
采用液氨冻融法将包含有目的基因ORF区域的pK7WG2质粒转化农杆菌EHA105。采用叶盘遗传转化法转化长于MS培养基中两个月烟草K326 (I cmXl cm)。在含有卡那霉素(100 mg/mL)的MS筛选培养基(MS，6-BA1. 5 mg/L, IΑΑ0. I mg/L)上对抗性苗进行筛选，提取正常分化的植株基因组RNA进行PCR检测，获得转基因株系。所有株系均用套袋自交收获T1代转基因种子。利用T1代转基因种子进行转基因烟草表型分析与功能鉴定。本发明应用青枯病病原菌(取自福清地方辣椒青枯病菌)菌体经活化后以10 mMMgCl2重悬至IXlO8 cfu/mL。野生型烟草植株及^仍.·.·转基因植株通过浸根处理21 d后观察表现发现，相对于转基因植株，野生型植株发生严重的萎焉症状(图6)。
权利要求
1.一种辣椒AP2/ERF转录因子基因，其特征在于所述基因的cDNA序列如SEQ ID No. I所示。
2.根据权利要求I所述的辣椒AP2/ERF转录因子基因，其特征在于所述基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示。
3.—种如权利要求I所述的辣椒AP2/ERF转录因子基因在烟草抗青枯病基因工程中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种辣椒AP2/ERF转录因子基因及其应用，属于植物基因工程技术领域。所述基因的cDNA序列如SEQIDNo.1所示，所述的辣椒AP2/ERF转录因子基因在烟草抗青枯病基因工程中的应用。与野生型烟草相比，本发明的辣椒CaERF105基因在烟草中的超表达可显著提高转基因烟草的抗青枯病能力，在茄科植物抗青枯病基因工程中具有十分重要的应用价值，将大力促进包括烟草在内的茄科植物抗青枯病基因工程的发展。
文档编号C07K14/415GK102766639SQ20121026781
公开日2012年11月7日 申请日期2012年7月31日 优先权日2012年7月31日
发明者何水林, 党峰峰, 周芦粮, 官德义, 林明, 林菁, 虞露, 赖燕 申请人:福建农林大学