br>[0026] 所述离心漂浮法清洗时，清洗速度设置为400g/min，每次清洗4min，所述生物素 化的阳离子MBiR⑶微泡用PBS进行离心漂浮法清洗之前，每1 X 108的生物素化的阳离子 MBiR⑶微泡加入50 y g亲和素（AD)并在室温下孵育20分钟。
[0027] 本发明双靶向超声微泡所具有的特性如下：
[0028] 1、双靶向阳离子微泡的粒径及基本电荷：发明制备的靶向微泡的包封材料为脂质 体，是通过磷脂之间较弱的疏水作用力和范德华力自组装形成，相对高分子聚合物材料而 言更柔软，回声性能较好成像较稳定，对超声具有非常强的反应灵敏性，使用较低的超声能 量便能快速爆破微泡释放基因，脂质微泡还有利于进行功能化靶向修饰。脂质微泡的粒径 大小及分布需要控制在一定范围内，因其很大程度上影响微泡的稳定性、微泡声信号反射 效能及靶向效能的发挥。制备的携iRGD双靶向阳离子超声微泡在光镜下均显示为大小、分 布较均匀的球形气泡。制备的携iRGD双靶向阳离子超声微泡在光镜下均显示为大小、分 布较均匀的球形气泡。粒度分析仪测得的微泡粒径为（〇.84±0. 06) ym，微泡直径分布在 0. 5~2ym范围，双革E向修饰并未对微泡粒径产生较大影响。Marlven电位分析仪测得的微 泡表面电荷为（25. 83±1. 57)mV，与未进行PEI600修饰的微泡相比，电荷有较显著的提高， 说明在微泡制备过程中加入Stearic-PEieOO,能通过硬脂酸参与微泡壳的形成使阳离子材 料PEI600连于微泡上，操作简便连接稳固，有效将微泡表面电荷逆转为正电荷。
[0029] 微泡的粒径和电位（n = 4,孓土s )如下表：
[0030]
[0031] 注：MB_trol:非靶向微泡
[0032] MBlRm:携iR⑶肽单靶向微泡
[0033] MBCCR2:携抗CCR2抗体单靶向微泡
[0034] MBlRm/CCR2d：i iR⑶肽和抗CCR2抗体双靶向微泡
[0035] non-PEI6〇0 :没有加入PEI6〇0制备材料
[0036] PEI600:加入 PEI600 制备材料
[0037] 2、荧光显微镜下观察：非靶向微泡MBrantralF能激发荧光；蓝光激发下，FITC标记 的MBlRSD发绿色荧光，表明iR⑶肽结合在微泡表面；绿光激发下，PE标记的MB 红色荧 光，表明CCR2单抗连接到了微泡上；FITC和PE标记的MBlRm/eeR2既能在蓝光激发下呈现绿 色荧光，又能在绿光激发下呈现红色荧光，表明iR⑶肽和CCR2单抗均连接到了微泡上，其 融合图呈现黄色光。
[0038] 本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
[0039] 本发明将革巴向Integrin a v 0 3的iRGD穿膜肽与抗CCR2抗体结合至微泡表面， 构建双靶向阳离子超声造影剂，该双靶向阳离子超声微泡粒径分布均匀，具有携载质粒DNA 和靶向肿瘤细胞双重功能，可作为质粒DNA的传输载体，使质粒在肿瘤组织周围富集，联合 超声介导的生物学效应和iRGD的穿膜作用，促进基因进入肿瘤细胞内，提高基因转染效 率，有望发展应用于可视化超声控释基因治疗肿瘤。
【具体实施方式】
[0040] 下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述。
[0041] 实施例
[0042] 一种携带iRGD穿膜肽双靶向阳离子超声微泡制备方法，包括以下工艺步骤：
[0043] (l)DSPE-PEG2000_iR⑶的制备
[0044] ①称量：按照摩尔比1. 5 : 1称量药品iR⑶和DSPE-PEG2000-maleimide;
[0045] ②溶解：将药品iRGD和DSPE-PEG2000-maleimide移入西林瓶中，加双蒸水4ml溶 解，吹匀；
[0046] ③反应：将装有药品的西林瓶置于冰块中，磁力搅拌24h;
[0047] ④透析：取一大烧杯，装满蒸馏水，将反应后的溶液转移至透析袋内（Mw :3500)置 于大烧杯内，将大烧杯维持在冰块环境中，磁力搅拌透析48h，每隔4h换一次双蒸水以及冰 块；
[0048] ⑤冷冻干燥：透析完毕后，将透析好的溶液转移至西林瓶中，置于-80°C中冻存约 4h至固体，取出置冷冻干燥机中干燥48h;
[0049] ⑥存放：干燥完毕后，封口，贴标签，于-20°C中保存；
[0050] (2)Stearic_PEI600 的制备
[0051] ①取0? 35gN，N' -羰基二咪唑（CDI)和0? 6g硬脂酸（Stearic)分别溶解于10ml 无水氯仿中，〇. 7g支链PEI600溶解于20ml无水氯仿中，分别得N，N'_羰基二咪唑溶液、硬 脂酸溶液、支链PEI600溶液备用；
[0052] ②将①中所得的N，N' -羰基二咪唑溶液进行磁力搅拌，在不断磁力搅拌下，将① 中所得的硬脂酸溶液逐滴加入N，N' -羰基二咪唑溶液中，得混合物溶液一，将混合物溶液 在氩气保护下反应2小时后，再将其逐滴加入支链PEI600溶液中，得混合物溶液二备用；
[0053] ③将②中所得的混合物溶液二在氩气保护下于室温环境中进一步搅拌24小剂 lOmin，收集上清液得到纯化的Stearic-PEI600;然后将清洗收集后的Stearic-PEI600溶 液放入真空干燥机中干燥数小时，完毕后置于-20°C储物箱中保存，制备微泡时将其融于无 水氯仿中使用；
[0054] (3)双靶向阳离子超声微泡的制备
[0055] ①将 DSPC、Stearic-PEI600、DSPE-PEG2000-iRGD、DSPE-PEG2000-Biotin 溶解于 三氯甲烷中，按摩尔比8.5 : 0.5 : 0.5 : 0.5取上述配制的溶液于干净试管中，将试管置 于旋转仪，使用干燥的队气流除去溶剂使其在试管壁上形成一层均匀的薄膜，真空烘箱中 干燥3小时以上，备用；
[0056] ②在试管中加入一定体积的Tris缓冲溶液，得到一定浓度的磷脂溶液，加热磷脂 溶液到其相转变温度（55-60°C)以上，并用水浴超声制成透明的磷脂溶液，将所得磷脂溶 液分装入洁净西林瓶中（1ml/瓶），用全氟丙烷（C3F8)置换瓶中的空气，机械震荡器震荡 30s后形成生物素化的阳离子MBiR⑶微泡；
[0057] ③将所得生物素化的阳离子MBiR⑶微泡用PBS借助离心漂浮法清洗三次，然后加 入60 y g抗CCR2抗体孵育20分钟，离心清洗除去过量的未结合的抗体，制得携iRGD穿膜 肽双靶向阳离子超声微泡。
[0058] 制成所述超声微泡成分为：DSPC、DSPE-PBG200(Hiialeimide、DSPE-PEG2000-Biotin、iR3D 肽、 抗CCR2抗体、硬脂酸、支链聚醚酰亚胺~600、N，N' _羰基二咪唑、抗生物素蛋白。
[0059] 所述纯化的Stearic_PEi600在大型离心机清洗时转数为3000rpm。
[0060] 所述Tris缓冲溶液含10%甘油和10%丙二醇，pH为7. 4。
[0061] 所述离心漂浮法清洗时，清洗速度设置为400g/min，每次清洗4min，所述生物素 化的阳离子MBiR⑶微泡用PBS进行离心漂浮法清洗之前，每1 X 108的生物素化的阳离子 MBiR⑶微泡加入50 y g亲和素（AD)并在室温下孵育20分钟。
[0062] 下面结合非靶向微泡（MB_tral)和单靶向微泡（MBlReD、MBeeR2)对本发明做进一步阐 述。
[0063] 1、微泡肽/抗体连接率检测：
[0064] (1)采用硫醇-马来酰亚胺连接法通过特定基团间的反应偶联iRGD肽，用生物 素-亲和素连接法通过非共价键结合连接抗CCR2抗体，两种不同方法的使用，避免了只采 用同一种连接方法造成的竞争引起两者连接数量过大的差异。
[0065] (2)流式细胞仪检测：MBlRGD主要于FL1-A通道（检测FITC)被检出，MB CCR2主要于 FL2-A通道（检测PE)被检出，而MBlRm/ra?2均能被上述两通道检出。MB 11?(；：)上iR⑶肽的结 合率为（96. 13±L 50) %，MBCCR2上抗 CCR2 抗体的结合率为（90. 65±3. 71) %，MB lRSD/CCRJ 两者的结合率分别为（96. 24±2. 06) %和（90. 91 ±3. 53) %，靶向微泡肽或抗体的结合率 均大于90%，使用的这两种连接方法均能较好地偶联配体或抗体，并且使肽和抗体较均匀 地装载于微泡表面。
[0066] 2、非靶向及靶向阳离子微泡体外黏附效果
[0067] (1)微泡与细胞的黏附情况于光学显微镜和焚光显微镜下观察。
[0068] (2)被DAPI荧光染料染色的bEnd. 3细胞核呈现蓝色，在bEnd. 3细胞周围，几乎无 MBccintrc^附，单靶向荧光微泡MB i和MB CCR2能较多地聚集、结合在bEnd. 3细胞周围，两者 的黏附率分别为（1. 79±0. 22)微泡/细胞和（1. 49±0. 30)微泡/细胞，而双靶向荧光微 泡MBlRm