一种携带iRGD穿膜肽双靶向阳离子超声微泡制备方法
【专利说明】一种携带iRGD穿膜肽双靶向阳离子超声微泡制备方法 所属技术领域
[0001] 本发明属于基础研究领域，涉及超声微泡的制备方法，尤其涉及一种携带iRGD穿 膜肽双靶向阳离子超声微泡制备方法。
【背景技术】
[0002] 超声微泡（microbubble，MB)，即超声造影剂的主要成分，具有安全性高、能增强超 声散射强度和产生丰富谐波信号的特点，被广泛应用于多种类型的疾病诊断，显著提高疾 病诊断的灵敏性和特异性，运用超声造影剂进行超声成像已经成为超声诊断工作中重要的 组成部分。
[0003] 近年来，随着超声分子影像学的发展，超声微泡的使用不再仅仅局限于成像领域， 通过生化技术对超声微泡进行适当改造，可以将药物或基因携载于微泡表面、壳层或内部 而用于疾病治疗，具有广阔的发展及运用前景。给予一定声强的超声辐照时，微泡发生振 动、膨胀和压缩运动，当声场较强时甚至发生破裂崩溃，这时微泡周围引发高温高压、微射 流、冲击波、切边应激力等多种能量释放，产生的生物学效应不仅能够引起辐照区域血管内 皮细胞间隙增宽，为基因、药物穿越内皮屏障创造有利条件，还可影响细胞膜流动性，使细 胞膜磷脂双分子层结构发生可自我修复的断裂，导致瞬时可逆的细胞膜微孔产生，Ca2+内 流促使细胞膜通透性增加，将更多的药物或基因传递入细胞内发挥作用，从而改善治疗效 果。研究证明，超声微泡联合超声辐照介导的肿瘤治疗具有安全系数高、靶向破坏微泡释放 治疗物质、促进治疗物质渗透入病变组织的特点，尤其在递送基因具有巨大的应用潜力和 独特的优势，例如提高细胞对质粒DNA的摄取，通过调节超声参数及改变超声辐照部位更 方便有效地调控基因转染等。
[0004] 然而，与其他基因传递系统相比，目前超声微泡携带质粒DNA的能力较低，且难以 实现微泡在肿瘤细胞周围的聚集，以至给予超声辐照时进入肿瘤细胞内的基因数量受到限 制，从而影响转染率。阳离子材料聚醚酰亚胺（PEI)是一种多用途的阳离子聚合物，能够中 和DNA电荷，增加DNA与细胞膜的相互作用并促进细胞内吞，是常用的转染试剂。研究表明， PEI与超声具有协同作用，PEI修饰的微泡能通过正负电荷相吸作用携带更多的DNA，在超 声介导下有效地提高基因转染效率。对于质粒DNA靶向聚集问题，微泡进行靶向修饰是一 个很好的解决方案，通过在微泡表面连接上针对某种肿瘤的特异性抗体或配体，使其能够 特异性识别靶细胞而靶向聚集到病灶内。利用靶向微泡携带传输基因不仅可以实现基因在 靶细胞富集，为实现基因高效转染提供必要的先决条件，同时也大大降低微泡在正常组织 的浓度，极大地减少了对正常组织产生副作用的可能。有研究表明，双靶向微泡能与不同的 肿瘤细胞表面标记性分子结合，更好地克服血流剪切力的影响，增加超声微泡与肿瘤靶细 胞的粘附机会，增强微泡的靶向效能，从而提高其所携带基因在靶组织的富集程度。整合素 是细胞黏附分子家族中的一类生物分子，由125kDa的a v亚基和105kDa的0亚基形成跨 膜异二聚体，在肿瘤血管内皮细胞及部分肿瘤细胞上均呈高表达，而在休眠状态的内皮细 胞和正常细胞上几乎不表达，广泛参与细胞之间的相互作用及肿瘤血管的生成，与肿瘤细 胞的粘附，增殖和迀移密切相关，其中整合素ave3(Integ rinav0 3)的作用尤为重要， 是许多抗肿瘤血管生成药物的靶点。含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的iRGD肽是一种 环状的穿膜肽，与整合素a 3受体具有高亲和力，同时具有祀向Neuropilin-1受体和加 速大分子物质（基因或药物）递送入肿瘤细胞的功能。iRGD穿膜肽能与肿瘤血管形成有 关的整合素蛋白结合，然后这种肽被劈开，成为激活的CendR肽，后者与neuropilin-1相结 合。CendR/neuropilin-1的结合调控着一种激活的运输系统，让同时注射的治疗物质从血 管中渗出。这种倾注在血管外的肿瘤组织中继续发生，从而让治疗分子越来越深地渗透到 肿瘤组织中。单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1)，主要表达于单核细胞、上皮细胞和内皮细胞，是 一类参与血管形成的趋化因子，许多肿瘤细胞均可分泌MCP-1因子促进肿瘤血管的生成， 在乳腺癌、卵巢癌、胃癌、食管癌等肿瘤中MCP-1因子的分泌与肿瘤微血管的密度及侵袭能 力密切相关。MCP-1介导血管生成的途径主要依赖于MCP-1与其特异性受体一一CC类趋化 因子受体2(CCR2)之间的相互作用。CCR2被发现在部分肿瘤血管内皮细胞上呈现高表达状 态，MCP-1直接作用于内皮细胞上的CCR2受体，诱导内皮细胞趋化。MCP-1/CCR2的激活直 接参与肿瘤血管的生成和进展，促进肿瘤的侵袭转移，且这种作用与内皮细胞上的CCR2受 体表达情况呈正相关。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种携带iRGD穿膜肽双靶向阳离子超声微泡制备方法；本发明将 革巴向Integrin a v 0 3的iRGD穿膜肽与抗CCR2抗体结合至微泡表面，构建双革E1向阳离子超 声造影剂，该双靶向阳离子超声微泡粒径分布均匀，具有携载质粒DNA和靶向肿瘤细胞双 重功能，可作为质粒DNA的传输载体，使质粒在肿瘤组织周围富集，联合超声介导的生物学 效应和iRGD的穿膜作用，促进基因进入肿瘤细胞内，提高基因转染效率，有望发展应用于 可视化超声控释基因治疗肿瘤。
[0006] 本发明的技术方案的实施如下：
[0007] -种携带iRGD穿膜肽双靶向阳离子超声微泡制备方法，包括以下工艺步骤：
[0008] (l)DSPE-PEG2000-iR⑶的制备
[0009] ①称量：按照摩尔比1. 5 : 1称量药品iR⑶和DSPE-PEG2000-maleimide ;
[0010] ②溶解：将药品iR⑶和DSPE-PEG2000-maleimide移入西林瓶中，加双蒸水4ml溶 解，吹匀；
[0011] ③反应：将装有药品的西林瓶置于冰块中，磁力搅拌24h ;
[0012] ④透析：取一大烧杯，装满蒸馏水，将反应后的溶液转移至透析袋内（Mw :3500)置 于大烧杯内，将大烧杯维持在冰块环境中，磁力搅拌透析48h，每隔4h换一次双蒸水以及冰 块；
[0013] ⑤冷冻干燥：透析完毕后，将透析好的溶液转移至西林瓶中，置于-80°C中冻存约 4h至固体，取出置冷冻干燥机中干燥48h ;
[0014] ⑥存放：干燥完毕后，封口，贴标签，于-20°C中保存；
[0015] (2)Stearie_PEI600 的制备
[0016] ①取0. 35gN，N' -羰基二咪唑（CDI)和0. 6g硬脂酸（Stearic)分别溶解于10ml 无水氯仿中，〇. 7g支链PEI600溶解于20ml无水氯仿中，分别得N，N'_羰基二咪唑溶液、硬 脂酸溶液、支链PEI600溶液备用；
[0017] ②将①中所得的N，N'-羰基二咪唑溶液进行磁力搅拌，在不断磁力搅拌下，将① 中所得的硬脂酸溶液逐滴加入N，N' -羰基二咪唑溶液中，得混合物溶液一，将混合物溶液 在氩气保护下反应2小时后，再将其逐滴加入支链PEI600溶液中，得混合物溶液二备用；
[0018] ③将②中所得的混合物溶液二在氩气保护下于室温环境中进一步搅拌24小时， 所得产物在冷乙醚中沉淀纯化，然后放入大型离心机中清洗除去未反应的溶剂l〇min，收集 上清液得到纯化的Stearic-PEI600 ;然后将清洗收集后的Stearic-PEI600溶液放入真空 干燥机中干燥数小时，完毕后置于_20°C储物箱中保存，制备微泡时将其融于无水氯仿中使 用；
[0019] (3)双靶向阳离子超声微泡的制备
[0020] ①将 DSPC、Stearic-PEI600、DSPE-PEG2000-iRGD、DSPE-PEG2000-Biotin 溶解于 三氯甲烷中，按摩尔比8.5 : 0.5 : 0.5 : 0.5取上述配制的溶液于干净试管中，将试管置 于旋转仪，使用干燥的队气流除去溶剂使其在试管壁上形成一层均匀的薄膜，真空烘箱中 干燥3小时以上，备用；
[0021] ②在试管中加入一定体积的Tris缓冲溶液，得到一定浓度的磷脂溶液，加热磷脂 溶液到其相转变温度（55-60°C)以上，并用水浴超声制成透明的磷脂溶液，将所得磷脂溶 液分装入洁净西林瓶中（1ml/瓶），用全氟丙烷（C3F8)置换瓶中的空气，机械震荡器震荡 30s后形成生物素化的阳离子MBiR⑶微泡；
[0022] ③将所得生物素化的阳离子MBiR⑶微泡用PBS借助离心漂浮法清洗三次，然后加 入60 y g抗CCR2抗体孵育20分钟，离心清洗除去过量的未结合的抗体，制得携iRGD穿膜 肽双靶向阳离子超声微泡。
[0023]制成所述超声微泡成分为：DSPC、DSPE-PE62000-maleimide、 DSPE-PEG2000-Biotin、iR⑶肽、抗CCR2抗体、硬脂酸、支链聚醚酰亚胺-600、N，N' -羰基 二咪唑、抗生物素蛋白。
[0024] 所述纯化的Stearic_PEI600在大型离心机清洗时转数为3000rpm。
[0025] 所述Tris缓冲溶液含10%甘油和10%丙二醇，pH为7. 4。<