/ra?2能更多地与bEnd. 3细胞黏附，其黏附率为（2. 88±0. 56)微泡/细胞，黏附能力 尚于 MBrantrcil、MBiRG[^PI MB CCR2。
[0069] (3)皮细胞靶向黏附对照实验显示，游离iR⑶肽或抗CCR2抗体提前与内皮细胞孵 育大大减少了靶向微泡与bEnd. 3细胞之间的黏附，进一步说明了靶向微泡与bEnd. 3细胞 之间的黏附，是由iRGD肽和抗CCR2抗体通过配体-受体、抗原-抗体结合方式特异性介导 的。
[0070] 3、双靶向阳离子微泡的体外超声显影及稳定性
[0071] (1)靶向超声造影剂的出现使得超声造影成像的分辨力、敏感性和特异性得到进 一步的提升，实现感兴趣区域的分子显像，而双靶向或多靶向修饰的微泡是今后造影剂发 展的趋势，在病灶区域富集的微泡会对超声波产生更多的散射，从而显著增强图像的对比 度和信噪比，大大提高了超声造影诊断的灵敏性，有助于疾病的早期检出和疾病的鉴别诊 断。
[0072] ⑵Vev〇2100超声成像探头下琼脂孔内的双靶向微泡MB lR(；_R2回声较为均 勾，与MBrantrol的回声强度相似（Otime)，平均灰阶强度分别为（168. 05 ± 4. 05) a. u和 (166. 63±3. 61)a. u ;随着时间的增加，MBrantrojP MB lRSD/CCR2的超声信号强度逐渐下降，但两 者的信号强度差异没有统计学意义（P > 〇. 05)，表明连接iRGD肽和抗CCR2单抗后并未影 响微泡的稳定性。该双靶向阳离子超声微泡能聚集于肿瘤组织而用于增强肿瘤显影。
[0073] 4、双靶向阳离子微泡结合DNA能力检测
[0074] (1)用琼脂糖凝胶电泳法检测MBiRm/raf2结合承载质粒DNA能力。
[0075] (2)随着MBlRm/CCR^度增加，迀移至凝胶中的DNA越少，表明更多的质粒DNA结合 至 MBiRGD，CCR2〇 根据公式计算，浓度为2 X 106,4X 106,8 X 106,1. 6 X 107的MB lRSD/eeR2分别可以结 合（0? 18±0. 04) y g，（0? 32±0. 03) y g，（0? 39±0. 03) y g，（0? 47±0. 02) y g 的质粒 DNA， 1. 5X 107的MB撕阶哪约能结合0? 5 y g的质粒DNA〇
[0076] 5、MCF-7细胞基因转染率检测
[0077] (1)为了评估载质粒DNA阳离子微泡结合超声辐照是否能提高基因转染效率，阳 离子微泡MB rantrol、MBlRSD、MBeeR2、MBlRSD/eeR# DNA孵育后分别加入培养MCF-7细胞的板孔中， 光镜下观察到微泡能聚集于MCF-7乳腺癌细胞周围。
[0078] (2)24小时转染后于荧光显微镜下观察，未给予超声辐照组中的对照组未见 MCF-7细胞表达绿色荧光蛋白，加入质粒阳离子微泡复合物（质粒+MB rantral，质粒+MBlRm， 质粒+MBeeR2，质粒+MB iR(；D/raf2)但未给予超声福照组可见少量绿色焚光蛋白表达，而在 加入质粒微泡复合物后给予超声辐照组中，绿色荧光蛋白表达明显增多，且同一倍数视 野下，质粒+MB lRm/eeR2+US组中的MCF-7细胞绿色荧光蛋白表达最多，其基因转染率为 (25. 43±3. 31) %。
[0079] 总结结论：
[0080] 本发明具有以下优势：
[0081] 1、制备的阳离子微泡粒径均匀。
[0082] 2、操作简便连接稳固，有效将微泡表面电荷逆转为正电荷。
[0083] 3、制备的双靶向阳离子超声微泡具有更优的靶向效能。
[0084] 4、可以有效提尚基因转染效率。
[0085] 5、大幅度提尚超声诊断的灵敏性。
【主权项】
1. 一种携带iRGD穿膜肽双靶向阳离子超声微泡制备方法，其特征在于：包括以下工艺 步骤： (1) DSPE-PEG2〇0〇-iR⑶的制各 ① 称量：按照摩尔比1. 5 : 1称量药品iR⑶和DSPE-PEG2000-maleimide ; ② 溶解：将药品iR⑶和DSPE-PEG2000-maleimide移入西林瓶中，加双蒸水4ml溶解， 吹匀； ③ 反应：将装有药品的西林瓶置于冰块中，磁力搅拌24h ; ④ 透析：取一大烧杯，装满蒸馏水，将反应后的溶液转移至透析袋内（Mw :3500)置于大 烧杯内，将大烧杯维持在冰块环境中，磁力搅拌透析48h，每隔4h换一次双蒸水以及冰块； ⑤ 冷冻干燥：透析完毕后，将透析好的溶液转移至西林瓶中，置于_80°C中冻存约4h至 固体，取出置冷冻干燥机中干燥48h ; ⑥ 存放：干燥完毕后，封口，贴标签，于-20°C中保存； (2) Stearic-PEI600 的制备 ① 取0. 35gN，N' -羰基二咪唑（⑶I)和0. 6g硬脂酸（Stearic)分别溶解于IOml无水 氯仿中，〇. 7g支链PEI600溶解于20ml无水氯仿中，分别得N，N'_羰基二咪唑溶液、硬脂酸 溶液、支链PEI600溶液备用； ② 将①中所得的N，N' -羰基二咪唑溶液进行磁力搅拌，在不断磁力搅拌下，将①中所 得的硬脂酸溶液逐滴加入N，N' -羰基二咪唑溶液中，得混合物溶液一，将混合物溶液在氩 气保护下反应2小时后，再将其逐滴加入支链PEI600溶液中，得混合物溶液二备用； ③ 将②中所得的混合物溶液二在氩气保护下于室温环境中进一步搅拌24小时，所得 产物在冷乙醚中沉淀纯化，然后放入大型离心机中清洗除去未反应的溶剂lOmin，收集上清 液得到纯化的Stearic-PEI600 ;然后将清洗收集后的Stearic-PEI600溶液放入真空干燥 机中干燥数小时，完毕后置于-20°C储物箱中保存，制备微泡时将其融于无水氯仿中使用； (3) 双靶向阳离子超声微泡的制备 ① 将 DSPC、Stearic-PEI600、DSPE-PEG2000-iRGD、DSPE-PEG2000-Biotin 溶解于三氯 甲烷中，按摩尔比8.5 : 0.5 : 0.5 : 0.5取上述配制的溶液于干净试管中，将试管置于旋 转仪，使用干燥的队气流除去溶剂使其在试管壁上形成一层均匀的薄膜，真空烘箱中干燥3 小时以上，备用； ② 在试管中加入一定体积的Tris缓冲溶液，得到一定浓度的磷脂溶液，加热磷脂溶液 到其相转变温度（55-60°C)以上，并用水浴超声制成透明的磷脂溶液，将所得磷脂溶液分 装入洁净西林瓶中（lml/瓶），用全氟丙烷（C3F8)置换瓶中的空气，机械震荡器震荡30s后 形成生物素化的阳离子MBiRGD微泡； ③ 将所得生物素化的阳离子MBiR⑶微泡用PBS借助离心漂浮法清洗三次，然后加入 60 y g抗CCR2抗体孵育20分钟，离心清洗除去过量的未结合的抗体，制得携iRGD穿膜肽双 靶向阳离子超声微泡。2. 根据权利要求1所述的一种携带iRGD穿膜肽双靶向阳离子超声微泡制备 方法，其特征在于：制成所述超声微泡成分为：DSPC、DSPE-PEG2000-maleimide、 DSPE-PEG2000-Biotin、iR⑶肽、抗CCR2抗体、硬脂酸、支链聚醚酰亚胺-600、N，N' -羰基 二咪唑、抗生物素蛋白。3. 根据权利要求1所述的一种携带iRGD穿膜肽双靶向阳离子超声微泡制备方法，其特 征在于：所述纯化的Stearic_PEI600在大型离心机清洗时转数为3000rpm。4. 根据权利要求1所述的一种携带iRGD穿膜肽双靶向阳离子超声微泡制各方法，其特 征在于：所述Tris缓冲溶液含10%甘油和10%丙二醇，pH为7. 4。5. 根据权利要求1所述的一种携带iRGD穿膜肽双靶向阳离子超声微泡制备方法，其 特征在于：所述离心漂浮法清洗时，清洗速度设置为400g/min，每次清洗4min，所述生物素 化的阳离子MBiR⑶微泡用PBS进行离心漂浮法清洗之前，每I X 108的生物素化的阳离子 MBiR⑶微泡加入50 y g亲和素（AD)并在室温下孵育20分钟。
【专利摘要】本发明公开了一种携带iRGD穿膜肽双靶向阳离子超声微泡制备方法，属基础研究领域；本发明超声微泡制备使用的材料为：DSPC、DSPE-PEG2000-malei？mide、DSPE-PEG2000-Biotin、iRGD肽、抗CCR2抗体、硬脂酸、支链聚醚酰亚胺-600、N，N’-羰基二咪唑、抗生物素蛋白；本发明将靶向Integrinαvβ3的iRGD穿膜肽与抗CCR2抗体结合至微泡表面，构建双靶向阳离子超声造影剂，具有携载质粒DNA和靶向肿瘤细胞双重功能，联合超声介导的生物学效应和iRGD的穿膜作用，促进基因进入肿瘤细胞内，提高基因转染效率，有望发展应用于可视化超声控释基因治疗肿瘤。
【IPC分类】A61K49/22, A61P35/00, A61K47/42, A61K41/00, A61K48/00
【公开号】CN105106977
【申请号】CN201510466249
【发明人】徐金锋, 刘莹莹, 魏章洪
【申请人】深圳市人民医院
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年7月27日