专利名称：靶向传输基因的载基因微泡及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种靶向基因传输载体，具体地说是一种应用于超声破裂微泡靶向传输基因系统的载基因微泡。它可应用于心血管疾病的基因治疗，也可应用于肝脏、肾脏、前列腺、乳腺、肌肉等实质脏器疾病的基因治疗。本发明还提供了这种载基因微泡的制备方法。
背景技术：
随着人类基因组计划的开展和分子生物学研究的逐步深入，众多疾病的分子机制的阐明和致病基因不断发现，基因治疗已经从单基因遗传性疾病的治疗发展到多基因常见多发病的治疗，尤其在心脑血管疾病及各种肿瘤的治疗中展现出良好应用前景。但成功的基因治疗需要安全高效的转基因载体和基因输送方法。尽管有多种病毒载体，如腺病毒、腺相关病毒和慢病毒等能导致外源基因高效转染与表达，然而其表现出的肝脏毒性、致炎性、免疫原性和潜在的致瘤性引起国内外学者对其安全性的深切担忧。非病毒载体所具有安全性高、容量大和易制备等优点可能较病毒载体具有更好的应用前景，但其基因转染效率尚有待提高。同时，随着基因治疗研究的逐步深入，人们认识到使目的基因靶向性和特异性的在特定组织部位表达，将其治疗作用与效应限制在特定的组织细胞中是基因治疗成功的关键。现阶段基因载体缺乏靶向性，而采用局部注射等方法将目的基因导入特定组织内，由于其基因转染效率低且可能需要外科手术暴露靶组织，可操作性较差，严重限制其广泛应用。如何开发出无创、高效、靶向基因传输系统是基因治疗研究的热点问题。
近来发现超声诱导传统超声对比剂-微泡空化能增强基因转染效率达10～3000倍。且体内应用发现经静脉注入微泡后，采用超声靶向破裂微泡介导基因转染时，微泡不但作为空化核心增强基因转染效率，同时也可作为基因传输载体释放基因至特定的部位而达到靶向传输基因的目的。作为超声对比剂的微泡是一种直径类似于红细胞(3～6μm)的含气小泡组成，经静脉注入后能通过肺循环到达组织毛细血管内，在超声作用下具有线性散射、非线性散射等特性，使实质器官在超声检测时产生良好的对比显影效果。目前美国FDA已批准Albunex、Optison两种声振白蛋白微泡应用于临床，而Levovist已在欧洲批准临床应用。其中以含惰性气体的白蛋白微泡Optison显影效果最佳，由于其在体内稳定性好，经静脉注入后其不但能使心腔显影良好，还能随血流进入毛细血管达到灌注成像效果，使心肌及其它实质器官显影。以含气微泡作为对比剂的超声造影在欧美国家已广泛地应用于急慢性心肌缺血的诊断、心功能评价和各种实质肿瘤的诊断。由于国内尚无成熟产品投入市场使用，这方面的研究已明显滞后。然而超声靶向照射破裂微泡介导基因转染与传统的超声造影作用机制有所不同，它是通过超声照射诱导靶器官内微泡空化破裂，由此产生的微波自由基等可明显增强毛细血管、细胞膜对基因及药物等大分子物质的通透性，达到增强局部基因转染的效应。但研究发现超声靶向破裂微泡介导基因转染要求微泡与基因具有时间与空间上的协同性，如果基因与微泡处于分离状态，则不但无法保证基因的靶向传输，同时基因转染效率的增强也是有限的。因而很有必要将基因整合至微泡包膜上或微泡内，把传统的超声对比剂—微泡改造成专门化基因传输载体—载基因微泡。这是超声破裂微泡靶向基因传输系统的关键之所在。
目前国内外尚无作为专门化基因传输载体的载基因微泡。现阶段多利用微泡包膜白蛋白的粘附性或脂质微泡表面电荷特性，简单地将基因粘附于传统超声对比剂-微泡表面而制备基因黏附微泡，其不但携带基因量有限，而且变异性大，可重复性及稳定性差，严重影响基因转染效率。更为重要的是由于基因裸露在微泡表面，其在体内应用时不能防止体液对基因的稀释及循环中DNase对基因的降解，无法保证将大量的基因输送至靶组织。因而如何在保证基因性能不受影响的前提下，通过简单有效的工艺将基因整合至微泡包膜内增加其基因携带量及稳定性，制备基因携带量大、性能稳定的载基因微泡作为新的基因传输载体是一个有待解决的关键问题。无疑它的研制成功将具有良好的应用前景和巨大的经济效益。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种能靶向传输基因的新型基因传输载体—载基因微泡，这种载基因微泡主要由包膜构成物、含氟惰性气体内核、基因保护剂、表面活性剂、质粒构成。
本发明的载基因微泡最重要特征在于，将基因稳定整合在微泡包膜内，这种新型载基因微泡不但性质稳定，能提高基因转染时能达到基因-微泡时间与空间上的协同性；而且由于基因包埋在微泡包膜内，在体内使用时能防止血液对基因冲刷和稀释，还能保护基因免受循环中DNase的降解，保证将大量基因输送至靶组织；同时这种新型载基因微泡携带基因容量明显明显优于基因粘附微泡，且在一定范围内随基因投入量增加而呈线性增加。(参见图1)其有效携基因量为110～166.7μg/ml，包封率为25.1±4.6％。
本发明的载基因微泡直径分布范围为2.6～8.3μm，其中98％以上微泡直径小于6μm，本发明通过增加表面活性剂后载基因微泡均匀性明显增加，90％以上载基因微泡直径分布在3～5μm，这种直径分布范围是靶向传输基因的先决条件，它能保证载基因微泡通过肺循环而将基因输送至靶器官微循环内。与传统的超声成像不同，超声靶向照射破裂微泡介导基因转染的机制是在定向超声照射作用下，靶器官内微泡空化破裂将基因释放于靶器官内达到靶向传输基因的目的，同时微泡破裂所产生的微波及自由基等可明显增强基因转染效率。而微泡空化产生微波能量及自由基多少与微泡直径成正相关，因而在保证微泡能通过肺循环进入毛细血管的同时微泡直径应较为均匀，过小微泡影响基因转染效率。本发明的载基因微泡浓度大于5×108/ml。载基因微泡作为基因传输载体，这种浓度可保证微泡能将大量基因输送靶组织。其有效浓度范围为1×108/ml～1×1010/ml，优选浓度范围为5×108/ml～9×108/ml。本发明通过将微泡浓缩可将微泡浓度进一步增加至1.6×109/ml。其完全达到体应用的血液流变学与声学要求。
本发明的载基因微泡稳定性较好，在室温开放条件下其半衰期为18.6～25.7小时。经优选法制备的载基因微泡的半衰期为34.1～35.7小时。这种良好的稳定性可防止体内应用时大量载基因微泡在非靶器官处出现塌陷破裂，保证将载基因微泡仅在靶组织处破裂而释放基因。
本发明的另一目的是提供这种载基因微泡的制备方法，采用同步声振法制备而成，主要通过以下步骤实现(1)将基因保护剂与含目的基因的质粒按重量比为1/10～3/1混合，(2)将包膜构成物与表面活性剂混合，(3)将步骤(1)的混合物加入步骤(2)的混合溶液中，(4)将一定量的含氟惰性气体注入步骤(3)的混合溶液中，(5)将步骤(4)的含气混合液体手摇振动30～40秒，将超声发生仪探头置于混合溶液中进行持续性低频高能超声声振，进行超声声振处理10～15秒，超声声振期间将溶液温度控制在50～55℃。
步骤(1)中所说的基因保护剂是一种多聚复合物，主要包括多聚门冬氨酸(Polyaspartic acid)、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone，PVP)、多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine，PLL)、聚乙烯乙二醇(Polyehylene glycol，PEG)、多聚环氧丙烷(Polypropylene oxide)、多聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine，PEI)等，优选PEI及PLL。本发明采用基因保护剂，不但能增强基因转染效率，还能保护基因在载基因微泡制备及基因转染时免受超声声振能量的破坏。
多聚复合物与基因质粒的重量比选择在1/10～3/1，均具有基因保护作用，优选重量比为1/2～3/4，此时其保护作用最为有效。
步骤(2)中，包膜构成物是由水溶性生物相容蛋白与单糖溶液的混和物，水溶性生物相容蛋白可以是白蛋白、血红蛋白及胶原蛋白等，这种水溶性生物相容蛋白必须能在超声声振能量作用下使部分水溶性蛋白发生变性成为固态，从而构成微泡的包膜，考虑到应用于人体，优先选择人血清白蛋白，单糖溶液可以是葡萄糖、果糖、右旋糖苷等。水溶性生物相容蛋白与单糖溶液比例决定了超声声振参数，选择单糖溶液与5％～20％的人血清白蛋白混合，蛋白浓度分布范围为0.5～10％，但为了缩短超声声振时间减少其对基因结构及功能的破坏，蛋白最佳浓度选择8％。
步骤(2)中的表面活性剂主要选择甘油和Tween20，甘油浓度范围为0.05～0.075％，Tween20浓度范围为0.3～0.45％，其优选浓度为甘油0.06％，Tween20为0.40％。本发明在微泡制备时加入了一定量的甘油和Tween20作为表面活性剂，以增加微泡均匀性及稳定性，同时降低微泡制备时对超声声振能量要求。
步骤(4)中的含氟惰性气体主要包括全氟丙烷(C3F8)、全氟丁烷(C4F10)、全氟戊烷(C5F12)、六氟化硫(SF6)等，优选全氟丙烷和六氟化硫，最优选全氟丙烷。
步骤(5)中所用超声发生仪，采用Sonicator 3000超声发生仪(Misonixinc.USA)，探头为1/2英寸标准探头，发射超声频率为20KHz，输出能量为最高输出量(10档)。通过改变微泡制备配方和表面活性剂的添加，将超声声振时间缩短至10～15秒以便减轻超声声振对基因结构与功能的影响，超声声振期间将溶液温度控制在50～55℃以防止过多的蛋白变性和基因结构与功能的破坏。
本发明的载基因微泡由持续性低频高能超声声振法制备。其特征在于包膜构成物为水溶性生物相容蛋白与单糖溶液混和物。这种水溶性生物相容蛋白必须能在超声声振能量作用下使部分水溶性蛋白发生变性成为固态，从而构成微泡的包膜。这种水溶性生物相容蛋白可以是白蛋白、血红蛋白及胶原蛋白等。考虑到应用于人体，人体含有蛋白应优先选择，其中以人血清白蛋白尤为适合。单糖溶液可以是葡萄糖、果糖、右旋糖苷等。蛋白与单糖溶液比例决定了超声声振参数，蛋白浓度分布范围为0.5～10％，但为了缩短超声声振时间减少其对基因结构及功能的破坏，其最佳浓度为8％。
含气微泡的气体内核可以是空气、氧气、二氧化碳、氮气及惰性气体。本发明的气体内核为含氟惰性气体，它具有较低的血液溶解性和弥散性，可明显延长载基因微泡的半衰期，增加其在体内的稳定性，减少其在非靶器官处破裂塌陷，保证载基因微泡能随血流进入靶器官毛细血管，并在靶向超声作用下诱导微泡空化破裂而定向释放基因至靶器官。这种含氟惰性气体包括全氟丙烷(C3F8)、全氟丁烷(C4F10)、全氟戊烷(C5F12)、六氟化硫(SF6)等。从安全性考虑，应首先选择全氟丙烷和六氟化硫，因为这两种气体已经应用于眼科视网膜脱离固定术并证明其安全无毒。其中全氟丙烷气体密度较六氟化硫大，血液溶解度及弥散性更低，尤其适于制备含气微泡。
由于经静脉注入载基因微泡必须通过肺循环才能到达靶器官毛细血管，其直径必须等于或小于红细胞且分布较为均匀，同时载基因微泡应具有良好的稳定性才能保证有大量载基因微泡进入靶器官。本发明在微泡制备时加入了一定量的甘油和Tween20作为表面活性剂，以增加微泡均匀性及稳定性，同时降低微泡制备时对超声声振能量要求。甘油浓度范围为0.05～0.075％，Tween20浓度范围为0.3～0.45％。其优化浓度为甘油0.06％，Tween20为0.40％。
本发明采用Sonicator 3000超声发生仪(Misonix inc.USA)进行持续超声声振。探头为1/2英寸标准探头，发射超声频率为20KHz，输出能量为最高输出量(10档)。通过改变微泡制备配方和表面活性剂的添加，将超声声振时间缩短至10～15秒以便减轻超声声振对基因结构与功能的影响。超声声振期间将溶液温度控制在50～55℃以防止过多的蛋白变性和基因结构与功能的破坏。
不同于基因粘附微泡制备是先制备含气微泡然后将基因与微泡粘附，本发明所研制的载基因微泡是在白蛋白微泡制备的同时将基因稳定地整合至微泡包膜内。由于白蛋白微泡采用高能低频超声声振而成，而以往的研究表明如果对基因直接进行超声声振处理，由于超声剪切力等作用，基因结构及功能将受到明显的破坏。且发现随着超声声振时间的延长，基因结构与功能破坏愈为明显。因而本发明通过改进白蛋白微泡的制备配方，缩短超声声振时间。同时加入基因保护剂以防止在载基因微泡的制备过程中超声声振破坏基因结构与功能以及超声靶向破裂微泡介导基因转染时对基因结构与功能的影响。本发明的基因保护剂是一种多聚复合物，它能通过分子间作用力将基因包裹至复合物内核，防止超声剪切力对基因的破坏。此外其能压缩基因，减小基因体积而帮助基因进入细胞，同时帮助入胞后基因从内含体逃逸避免内含体酶对基因的降解，从而增强基因转染效率。多聚复合物包括多聚门冬氨酸(Polyaspartic acid)、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone，PVP)、多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine，PLL)、聚乙烯乙二醇(Polyehylene glycol，PEG)、多聚环氧丙烷(Polypropylene oxide)、多聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine，PEI)等。但仅具有阳离子活性的PEI及PLL具有明显保护作用(见图3)，而其它多聚复合物尽管同样具有包裹基因的作用，但无法防止超声声振对基因的破坏。阳离子多聚复合物与基因重量比分布在1/10～3/1均具有基因保护作用，其中以1/2～3/4重量比时其保护作用最为有效。
本发明所负载的基因为裸质粒，由于其具有制备容易、容量大且安全性高，是一种较病毒载体更具前景的转基因载体。同理，本发明亦可用于包被病毒载体及具有高度生物活性的药物。
本发明的再一目的是该载基因微泡在制备超声破裂微泡靶向基因传输载体中的应用。也可在制备载药微泡及靶向超声对比剂中的应用。
本发明提供的载基因微泡可用于人体基因治疗和动物基因治疗研究，它不仅可用于心血管疾病的基因治疗，也可应用于肝脏、肾脏、肌肉及其它各种实质器官的基因治疗。此外这种载基因微泡还可用于体外转基因研究。
本发明所负载的基因为裸质粒，由于其具有制备容易、容量大且安全性高，是一种较病毒载体更具前景的转基因载体。同理，本发明亦可用于包被病毒载体及具有高度生物活性的药物。
本发明的目的还在于提供一种新型的基因转染方法—超声靶向破裂载基因微泡介导基因转染。它与载基因微泡配合应用不但能明显增强基因转染与表达，还可达到靶向传输基因的目的。可应用于各种实质器官疾病的基因治疗和体外转基因研究。其超声照射参数明显影响基因转染效率。有效超声照射频率为KHz～2.0MHz，超声照射频率愈低其诱导微泡空化破裂所需能阈愈低，然而由于KHz超声发生器价格昂贵，要求复杂，不易在临床推广应用。诊断性超声其不但能监测载基因微泡进入靶组织的情况，同时可发射较高能量超声诱导载基因微泡空化破裂而定向释放基因。因而其靶向性明显优于低频KHz超声，更适于在临床推广应用。诊断性超声频率范围是1.0～40MHz，进行超声靶向照射破裂微泡介导基因转染时其有效频率应小于2.0MHz。诊断性超声能量指标为机械指数(Mechanic index，MI)，根据超声发射频率不同，其有效能阈有所不同，一般为MI1.0～1.6。由于超声破裂微泡靶向传输基因系统需要超声照射破裂靶器官内的载基因微泡，故需要根据二维超声成像确定靶器官的深度，在发射高能超声时应准确调节超声靶点深度，以防止非靶组织内微泡破裂而释放基因。
本发明的载基因微泡和超声破裂微泡靶向传输基因系统的有益效果在于1.发明的载基因微泡与靶向超声照射联合应用，在增强基因转染效率的同时可达到靶向传输基因效应，为基因治疗提供一种可通过静脉注入的新型高效靶向基因传输载体；2.发明的载基因微泡通过同步声振处理将基因稳定地整合至微泡包膜内，其不但携带基因量大，且在体内应用是能防止血液对基因冲刷、稀释和循环中DNase对基因的降解，能高效传输及保护基因；3.本发明的载基因微泡的浓度、直径分布范围及稳定性完全达到体内应用的血液流变学和声学特性要求；4.本发明的载基因微泡合成原料均为药理学可接受材料，安全无毒；5.本发明的载基因微泡制备中引入的基因保护剂不但能防止超声声振对基因结构与功能的破坏，还能增强基因转染效率；6.本发明的载基因微泡新的合成配方和表面活性剂的引入，不但缩短了超声声振处理时间，避免超声声振对基因的破坏，同时增强了在基因微泡的稳定性和直径分布的均匀性，使其更适于在超声破裂微泡靶向传输基因系统中的应用；7.本发明工艺简单，设备要求低，适合推广应用。
8.本发明的载基因微泡、制备方法及靶向基因传输系统不但适用于基因的传输，同样适用于药物的靶向传输。
图1、本发明载基因微泡及基因粘附微泡基因携带量随基因投入量的增加而变化的趋势图，其中*P＜0.05，**P＜0.01，图2、本发明载基因微泡经兔耳缘静脉注入后(0.1ml/kg)，二维超声监测下其进入心腔及心肌毛细血管的图像，图3、单纯裸质粒(A)及多聚复合物与质粒混合物(B)经超声声振(600W，20KHz)处理后电泳图像(1为对照组，2～6分别为声振10秒、20秒、30秒、40秒、50秒；OC开口螺旋结构质粒，SC超螺旋结构质粒，Fragmented DNADNA碎片)，图4、超声破裂载基因微泡介导磷酸受钠蛋白反义RNA真核表达质粒心肌细胞转染后，RT-PCR检测磷酸受钠蛋白mRNA表达琼脂糖凝胶电泳图(1对照组；2单纯质粒转染组；3超声照射转染组；4超声破裂粘附基因微泡转染组；5超声破裂载基因微泡转染组)，图5、超声破裂载基因微泡介导磷酸受钠蛋白反义RNA真核表达质粒心肌细胞转染后，Western免疫印迹法检测磷酸受钠蛋白蛋白表达(1对照组；2单纯质粒转染组；3超声照射转染组；4超声破裂粘附基因微泡转染组；5超声破裂载基因微泡转染组)。
具体实施例方式
下面将通过实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1载基因微泡及基因粘附微泡的制备载基因微泡制备采用低频超声持续声振法制备，其配方为6％右旋糖苷溶液 100份20％人血清白蛋白40.4份甘油0.08份ween20 0.56份全氟丙烷气体(C3F8)70份阳离子多聚复合物10～600μg/ml空质粒(PcDNA3.1)20～1200μg/ml将质粒与阳离子多聚复合物混合后，静置半小时。加入由右旋糖苷、血清白蛋白、表面活性剂组成的混合溶液中，置于一无菌注射器内。通过三通连接器与另一含有全氟丙烷气体的注射器相连，将全氟丙烷注入上述混合溶液内。手振30秒后拔出针栓，将超声发生仪1/2英寸无菌探头插入溶液内。将超声发生仪输出能量调节为最大输出能量，频率固定为20KHz持续声振12秒。将上述所得液体直立静置1小时，待其分为3层后小心抽吸中层(载基因微泡聚集层)液体。将微泡按1∶100稀释后用细胞计数器测定微泡的浓度，采用测微尺测量微泡的大小。当微泡浓度大于5×108，90％微泡直径分布在3～5μm者留用。将部分微泡中加入无水乙醇破裂微泡后提取微泡内质粒，紫外分光法测定其载基因量同时进行琼脂糖凝胶电泳了解质粒结构的改变。基因粘附微泡的制备采用传统的配方持续声振120秒制备微泡后与基因混合粘附而得。载基因微泡及基因粘附微泡基因携带量随基因投入量的增加而变化的趋势参见图1，表明载基因微泡基因携带量明显大于基因粘附微泡。将载基因微泡经兔耳缘静脉注入后(0.1ml/kg)，二维超声监测下心腔及心肌灌注成像情况参见图2。上述结果表明载基因微泡完全达到体应用的血液流变学与声学要求。
实施例2、采用不同方法制备载基因微泡A、阳离子复合物对基因保护作用采用实施例1的制备方法制备载基因微泡，仅去除阳离子多聚复合物。将所得微泡按实施例1的方法测定浓度及直径，与按实施例1方法制备质微泡无明显差异。琼脂糖电泳发现其内所携质粒结构已破坏殆尽，细菌转化试验无阳性克隆出现，参见图3。
B、表面活性剂对微泡性质的影响采用实施例1的方法制备载基因微泡，仅去除表面活性剂甘油及Tween20。镜下测量微泡直径、浓度及半衰期结果见表1。
表1.表面活性剂对载基因微泡物理参数的影响载基因微泡参数 未添加表面活性剂 添加表面活性剂直径 6.31±3.97μm 4.6±1.3μm P＜0.01浓度 4.3±2.6×106/ml 8.9±2.6×108/mlP＜0.01半衰期 5.73±1.32小时34.9±0.8小时 P＜0.01上述结果表明表面活性剂引入明显改善载基因微泡各种参数，使微泡大小接近血细胞，直径分布范围更为均匀，同时增加微泡浓度和半衰期，是使载基因微泡达到体内应用血液流变学要求的重要保障。
实施例3经静脉注入载基因微泡及靶向超声破裂载基因微泡对心功能的影响载基因微泡的制备同实施例1，解剖分离4只兔的右颈总动脉，将5F的动脉鞘管置于其内。经动脉鞘管置入动脉导管至左心室，将导管尾端与Medlab心功能监测系统的压力换能器相连，持续监测心功能变化。经兔耳缘静脉注入载基因微泡(0.1ml/kg)，二维超声监测微泡进入心腔及心肌毛细血管情况，同时观察心功能改变。一旦微泡进入心肌毛细血管内，即将超声机械指数调节至1.7进行超声靶向破裂载基因微泡，同时观察心功能变化。二维超声监测发现当微泡注入后约10秒可见心腔内信号明显增强，2～3个心动周期后心肌声学密度值基本与心腔相同，表明载基因微泡已进入心肌毛细血管。二维超声监测下心腔及心肌灌注成像情况，此时调节超声机械指数至1.7，约4～5个心动周期心肌声学密度值降至基础水平，表明其内载基因微泡已完全破裂。如此重复4～5个循环直至体内载基因微泡完全耗竭。
表2.载基因微泡注入前、后及超声靶向破裂微泡心功能参数的变化心功能参数 载基因微泡注入前 载基因微泡注入后 超声破裂载基因微泡时左室峰压 128.48±11.97 124.62±13.96 126.95±7.83 P＝0.195左室舒张末期压 6.71±1.736.28±1.366.92±1.65 P＝0.435+dp/dt Max*2536.308±259.18 2453.21±168.57 2499.31±210.83 P＝0.588-dp/dt Max** -2235.88±152.36 -2130.87±120.98 -2245.65±143.22 P＝0.640*左室压力最大上升速率；**左室压力最大下降速率上表结果显示经静脉注射载基因微泡及超声靶向破裂载基因微泡对心功能无明显影响，表明载基因微泡不但能成功将基因输送至靶器官，同时表明超声破裂微泡靶向传输基因技术对机体无明显有害影响，是一种安全高效的基因传输技术。
实施例4超声破裂载基因微泡介导心肌细胞报告基因转染载基因微泡制备同实施例1，仅将空质粒改为β-galactosidase质粒及质粒投入量为10～600μg/ml。基因粘附微泡制备采用两步法，即先制备含气微泡后将其与质粒混合孵育2小时而得。原代培养乳鼠心肌细胞达到70％汇合时进行基因转染。
本实验设立未加任何干预的空白对照组；单纯质粒转染组仅加入质粒10μg/孔；、超声照射转染组加入10μg/孔质粒后进行超声照射；超声破裂载基因微泡转染组和超声破裂黏附基因微泡转染组分别含有不同量质粒载基因或粘附基因微泡后进行超声照射，每次试验设3个复孔，每组试验均重复3次。超声破裂微泡转染组细胞转染2小时前更换新鲜培养液，加入载基因微泡后，在无菌条件下将超声探头(HP SONOS 5500，S3探头)直接浸入培养液中，在细胞层上方约0.5cm发射超声(照射参数为频率1.3MHz，MI1.4，照射时间120秒)，超声照射过程中转动探头(3rpm)。转染后8小时换液，继续孵育40小时后进行原位染色和半乳糖苷酶定量测定。
β-Galactosidase原位染色示空白对照组及单纯质粒转染组未见明显细胞蓝染。超声照射转染组可见稀疏蓝染细胞；超声破裂微泡转染组细胞蓝染较强，其中以超声破裂载基因微泡转染组为甚。
采用定量试剂盒检测各组细胞转染后48小时galactosidase酶表达水平，空白对照组未检出基因表达，单纯质粒转染组基因表达水平较低(0.871±0.135U/g protein)，质粒加超声照射转染组基因表达水平(3.644±0.89U/gprotein)与单纯质粒转染组比有所升高(P＜0.05)；超声破裂载基因转染组基因表达水平明显升高，其中10μg/ml质粒合成载基因微泡组基因表达水平为(93.19±8.46U/g protein)，约为单纯质粒转染组表达水平的107倍，差异具有显著性(P＜0.01)。
随着质粒量的增加，超声破裂载基因转染组基因表达水平呈线性增高直至平台期(500μg/ml微泡)；而超声破裂粘附基因组基因表达水平很快达到平台期，随后基因表达水平有所降低。超声破裂载基因微泡基因转染组平台期基因表达水平(356.46±12.53U/g protein)约为超声破裂粘附基因组最高水平(59.23±2.41U/g protein)之6.85倍，差异具有显著性(P＜0.01)。
上述结果表明超声破裂微泡明显增强心肌细胞外源基因转染与表达，是一种高效的基因转染技术。同时表明载基因微泡不但携带基因明显高于基因粘附微泡，其增强基因转染效率亦明显优于后者。
实施例5超声破裂微泡介导心肌细胞磷酸受纳蛋白(Phospholamban，PLB)反义RNA真核表达质粒心肌细胞转染磷酸受纳蛋白为一种定位于心肌细胞肌浆网上22KDa的膜蛋白，具有重要的调节心肌舒缩功能的作用。其通过磷酸化和去磷酸化调节肌浆网钙ATP酶(SERCA)的功能而达到调节肌浆网摄取钙离子及心肌细胞的舒缩活动。研究发现在心力衰竭、糖尿病心肌病等心脏疾患的心肌细胞中，PLB表达明显上调。且心脏舒缩功能与PLB表达尤其是PLB/SERCA比值明显相关。通过反义RNA抑制PLB表达或敲除PLB可明显增强正常和心力衰竭心脏的舒缩功能。已有多种技术可介导反义RNA表达质粒转染心肌细胞，但均存在转染效率过低、毒性强等不足。本研究拟采用超声破裂载基因微泡技术介导PLB反义RNA真核表达质粒转染心肌细胞，为进一步研究寻找安全有效转染方法。
磷酸受纳蛋白反义RNA真核表达质粒的构建由PAAV-antiPLB亚克隆而得，PAAV-antiPLB为本研究所构建，其内含有反向连接的全长Phospholamban cDNA序列。PcDNA4.0及PAAV-antiPLB质粒分别经EcoRI及XhoI双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，以凝胶纯化试剂盒纯化相应的DNA片段。用T4噬菌体DNA连接酶将701bp Phospholamban cDNA全长序列反向连接到PcDNA4.0真核表达质粒的EcoRI-XhoI间，构建成PcDNA4.0-asPLB反义RNA表达载体，转化感受态细菌DH5α，随机挑选氨苄青霉素抗性的转化克隆，限制性内切酶酶切鉴定后双向测序分析。阳性克隆扩增后采用柱层析法提取质粒，调整浓度至1ug/ul。
载基因微泡的制备、细胞培养及基因转染方法同实施例2。本研究分为5组1、空白对照组；2、空质粒转染组；3、裸质粒转染组；4、超声破裂基因粘附微泡转染组；5、超声破裂载基因微泡转染组。基因转染后48小时收集细胞，提取RNA及蛋白，行RT-PCR及Western Blot检测基因表达，参见图4、图5。
结果显示空白对照组及空质粒转染组PLB表达无明显改变，裸质粒转染组PLB mRNA及蛋白表达水平有轻度降低，超声破裂基因粘附微泡转染组PLB表达约降低30％，而超声破裂载基因微泡转染组基因表达水平降低达60％以上，与其它各组比较差异具有显著性(P＜0.05)。上述结果表明超声破裂载基因微泡能明显增强反义RNA真核表达质粒的转染，载基因微泡是一种新的高效反义RNA传输载体，可进一步应用于体内实验及临床基因治疗研究。
无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
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权利要求
1.一种载基因微泡，其特征是该载基因微泡主要由包膜构成物、含氟惰性气体内核、基因保护剂、表面活性剂、含目的基因的质粒构成。
2.如权利要求1所述的载基因微泡，其浓度为5×108/ml～9×108/ml，直径分布范围为2.6～8.3μm，90％以上载基因微泡直径分布在3～5μm，半衰期为34.1～35.7小时。
3.如权利要求1和2所述的载基因微泡采用同步声振法制备而成，主要通过以下步骤实现(1)将基因保护剂与含目的基因的质粒按重量比为1/10～3/1混合，(2)将包膜构成物与表面活性剂混合，(3)将步骤(1)的混合物加入步骤(2)的混合溶液中，(4)将一定量的含氟惰性气体注入步骤(3)的混合溶液中，(5)将步骤(4)的含气混合液体手摇振动30～40秒，将超声发生仪探头置于混合溶液中进行持续性低频高能超声声振处理10～15秒，超声声振期间将溶液温度控制在50～55℃。
4.如权利要求3所述的载基因微泡的制备方法，所说的基因保护剂是一种多聚复合物，主要包括多聚门冬氨酸(Polyaspartic acid)、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone，PVP)、多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine，PLL)、聚乙烯乙二醇(Polyehylene glycol，PEG)、多聚环氧丙烷(Polypropylene oxide)、多聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine，PEI)等，优选PEI及PLL。
5.如权利要求3-4所述的载基因微泡的制备方法，所说的多聚复合物与基因质粒的重量比选择在1/10～3/1，优选重量比为1/2～3/4。
6.如权利要求3所述的载基因微泡的制备方法，所说的包膜构成物主要为水溶性生物相容蛋白与单糖溶液的混和物，蛋白浓度分布范围为0.5～10％，最佳选择蛋白浓度为8％。
7.如权利要求3所述的载基因微泡的制备方法，所说的表面活性剂主要选择甘油和Tween20，甘油浓度范围为0.05～0.075％，Tween20浓度范围为0.3～0.45％，其优选浓度为甘油0.06％，Tween20为0.40％。
8.如权利要求3所述的载基因微泡的制备方法，所说的含氟惰性气体主要包括全氟丙烷(C3F8)、全氟丁烷(C4F10)、全氟戊烷(C5F12)、六氟化硫(SF6)，优选全氟丙烷和六氟化硫，最优选全氟丙烷。
9.如权利要求1-8所述的载基因微泡，在制备超声破裂微泡靶向基因传输载体中的应用。
10.如权利要求1-8所述的载基因微泡，在制备载药微泡及靶向超声对比剂中的应用。
11.如权利要求1-8所述的载基因微泡，在制备实质脏器疾病治疗的基因药物中的应用。
12.如权利要求1-8所述的载基因微泡，在制备心血管疾病治疗的基因药物中的应用。
全文摘要
本发明提供一种能靶向传输基因的新型基因传输载体—载基因微泡，这种载基因微泡主要由包膜构成物、含氟惰性气体内核、基因保护剂、表面活性剂、质粒构成。本发明还提供了这种载基因微泡主要采用同步声振法制备而成。本发明为基因治疗提供一种可通过静脉注入的新型高效靶向基因传输载体，不但适用于基因的传输，同样适用于药物的靶向传输。不仅能高效传输及保护基因，而且合成原料均为药理学可接受材料，安全无毒，适于在超声破裂微泡靶向传输基因系统中的应用。本发明工艺简单，设备要求低，适合推广应用。
文档编号A61K9/00GK1579554SQ200410018530
公开日2005年2月16日 申请日期2004年5月18日 优先权日2004年5月18日
发明者胡申江, 汪国忠 申请人:浙江大学医学院附属第一医院