细胞穿膜肽hPP10及其用途的制作方法

专利名称：细胞穿膜肽hPP10及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医学领域，具体讲，涉及一种新型人源性细胞穿膜肽及其用途。
背景技术：
随着人类基因组计划的完成和蛋白质组学的兴起，人们发现越来越多的生物分子比如蛋白质、多肽、核酸等均有可能成为治疗药物。但是与传统药物不同的是，这些治疗分子在体内稳定性低、需要在胞内发挥功能的分子难以进入细胞，因而会限制其作为药物的推广应用。故开发能有效携带这些治疗性生物大分子进入靶细胞、经济、安全的载体系统是亟需解决的问题。近年来，非病毒药物运输载体以其安全性、低毒性、低免疫反应等优点被寄予厚望。迄今比较常用的生物大分子细胞内导入方式有如电穿孔、脂质体转染和有机高分子纳米颗粒等可能存在着安全隐患如对细胞的毒性作用、胞内释放困难、难于组装及操作，难于应用到个体等这样那样的缺点。因此寻找新型的、理想的非病毒药物输送系统引起了学者们的广泛兴趣(图21)。在过去的20多年间，将核酸、多肽、蛋白等具有治疗作用的生物活性大分子跨膜转运至细胞内技术的基础研究取得了突破性进展。国内外学者在对一些病毒感染特性的研究中相继发现了一类蛋白结构域，如=HIV-ITat (48 60)、VP22(267 300)，以及果蝇蛋白ANTP(43 58)等具有介导异源蛋白、寡聚核酸、金属螯合物等生物活性大分子直接跨过细胞膜进入胞浆和核内的功能，这一类富含阳离子、具有穿膜功能的短肽被称之为细胞膜穿透妝(cell-penetrating peptides,CPP)、穿膜妝或蛋白转导域(protein transduction
domains, PTDs)。1988年Green和Frankel等首次发现TAT-人免疫缺陷病毒(HIV)
的转录调节蛋白可以穿透细胞膜/核膜进入细胞浆/细胞核，随后的研究发现，该蛋白第48-60位氨基酸残基(YGRKKRRQRRR)形成的肽段即可完全发挥其穿膜功能。以后又相继发现了多个源自病毒或其他生物的CPP,如I型单纯疱疫病毒(herpes simplex virustype 1，HSV-1)蛋白的VP22、果妮同源触角蛋白(drosophila hemeoprotein antennapediatranscription protein, ANTP)、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)的前 S 抗原等。依据其来源不同可将已经发现的CPP大致分为两类一类为如上面提及的TAT、VP22、ANTP 和前S抗原来源于病毒的短肽等；另一类为根据天然CPP的特点人工合成的短肽如多聚精氨酸、MPG、PEP-U MAP、transportan和各种基于不同信号序列合成的肽段等。CPP能在体外或体内作为载药多肽，介导一系列生物活性分子如DNA、SiRNA、多肽、蛋白质甚至纳米颗粒等进入细胞，发挥各自的生物学效应。这些CPP因其本身具有低毒副作用、不干扰所携带生物大分子活性等，而被广泛用于体外或/和体内向细胞内运送生物活性分子，尤其是在抗肿瘤治疗的应用研究方面更是引人注目。CPP研究在基础生物学和应用研究上都具有极大意义，作为一种有效的胞内运载工具，有着广泛的应用前景(图22)。然而来源于病毒或其他种属生物蛋白结构域的CPP，在临床应用上可能仍然存在一定的安全隐患，比如可能的细胞毒性和免疫原性问题。人们对TAT作为CPP进行了大量研究，腹腔注射Tat- β -半乳糖苷酶，能进入小鼠各种脏器组织，甚至可以透过血脑屏障进入脑组织。但由于TAT源于HIV病毒蛋白而恐存有安全忧患，一直未能用于临床研究。另有报道称，应用TAT携带药物的上呼吸道喷雾引发了严重的肺部病理反应。可见，针对不同治疗需要，开发更为安全的、新型穿膜肽一一人源性穿膜肽(hCPP)是非常必要的。2002年，Beck-Sickinger AG小组开创性地发现了第一个人源性穿膜肽--来源
于人降血钙素(hCT)的第9-32的残基。随后相继报道的人源性穿膜肽还有来自于hCLOCK蛋白(一种与生物节律调节有关的蛋白，2004年)、Hph-l ( 一种人源转录因子，2006年)、Bag_l蛋白(一种可与Bcl-2相互作用的激活糖皮质激素受体的蛋白，2006年)、pl4ARF蛋白(一种人抑癌基因蛋白，2008年)、人乳铁蛋白(2009年)、人Cytc77-101及Cytc86_101 (2010年)和TCTP蛋白(来源于人翻译控制肿瘤蛋白氨基末端10个氨基酸残基，2011年)的CPP等。与其他物种蛋白来源的CPP相比，人源性CPP弓丨起人体的免疫反应的可能性小，潜在的不安 全因素相对少，作为人类疾病治疗的药物载体，具有绝对优势，有着更广阔的开发、应用前
旦
-5^ OFutaki S等发现穿膜肽的穿膜能力与多肽序列中精氨酸残基的数量和位置有很大的相关性。我们在从事细胞穿膜肽研究中，通过对蛋白数据库中一级结构的检索、分析发现人源性的赖氨酸特异性去甲基化转移酶4A内的一段长为20个氨基酸的短肽的一级结构富含属于碱性氨基酸的精氨酸和赖氨酸，分布着很强的正电荷，这与大多数已知CPP的结构特点很相似，继而分析其二级结构，发现它可形成经典的α-螺旋构象。推测这段短肽可能是具有自主穿膜功能的新型的人源性穿膜肽。我们继而合成了这段短肽并命名为hPPIO，观察了其对培养细胞的穿膜效率，细胞毒性及穿膜机制，同时还观察、评估了其向细胞内递送绿色荧光蛋白(GFP)和质粒DNA的效果，为hPPIO作为一种新型人源性药物运输载体的开发提供了科学依据。

发明内容
本发明的目的在于提供一种新型人源性细胞穿膜肽hPPIO以及将其用作细胞内药物运输载体的用途。一方面，本发明提供了一种新型人源性细胞穿膜肽hPPIO。hPPIO是源于人类细胞核蛋白，赖氨酸特异性去甲基酶4A (lysine-specific demethylase 4A)的一段多肽序列，hPPIO的多肽序列如下Lys-Ile-Pro-Leu-Pro-Arg-Phe-Lys-Leu-Lys-Cys-Ile-Phe-Cys-Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg (赖氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-亮氨酸-脯氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-半胱氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-半胱氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-精氨酸-赖氨酸-精氨酸)。另一方面，本发明提供了将所述新型人源性细胞穿膜肽hPPIO用作细胞内药物运输载体的的用途。我们首次发现这一肽段具有穿透细胞膜的功能，并可携带蛋白、核酸(DNA质粒)等跨膜进入多种细胞(包括贴壁培养细胞、悬浮培养细胞以及原代培养细胞等)内，是一种极具开发前景的蛋白、核酸等生物活性分子的跨膜运输载体。本发明的优点在于，与其他生物蛋白来源的CPP相比，人源性CPP — hPPIO引起人体的免疫反应的可能性小，潜在的不安全因素相对少。因此，作为临床应用的药物分子载体有着更为广阔的应用前景。


图I是本发明新型人源性穿膜肽hPPIO的二级轮状结构示意图。图2是本发明新型人源性穿膜肽hPPIO的二级结构中存在的螺旋及叠折分析示意图。图3是本发明新型人源性穿膜肽hPPIO的原核表达及纯化结果的电泳照片。其中M :蛋白分子量标志I pET15b-hPP10质粒转化细菌IPTG诱导前裂解液2 pET15b-hPP10质粒转化细菌IPTG诱导后裂解液3 :纯化后的 hPP10_6xHis图4是荧光标记的hPPIO ChPPlO-FITC)穿膜进入不同肿瘤细胞后胞内荧光分布情况。图5是hPP10-FITC穿膜进入原代人外周血淋巴细胞后胞内荧光分布情况。图6不同浓度hPP10-FITC的穿膜效率。A :ECV_304胞内荧光镜下观；B :ECV_304胞内荧光定量。图7表示孵育时间对hPP10-FITC入胞的影响。A hPP10-FITC短时间孵育后的荧光定量；B =TAT-FITC短时间孵育后的荧光定量；C hPP10-FITC长时间孵育后的荧光定量； D =TAT-FITC长时间孵育后的荧光定量。图8表示血清对hPP10-FITC穿膜效率的影响。图9表示不同细胞经DMSO预处理对hPP10_FITC穿膜效率的影响。A =DMSO预处理各种不同类型细胞后胞内荧光分布情况DMS0预处理不同培养细胞后的胞内荧光定量。图10表示原代淋巴细胞经5%DMS0预处理对hPP10-FITC穿膜效率的影响。A :DMS0预处理原代培养小鼠脾淋巴细胞后胞内荧光分布情况；B :DMS0预处理原代培养人外周血淋巴细胞后胞内荧光分布情况。图11表示hPPIO介导质粒pDsRed转染的效果。图12表示pcDNA3. I-Gluc重组质粒构建提取和BamH I/Xbal I的双酶切鉴定。泳道I :pcDNA3. I-Gluc ;泳道 2 pcDNA3. I-Gluc 的 Nco I/BamH I 的双酶切。图13表示hPPIO介导质粒pcDNA3. I-Gluc转染的效果。图14表示pET15b-hPP10_GFP重组质粒构建和Nde I/BamH I的双酶切鉴定。泳道I :pET15b-hPP10-GFP ;泳道 2 :pET15b-hPP10_GFP 的 Nde I/BamH I 的双酶切。图 15 表示 SDS-PAGE 分析 IPTG 诱导 pET15b_GFP、pET15b_hPP10_GFP 在 Rosetta细菌中的表达及纯化。泳道3和4分别为纯化的GFP和hPP10_GFP融合蛋白；泳道2和5分别为GFP和hPP10_GFP质粒转化细菌经IPTG诱导；泳道I和6分别为GFP和hPP10_GFP质粒转化细菌未经IPTG诱导。
图16表示hPP10-GFP融合蛋白穿膜进入L929细胞的分布情况。图17表示hPP10-GFP融合蛋白穿膜进入原代人外周血淋巴细胞的分布情况。图18表示MTT检测hPP10-FITC处理后对细胞活力的影响。图19表示不同温度下DMSO预处理后荧光短肽在胞内的含量。

图20表示不同内吞抑制剂对hPPIO穿膜效率影响。A :肝素处理各种不同类型细胞后胞内荧光强度；B :氯喹预处理不同培养细胞后胞内荧光强度；C :氯丙嗪处理不同培养细胞后的胞内荧光强度。 图21是新型治疗分子胞内递送策略示意图。图22是细胞穿膜肽(CPP)及其可携带入胞的生物药物的工作原理示意图。
具体实施例方式下面将结合具体实施方式
对本发明的方案做更详细的说明。实施例I、CPP —级结构、二级结构分析，预测、鉴定新型人源性CPP 二级结构分析采用了 emboss的在线分析程序(其分析程序请参见网页http://emboss, bioinformatics, nl/cgi-bin/emboss/pepwheel 在线分析多妝的轮状结构;http://emboss, bioinformatics, nl/cgi-bin/emboss/ 在线分析二级结构的螺旋、叠折等)。hPPIO的轮状结构示意图，螺旋、叠折结构示意图分别如图I和图2所示。化学合成绿色荧光标记的hPPIO :FITC-Lys-Ile-Pro-Leu-Pro-Arg-Phe-Lys-Leu-Lys-Cys-Ile-Phe-Cys-Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg (hPP10-FITC)和无绿色荧光标记hPPIO Lys-Ile-Pro-Leu-Pro-Arg-Phe-Lys-Leu-Lys-Cys-Ile-Phe-Cys-Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg(hPPIO)纯化定量、冷冻保存备用。2. hPPIO的合成途径有两种I)化学合成；2)基因工程表达。hPPIO源于自然蛋白，可以在实验室水平或工业水平进行合成。2. I化学合成方法此种方法是选择羧基树脂(Fmoc-Tyr (tBu)-Wang resin),采用固相Fmoc法合成。具体合成步骤如下(I)用Fmoc基团对α -氨基进行保护的赖氨酸通过一个支臂连结到不溶性载体王氏树脂(Wang resin)上；(2)用TFA(三氟乙酸)溶液洗涤赖氨酸一支臂一树脂，使α-氨基脱保护；(3)将第二个预先用适当的缩合剂DCC活化的α -氨基保护的异亮氨酸通过耦联反应与赖氨酸形成共酯连接上去；(4)用TFA(三氟乙酸)溶液洗涤异亮氨酸一支臂一树脂，使α-氨基脱保护；(5)将第三个预先用适当的缩合剂DCC活化的α -氨基保护的脯氨酸通过耦联反应与异亮氨酸形成共酯连接上去。重复进行上述脱保护、耦联，直到耦合上最后一个氨基酸——精氨酸，脱去Fmoc保护基团，合成完成。
(6)将切割试剂加入到肽——树脂中，把肽链从树脂上切割下来，同时也将各个氨基酸上的侧链保护基团从肽链上切割下来，加入乙醚，沉淀多肽，获得多肽粗品。运用HPLC/MS进行多肽的鉴定和纯化，最终得到所需多肽。2. 2基因工程表达法采用原核表达方法，具体操作如下(I)设计编码hPPIO的两条单链cDNA，两侧带有NdeI和XhoI酶切位点，交由上海生工公司合成单链寡聚核苷酸链，再将两条单链DNA等量加入水溶液中，经95°C 5分钟，自然冷却至室温使其完成退火，形成互补的双链DNA片段(hPPIO)；(2)利用Ndel/Xhol两种限制性内切酶进行双酶切，37°C温育两小时，将表达质粒pET15b (购自 Novagen)线性化； (3)进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外透射仪的长波紫外光照射下，切胶回收含线性化质粒pET15b的条带。瞬时离心，将凝胶集中至管底，依切胶回收试剂盒内的操作说明完成切胶回收；(4)将回收、纯化的线性化质粒DNA片段和退火后的穿膜肽cDNA片段(hPPIO)分别进行琼脂糖凝胶电泳，确定连接比例，置于16°C水浴箱中温育过夜连接；(5)用CaCl2法制备DH5 a感受态细胞，用热休克法以上述连接产物pET15b_hPP10转化感受态细胞，经O. lg/L氨苄青霉素琼脂平板37°C过夜筛选后，挑取单菌落接种于含氨苄青霉素LB液体培养基中，37°C振荡培养过夜；(6)离心沉淀收集扩增转化细菌，用碱裂解法提取重组质粒，筛选成功构建的阳性克隆pET15b-hPP10，酶切并测序验证；(7)将验证正确的重组原核质粒pET15b_hPP10转化Rosetta感受态细菌。经O. Ig/L氨苄青霉素琼脂平板37°C过夜；(8)挑取单克隆菌落接种于含氨苄青霉素LB培养基，37°C振荡培养过夜；(9)用15ml无菌离心管装3. 8ml Amp (+)LB液体培养基，接种O. 2ml对数生长期的菌悬液(I: 20)。37°C，250rpm继续培养3h ；(10)于对数生长期细菌培养物中加入40μ I O. IM IPTG至终浓度I. OmM，37°C，250rpm继续培养；(11)在加入IPTG后6h取样200 μ I菌悬液；(12)离心收集沉淀,用等体积IXSample Buffer重悬,沸水浴5min。制备的菌体全蛋白上样样品；(13) SDS-PAGE检测重组蛋白的表达情况，如图3。确认的表达及纯化。3. hPPIO具有很强穿膜效能3. IhPPlO-FITC具有显著穿膜特征并在胞内分布均匀；3. I. IhPPlO-FITC可以穿膜进入体外培养的肿瘤等细胞并在细胞内均匀分布，具有显著穿膜特征；取对数生长期的四种培养细胞疋(^-304、抱1^、!1印62、？03，依1\105个细胞/孔的密度接种于12孔板常规培养，设实验组及对照组；至对数生长期(80%密度)时，换成无血清的RPMI-1640培养液继续培养I小时；加入终浓度10 μ M hPP10-FITC,常规培养I小时；弃去培养液，PBS洗涤3次；
荧光显微镜下观察培养细胞内荧光及其胞内定位情况。结果见图4，荧光显微镜观察发现，未经hPP10-FITC处理的各种细胞内无绿色荧光。在经hPP10-FITC温育后，可在胞内见到明显绿色荧光，且这四种不同细胞系均有明显胞内荧光，提示hPP 10穿膜进入细胞没有明显细胞嗜向性。3. I. 2hPP10-FITC对人外周血淋巴细胞有穿膜特征新鲜采取、分离的健康人外周血淋巴细胞，依IX IO5个细胞/孔的密度接种于12孔板，设实验组及对照组；在培养箱中常规培养2小时后，换成无血清的RPMI-1640培养液继续培养I小时；加入终浓度10 μ M hPP10-FITC,常规培养I小时；弃去孵育液，PBS洗涤3次；荧光显微镜下观察培养细胞内荧光及其胞内定位情况。结果见图5，荧光显微镜观察发现，未经hPP10-FITC处理的人外周血淋巴细胞内不见绿色荧光。在经hPP10-FITC温育后，可见到明显的胞内绿色荧光，提示hPPIO可高效穿膜进入新鲜制备的人外周血淋巴细胞。3. 2hPP10-FITC穿膜进入细胞具有浓度依赖性ECV-304细胞在经无血清的RPMI-1640处理Ih后，加入浓度梯度的hPP10_FITC(2. 5 μ Μ、5. O μ Μ、7. 5 μ Μ、10. O μ Μ)孵育Ih后，PBS清洗3次，观察培养细胞内荧光情况。并采用荧光酶标仪检测细胞内荧光密度数值，具体方法如下细胞在经不同浓度hPP10-FITC孵育结束后，PBS清洗3次，按300 μ I/孔加入0. IM NaOH，室温裂解细胞lOmin，IOOOrpm离心3min。取细胞裂解液上清50μ I于96孔板在荧光酶标仪中，激发光/吸收光为490nm/520nm下测定荧光密度值。实验重复3次取平均值。在实验中，采用经典的穿膜肽TAT-FITC作为阳性对照。图6A显示，胞内荧光强度随hPP10-FITC浓度升高而增强，并且可见相同浓度下，胞内hPP10-FITC荧光比TAT-FITC强。图6B可见，随着hPP10_FITC浓度的升高，胞内荧 光强度随之增强，提示hPP10-FITC穿膜进入细胞具有浓度依赖性。当hPP10-FITC浓度为5 μ M时，荧光强度已经比较高，在后续实验中均选用了 5 μ M的hPP10-FITC作为终浓度进行实验。3. 3hPP10胞内持续时间显著长于TATC0S7、ECV-304、PC3、HeLa在经无血清的RPMI-1640培养处理Ih后，加入终浓度为5 μ M 的 hPP10-FITC 分别孵育 0. 5h、I. Oh,2. Oh,4. Oh、10h、20h 及 30h 后。PBS 洗涤三次，裂
解细胞，依前述方法用荧光酶标仪检测490nm/520nm检测细胞裂解液上清荧光值。实验均重复3次取平均值。不同的培养细胞随着hPP10-FITC孵育时间的延长，其荧光值均有所增强，至4h其荧光值为最高(图7A)。而TAT-FITC在孵育Ih时，胞内荧光强度为最大，随着孵育时间的进一步延长，荧光值逐渐减弱(图7B)。为了进一步确定hPP10-FITC在胞内维持时间，将孵育时间延长至30h。发现hPP10-FITC在ECV_304、PC3和HeLa三种细胞中可以维持至至少30小时(7C );而TAT-FI TC在细胞内荧光随着时间推移急剧下降，于IO小时时已经基本不能检测到荧光存在(7D)。本研究显示新型人源性穿膜肽hPPIO在胞内维持时间至少可达30小时,而TAT仅能维持短短几小时时间，显著短于hPPIO。
3. 4血清降低hPP10-FITC穿膜效率培养细胞H印G2、ECV-304及B16分别在经有血清和无血清的RPMI-1640培养Ih后，加入终浓度为5μΜ的hPP10-FITC继续孵育Ih后，PBS清洗3次，裂解细胞，取其上清液用荧光酶标仪检测490nm/520nm波长处荧光吸光值。实验重复3次取平均值。结果见图8，一般情况下血清的存在会影响细胞对穿膜肽的内吞摄取。通过荧光定量检测发现，血清的存在对hPP10-FITC穿膜入胞有很大影响。无血清组hPPIO穿膜效率明显高于有血清组(P < O. 05)。结果显示血清的存在影响hPPIO的穿膜效率。3. 5DMS0预处理促进hPPIO穿膜进入培养细胞取对数生长期贴壁培养细胞HSC-T6、Caski, ECV-304、悬浮培养细胞THPl及原代培养纤维细胞，按照I X IO5个细胞/孔的接种密度接种于12孔板进行常规培养。每种细胞均分设实验组及对照组；

至对数生长期(80%密度)时，换为无血清的RPMI-1640培养液，再培养I小时；每孔加入终浓度为5%的DMS0，继续培养I小时。加入终浓度为5 μ M的hPP10_FITC或TAT-FITC后，孵育I小时;弃去培养液，PBS洗涤3次；荧光显微镜下观察HSC-T6、Caski, ECV-304、悬浮培养细胞THPl及原代培养纤维细胞胞内荧光及其胞内定位情况，或按每孔加入300μ I 0. IM NaOH，室温裂解ECV-304，Caski或B16细胞10分钟，IOOOrpm离心3分钟。取细胞裂解液上清50 μ I到96孔板于荧光酶标仪，于490nm/520nm下测定荧光吸光值。实验重复3次取平均值。本发明人前期研究发现DMSO可以明显增强TAT穿膜效率，在此，也观察了 DMSO对新型人源性穿膜肽膜hPPIO的穿膜影响。通过荧光显微镜观察发现，DMSO对hPP10-FITC穿膜具有明显增强效果。与经过DMSO预处理后TAT-FITC穿膜效率相比，DMSO预处理细胞后hPP10-FITC穿膜效率与TAT相当或略强于TAT-FITC(图9A)。经DMSO预处理后，hPP10_FITC在胞内显示搞密度绿色荧光，且均匀分布于胞浆和胞核，即使是对普通转染或转导非常困难的悬浮细胞或原代细胞，hPP10-FITC也具有非常理想的穿膜效果。荧光定量检测发现，5%DMS0预处理后，hPP10-FITC和TAT-FITC的胞内荧光强度较未经DMSO预处理细胞强(图9B)，hPP10-FITC的胞内荧光强度明显强于TAT-FITC。提示5%DMS0预处理细胞明显存进了hPPIO和TAT的穿膜效率，DMSO能够显著增强CPP的穿膜效率且无细胞特异性(图9)。3. 6DMS0预处理促进hPPIO穿膜进入新鲜制备的淋巴细胞新鲜采取、制备人外周血淋巴细胞，或小鼠脾淋巴哦细胞，按照IXlO5个细胞/孔的接种密度接种于12孔板；在培养箱中常规培养2小时后，换成无血清的RPMI-1640培养液继续培养I小时；加入终浓度10 μ M hPP10-FITC，常规培养I小时；弃去培养液，PBS洗涤3次；荧光显微镜下观察培养细胞内荧光强度及胞内荧光定位情况。结果发现，经DMSO预处理后，hPP10-FITC也可以高效穿膜进入新鲜制备的人外周血或小鼠脾淋巴细胞，并均匀分布于胞浆和胞核，图10A为小鼠脾淋巴细胞内hPP10-FITC密度和分布；图10B为人外周血淋巴细胞内hPP10-FITC密度及分布。提示hPPIO不仅可以穿膜进入贴壁培养细胞，悬浮培养细胞内，还可以穿膜进入新鲜制备的人外周血淋巴细胞、或小鼠脾淋巴细胞，显示了极其广泛的应用前景。实施例2、hPP10介导质粒DNA转染hPPIO介导质粒DNA转染的方法包括以下步骤(1)取对数生长期培养细胞ECV-304,以I X IO5个细胞/孔的接种密度接种于12孔板常规培养，同时设置相应的阳性和阴性孔；(2)置37°C 5%C02培养箱中，培养20 24h，至细胞密度达到70%_80%时，将培养液换成无血清的RPMI-1640培养液，继续培养I小时；(3)与此同时准备转染样品a.取终浓度为ΙΟμΜ hPPIO加入含50μ I Opti-MEM的离心管中，轻轻混匀后在室温下孵育5min ；b.取O. 8 μ g的质粒加入含50 μ I Opti-MEM的另外一个离心管中，轻轻混 匀后在室温下孵育5min。将b缓慢地加入到a中，混匀后室温静置30min ；(4)将上述hPPIO+质粒DNA混合溶液均匀地加入到相应的培养细胞中，轻摇混匀。以市售脂质体Lipofectamine 2000作为转染实验阳性对照；(5)置细胞于二氧化碳培养箱中继续温育4_6h后，换成含小牛血清培养液，继续培养 24-48h ；(6)观察hPPIO介导的转染效果，以脂质体Lipofectamine 2000转染试剂和阳性对照肽TAT作为转染阳性对照。2. IhPPlO介导红色荧光蛋白表达质粒pDsRed转染转染后4-6小时更换成正常培养液继续培养48h后，荧光显微镜下观察ECV-304细胞经hPPIO介导转染质粒pDsRed (购自Clontech公司)的效果。由图11可见,hPPIO能介导转染质粒pDsRed，一些培养细胞中有红色荧光蛋白表达。2. 2质粒pcDNA3. I-Gluc的构建及hPPIO介导其转染的效果2. 2. I真核重组质粒pcDNA3. I-Gluc构建和酶切鉴定(I)利用BamHI/Xball两种酶进行双酶切真核表达质粒pcDNA3. I ( + )(购自invitrogen公司)和质粒pGLuc-Basic Vector (真核表达分泌型突光素酶载体,购自NEB公司)，37°C，温育2h ；(2)分别进行琼脂糖凝胶电泳，分别切胶回收线性化的表达质粒pcDNA3. I ( + )和分泌型突光素酶(Gaussia Luciferase)的cDNA片段至离心管中，离心,依切胶回收试剂盒操作说明回收DNA片段；(3)将回收到的片段进行琼脂糖凝胶电泳，确定连接用DNA比例，配链接反应体系，置于16°C水浴箱中过夜连接；(4)取DH5 a感受态细胞，用热休克法以连接产物pcDNA3. I-Gluc转化感受态细胞，经0. lg/L氨苄青霉素琼脂平板37°C过夜筛选后，挑取单个菌落接种于含氨苄青霉素LB液体培养基，37°C过夜振荡培养；(5)用碱裂解法提取重组质粒，筛选成功构建的阳性克隆，限制性内切酶鉴定用BamHI/Xball双酶切重组质粒，得到酶切产物，pcDNA3. Ihe理论值为590bp的插入片段DNA带(图12)，电泳结果显示与预期大小一致；并经测序确认插入片段无突变。表明成功构建了真核重组质粒pcDNA3. I-Gluc02. 2. 2hPP10 介导质粒 pcDNA3. I-Gluc 转染的效果
(I)取对数生长期培养细胞ECV-304，以I X IO5个细胞/孔的接种密度接种于12孔板常规培养，同时设置相应的阳性和阴性孔；(2)置37°C 5%C02培养箱中，培养20 24h，至细胞密度达到70%_80%时，将培养液换成无血清的RPMI-1640培养液，继续培养I小时；(3)与此同时准备转染样品a.取终浓度为ΙΟμΜ证？10加入含5(^1 Opti-MEM的离心管中，轻轻混勻后在室温下孵育5min ；b.取O. 8 μ g的质粒加入含50 μ IOpti-MEM的另外一个离心管中，轻轻混匀后在室温下孵育5min。将b缓慢地加入到a中，混匀后室温静置 30min ；(4)将hPPIO+质粒混合物均匀的加入到相应的培养细胞孔中，轻摇混匀。以市售脂质体Lipofectamine 2000作为转染实验阳性对照；(5)在5%C02培养箱中，37°C继续温育4_6h后，置换成含小牛血清正常培养液，继续培养24-48h ；(6)取200 μ I培养液上清(含有分泌型荧光素酶)置于I. 5ml离心管中，5000rpm离心3min，依分泌型荧光素酶试剂盒使用说明，运用荧光微孔测定仪，检测培养上清荧光素酶活性，以脂质体Lipofectamine 2000转染试剂作为转染阳性对照，TAT和无意义肽NCO作为阳性和阴性肽对照，各处理样品中荧光素酶活性结果见图13。图13可见，hPPIO成功介导了分泌型荧光素酶质粒pcDNA3. I-Gluc转染，细胞表达了较高水平的荧光素酶蛋白，且其活性随着hPPIO浓度的增高而逐步增强。本研究成功利用hPPIO介导了质粒DNA (pDsRed和pcDNA3. 1-Gluc)的转染，但是其转染效率与商用试剂Lipofectamin 2000相比显得较低，我们将继续优化hPPIO介导的转染实验条件条件，以期提高转染效率。hPPIO成功介导DNA质粒的转染将为体外和体内的基因转染提供强有力工具，将来可应用到科学研究和临床上的基因治疗。实施例3、pET15b-hPP10-GFP质粒构建，融合蛋白的表达及纯化和其穿膜功效的研究3. lpET15b-hPP10_GFP重组质粒的构建和酶切鉴定
(I)设计编码hPPIO的两条单链cDNA，两侧带有NdeI和XhoI酶切位点，交由上海生工公司合成单链寡聚核苷酸链，再将两条单链DNA等量加入水溶液中，经95°C，5分钟，自然冷却至室温使其完成退火，形成互补的双链DNA片段(hPPIO);同时设计一对引物以pEGFP (购自Clontech公司)为模板，PCR获得GFP蛋白基因片段，两侧分别有XhoI和BamHI酶切位点，纯化PCR产物备用；(2)利用BamHI/Ndel两种限制性内切酶进行双酶切，37°C温育两小时，将表达质粒pET15b (购自Novagen)线性化；(3)进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外透射仪的长波紫外光照射下，切胶回收含线性化质粒pET15b的条带；瞬时离心，将凝胶集中至管底，依切胶回收试剂盒内的操作说明完成切胶回收；(4)将回收、纯化的线性化质粒DNA片段和退火后的穿膜肽cDNA片段(hPPIO)、以及GFP基因片段分别进行琼脂糖凝胶电泳，确定连接比例，置于16°C水浴箱中温育过夜连接；(5)用CaCl2法制备DH5 a感受态细胞，用热休克法以上述连接产物pET15b_hPP10转化感受态细胞，经O. lg/L氨苄青霉素琼脂平板37°C过夜筛选后，挑取单菌落接种于含氨苄青霉素LB液体培养基中，37°C振荡培养过夜；(6)离心沉淀收集扩增转化细菌，用碱裂解法提取重组质粒，筛选成功构建的阳性克隆pET15b-hPP10-GFP，酶切并测序验证；利用Nde I/BamHI双酶切鉴定重组质粒pET15b-hPP10_GFP得到酶切产物理论值为795bp(图14)，片段与预期大小一致；经测序确认无突变。说明原核表达质粒pET15b-hPP10-GFP 构建成功。相同方法构建得到 pET15b_GFP 和 pET15b_TAT_GFP3. 2融合蛋白的表达及纯化3. 2. I融合蛋白的原核表达

(I)将成功构建的重组质粒pET15b_GFP和pET15b_hPP10_GFP分别转化Rosetta感受态细胞。经O. lg/L氨苄青霉素琼脂平板37°C过夜；(2)挑取单克隆菌落接种于含氨苄青霉素LB培养基，37°C振荡培养过夜；(3)用15ml无菌离心管装3. 8ml LB(+)^液体培养基，接种O. 2ml对数生长期的菌悬液(I: 20)。37°C，250rpm继续培养3h ；(4)于对数生长期细菌培养物中加入40μ I O. IM IPTG至终浓度I. OmM，37 °C，250rpm继续培养；(5)在加入IPTG后6h取样200 μ I菌悬液；(6)离心收集沉淀,用等体积IXSample Buffer重悬,沸水浴5min。制备的菌体全蛋白上样样品；(7) SDS-PAGE检测重组蛋白的表达情况。3. 2. 2融合蛋白的纯化3. 2. 2. I大量诱导用IL培养瓶中盛300ml LB (+)Amp液体培养基，诱导表达可溶性的重组蛋白(I. OmM IPTG，30°C，250rpm，9h)。4°C 6500rpmX lOmin，收集沉淀并称重，_40°C保存备用。3. 2. 2. 2 咪唑纯化(I)超声裂解平均 IOOml 菌液用 15ml Lysis/Binding Buffer (300mM NaCl,50mMNaH2P04, IOmM咪唑，pH 8. 0)重悬，冰浴。超声功率30(T600W，超声2sec，间隔2sec，工作90次。如此循环12 20次，至均匀破碎细菌于悬浮溶液；(2) 12000rpmX20min,4°C,转移上清至 15ml 离心管中；(3)结合用3 5倍体积的Lysis/Binding Buffer在15ml离心管中平衡Ni-NTA,离心收集Ni-NTA,再用与沉淀等体积的Lysis/Binding Buffer重悬，即已平衡的50%Ni-NTA。取I 4ml 50%Ni-NTA与裂解上清混合，在分子杂交炉中37°C转动结合I 2h ；(4)洗涤脱除杂蛋白用至少1/2菌液体积的Wash Buffer (300mMNaCl,50mMNaH2P04，2(T30mM咪唑，pH 8. 0)洗脱杂蛋白。收集前3 5ml穿柱液，取样备做检测；(5)洗脱靶蛋白共用 5 IOml Elution Buffer (300mM NaCl,50mM NaH2PO4, 250mM咪唑，pH 8. 0)，每次加0. 5ml，用I. 5ml离心管收集；(6)保存在96孔板中，各取5μ I样品与195 μ I考马斯亮蓝G-250溶液混合，比较颜色深浅。留存颜色最深的数管，分别添加10(Γ200μ I无菌甘油，混匀后于_40°C保存，并取样备做检测。
GFP和hPP10-GFP融合蛋白相对分子质量分别为27KD和30KD。阳性克隆在I. OmMIPTG诱导6小时后，经SDS-PAGE分析所表达的融合蛋白，在35KD和27KD附近出现一条强表达带，符合预期分子质量大小(图15)。基因工程表达蛋白的纯化是利用6XHis标签，通过Ni-NTA亲和层析得到有效纯化，融合蛋白的纯度大于80%。图15显示得到了纯化的GFP和 hPP10-GFP 蛋白。3. 3hPP10-GFP融合蛋白穿膜功效的研究3. 3. IhPPlO-GFP融合蛋白跨膜进入贴壁培养细胞内的能力研究(I)取对数生长期培养细胞L929，按照I X IO5个细胞/孔的接种密度接种于12孔板常规培养。每种细胞均分设实验组及对照组；(2)待细胞生长至80%融合时，换为无血清的培养液，继续培养I小时； (3)每孔加入终浓度为5%DMS0，继续常规培养I小时；(4)实验组加入终浓度为5 μ M的融合蛋白hPP10-GFP，阳性对照组加入相同浓度的蛋白TAT-GFP，同时设阴性对照。37°C培养箱孵育I小时；(5)弃去以上清培养液，PBS洗涤三次；(6)置于荧光显微镜下观察hPP10-GFP融合蛋白穿膜及胞内定位情况。L929细胞中加入hPP10-GFP融合蛋白孵育Ih后，荧光显微镜下观察到细胞内清晰明亮的绿色荧光，胞内荧光分布均匀(图16) j55%DMS0预处理L929细胞后胞内hPP10-GFP荧光明显增强。显示hPPIO可携带大分子(绿色荧光蛋白)高效穿膜进入细胞，5%DMS0预处理可显著增强hPPIO携带绿色荧光蛋白跨膜进入细胞。3. 3. 2hPP10-GFP融合蛋白跨膜进入人外周血淋巴细胞的穿膜能力研究(I)新鲜采取、分离制备人外周血淋巴细胞，按照I X IO5个细胞/孔的接种密度接种于12孔板，设实验组及对照组；(2)将12孔板在培养箱中静置2小时后，换成无血清的RPMI-1640培养液继续培养I小时；(3)每孔加入终浓度为5%DMS0，继续常规培养I小时；(4)实验组加入终浓度为5 μ M的融合蛋白hPP10-GFP，阴性对照组加入相同浓度的GFP蛋白，37°C培养箱孵育I小时；(5)弃去以培养液，PBS洗涤三次；(6)置于荧光显微镜下观察hPP10-GFP融合蛋白穿膜及胞内定位情况。新鲜采取、分离制备的人外周血淋巴细胞经5%DMS0预处理后，加入hPP10-GFP融合蛋白，荧光显微镜下观察到明显的绿色荧光，胞内荧光分布均匀(图17);而未经DMSO预处理细胞胞内hPP10-GFP荧光比较微弱。本研究提示hPPIO不仅自身可以穿膜进入细胞，也可通过融合蛋白形式携带大分子蛋白(GFP)跨膜进入贴壁培养细胞和人外周血淋巴细胞。这一研究结果为将来开发由hPPIO作为载体向细胞内递送大分子蛋白药物提供了基础。实施例4、hPPIO对细胞活力影响甚微(I)取对数生长期培养细胞ECV-304和H印G2，以I X IO4个细胞/孔的接种密度接种于96孔板常规培养，每孔100 μ 1，每种细胞设3个复孔，37°C培养；(2)至对数生长期，培养液换成无血清的RPMI-1640培养液，继续培养I小时；
(3)分别换成 hPPIO 浓度梯度为 1(^] 、2(^]\1、3(^]\1、4(^]\1及5(^]\1无血清的RPMI-1640培养液，继续培养24小时；(4)孵育时间结束后按每孔100 μ I加入PBS洗涤，2minX 3次；(5)每孔加入80μ I含血清的正常培养液及20μ I MTT (母液浓度5mg/ml，即O. 5%MTT)溶液，于37°C继续培养4h，终止培养后吸去培养液。以200 μ I/孔加入二甲基亚砜，振荡IOmin至结晶物充分溶解后用全波长酶标仪上检测波长为570nm的吸光值A，每组取3个复孔的平均值。测定0D490。重复3次，计算细胞存活率。(6)细胞生存率的计算如下细胞生存率=(实验孔OD值一对照孔OD值一空白孔OD值)/ (对照孔OD值一空白孔OD值)X 100%ο 为明确hPPIO处理细胞是否会影响其活力，本实验采用MTT法测定不同浓度hPPIO处理24h后对细胞活力的影响情况。ECV-304和!fepG2细胞经不同浓度hPPIO处理后MTT 分析数据显示，浓度高于20 μ M的hPPIO长时间处理细胞后细胞依然保持在75%以上，对细胞的活力影响甚微(图18)。提示有效浓度(小于5μΜ)范围内hPP10-FITC并不影响细胞活力。实施例5、hPPIO穿膜机制5. I低温轻度抑制hPP10-FITC穿膜使用不同的培养细胞，如ECV_304、Caski及HeLa在经无血清的RPMI-1640处理Ih后，加入终浓度为5 μ M的hPP10-FITC分别在4°C和37°C两个条件下孵育Ih后，PBS清洗3次，依前述方法裂解细胞取其上清检测490nm/520nm波长处的荧光吸光值。实验重复3次取平均值。一般认为细胞内吞途径是能量依赖的，低温时细胞的能量代谢几乎停滞，也即低温能够阻断细胞内吞途径。ShPPio穿膜方式是通过内吞途径实现，那么温度的变化必然会影响胞内荧光含量。本实验选用在4°c和37°C两个条件探索温度是否影响其穿膜方式。图19表明，低温对hPPIO穿膜影响甚微，与迄今大多数报道结果一致。提示hPPIO短肽本身穿膜可能与内吞机制无关。5. 2肝素显著降低hPPIO穿膜效率观察三种内吞抑制剂对hPP10-FITC的穿膜影响，肝素钠(PBS溶解，终浓度ΙΟμΜ)、氯喹(PBS溶解，终浓度ΙΟμΜ)、氯丙嗪(PBS溶解，终浓度30 μ Μ)配成母液，
0.22 um滤膜过滤灭菌。四种不同的培养细胞C0S7、ECV-304、PC3和HeLa在用无血清的RPMI-1640培养Ih后，细胞中分别加入终浓度的三种内吞抑制剂，继续孵育30min，加入终浓度为5 μ M的hPP10-FITC孵育lh，移除培养基，PBS清洗3次，依前述方法置于荧光酶标仪中，检测490nm/520nm的荧光吸光值。实验重复3次取平均值。实验通过培养细胞与不同的内吞抑制剂孵育，考察内吞抑制剂对hPPIO入胞情况的影响。其中肝素为细胞膜表面硫酸蛋白聚糖的竞争抑制剂；氯喹为抑制内含体酸化的内吞调节剂；氣丙嚷为笼型蛋白依赖的内吞抑制剂。从图20A中看出，在加入肝素后，细胞对hPPIO的摄取大幅度降低。提示肝素能显著抑制hPPIO被摄取进入细胞，细胞膜表面的硫酸蛋白聚糖对hPPIO穿膜进入细胞发挥着重要作用。图20B和20C显示，氯喹和氯丙嗪对hPPIO穿膜进入细胞的影响均不明显。提示hPPIO穿膜进入细胞的过程中需要与细胞膜表面硫酸蛋白聚糖等负电荷分子相互作用，可能不依赖笼型蛋白介导的内吞和内含体酸化机制。结论我们在对现有CPP结构进行系统分析的基础上，通过对蛋白质数据库进行检索，预测和二级结构分析等方法，发现一全新的人源性细胞膜穿透肽(hCPP)，命名为hPPIO。人工合成hPPIO以及原核表达其与绿色荧光蛋白的融合蛋白(hPP10-GFP)进行了一系列体外实验研究。发现hPPIO具有很强的穿膜能力，并可携带大分子GFP，质粒DNA跨膜进入包括肿瘤细胞等贴壁培养细胞，原代细胞，悬浮细胞等多种培养细胞和人外周血淋巴细胞，而不影响所携带生物活性分子的功能，对细胞基本无毒副作用。显示hPPIO作为一种新的人源性细胞穿膜肽，能用于体外和体内向细胞内运送生物活性分子(如蛋白质、多肽，基因等药物)。hPPIO的开发将为科研(体外培养细胞的蛋白转导和基因转染)、临床治疗 (向细胞内递送蛋白或基因药物)提供又一新型胞内运输工具。
权利要求
1.一种新型人源性细胞穿膜肽hPPIO，其特征在于hPPIO是源于人类细胞核蛋白，赖氨酸特异性去甲基酶4A的一段多肽序列，具有细胞膜穿透能力。
2.如权利要求I所述的人源性细胞穿膜肽hPPIO，其特征在于所述穿膜肽的多肽序列如下Lys-Ile-Pro-Leu-Pro-Arg-Phe-Lys-Leu-Lys-Cys-Ile-Phe-Cys-Lys-Lys-Arg-Arg-LyS-Argο
3.将权利要求I或2所述新型人源性细胞穿膜肽hPPIO用作药物运输载体的用途。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于所述新型人源性细胞穿膜肽hPPIO可携带蛋白或核酸跨膜进入多种细胞。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于所述核酸是DNA质粒。
6.如权利要求4所述的用途，其特征在于所述新型人源性细胞穿膜肽hPPIO可携带大分子蛋白(GFP)进入的细胞包括贴壁培养细胞、悬浮培养细胞以及原代培养细胞。
全文摘要
本发明涉及生物医学领域，尤其是涉及一种新型人源性细胞穿膜肽hPP10及利用其作为细胞内药物运输载体的用途。hPP10是源于人类细胞核蛋白，赖氨酸特异性去甲基酶4A的一段多肽序列，具有穿透细胞膜功能，并可携带蛋白，核酸(DNA质粒)跨膜进入多种细胞，是一种极具开发前景的蛋白、核酸等生物活性分子的跨膜运输载体。
文档编号C07K7/08GK102827254SQ201210267050
公开日2012年12月19日 申请日期2012年7月30日 优先权日2012年7月30日
发明者柳长柏, 马节兰, 蔡三金, 吴江锋, 张洁, 贺晓敏, 杨英桂 申请人:三峡大学