miR-338-5p及靶向作用于miR-338-5p核酸制剂的新用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种miRNA的新用途，特别涉miR-338-5p在调节B淋巴细胞产生IgG 的新用途。
【背景技术】
[0002] 对于器官移植受者来说，抗同种抗体导致的临床处理是最棘手的。
[0003] 目前临床治疗抗体介导排斥反应主要是通过以下机制：抑制T/B细胞作用，如抗 淋巴细胞抗体、霉酚酸脂、钙调神经蛋白抑制剂；清除循环抗体，如血浆置换或免疫吸附； 阻断已生成抗体介导的初级或次级损伤，如静脉注射免疫球蛋白或巨细胞病毒免疫球蛋 白；抑制或清除B细胞，如利妥昔单抗。迄今为止，临床上仍缺乏单一有效的治疗方法，绝大 部分治疗方案是将不同的治疗方法进行组合以期达到较佳的治疗效果。目前临床治疗抗体 介导排斥的局限体现在以下几个方面：
[0004] (1)抗体介导排斥的逆转是缓慢的而不是迅即的；
[0005] (2)费用昂贵；
[0006] (3)逆转率低于80%;
[0007] (4)治疗后出现慢性排斥的常见表现；
[0008] (5)治疗后，抗供者特异性抗体长期存在。
[0009] 原因是不能有效地作用于成熟衆细胞。Bortezomib是蛋白酶抑制剂，清除产生抗 体的浆细胞，抑制MAC形成。有治疗抗体介导排斥的成功病例。然而合适的治疗剂量及疗 程尚待研究。肾移植患者应用后的副作用包括：胃肠道毒性、血小板减少症、贫血、低血压和 感觉异常。
[0010] 免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig)是具有抗体活性的蛋白质，在人体免疫应答中 起关键作用。作为B细胞的细胞表面受体，Ig在细胞的活化、分化或程序性细胞死亡等多种 细胞活动过程中均扮演重要角色。Ig通常能同步实现其结合功能和发挥特异的生物效应。 适量的高亲和力IgG的存在是再次体液性免疫应答的一个标志。
[0011] 特异性识别自体组织抗原的Ig被称为自身抗体，过量自身抗体的存在将导致免 疫损伤，是器官移植后排异反应、自身免疫病（如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等）的发 病机制。IgG是由浆细胞分泌产生的，浆细胞经B细胞发育、分化而来。因而Ig的产生受 Ig基因本身的表达调控外，与B细胞存活、分化、发育等密切相关。成功的B细胞分化依赖 于细胞信号转导过程的平衡和活化过程的精细调节。这些生命过程均需要相关基因的精细 表达调控。
[0012] 微小RNA(microRNA，简称miRNA)是一类短序列、非编码、具有调控功能的单链小 分子核酸，长约18-24碱基。到目前为止，公用miRNA数据库中已收录了千余种人类miRNA 序列，其中三分之二已被实验证实。微小RNA来源于长度约为lOOObp的长链RNA初始转 录产物（Pri-miRNA)，Pri-miRNA分子在细胞核中经Drosha酶剪切形成长度为60-80碱基 的具有茎环结构的miRNA前体（Pre-miRNA)。miRNA前体转运至胞质后，被进一步加工成 miRNA。miRNA与靶基因（mRNAs)3'_未翻译区（UTR)互补结合，通常在转录后水平抑制翻 译和/或减弱mRNA稳定性，发挥抑制作用。但亦有研究认为，miRNAs可随着细胞周期的进 程发挥或抑制或活化的作用。在发生增殖的细胞，扮演抑制作用，而在G1/G0静止期，将发 挥活化作用。
【发明内容】
[0013] 本发明要解决的技术问题是：提出miR-338-5p及核酸制剂在调节B淋巴细胞分泌 IgG方面用途。
[0014] 本发明为解决上述技术问题提出的技术方案是：miR-338-5p的新用途，所述新用 途是指miR-338-5p在制备通过调节B淋巴细胞的功能用以治疗器官移植后抗体介导免疫 排斥的药物中的用途。
[0015] 可作为优选的是，所述调节B淋巴细胞的功能是指调节B淋巴细胞分泌IgG的能 力。
[0016] 可作为优选的是，所述B淋巴细胞为已处于B细胞活化因子（BAFF)刺激作用下B 淋巴细胞。
[0017] 祀向作用于miR-338-5p核酸制剂的新用途，所述新用途是指在制备通过调节B淋 巴细胞的功能用以治疗器官移植后抗体介导免疫排斥的药物中的用途。
[0018] 可作为优选的是，所述调节B淋巴细胞的表达是指调节B淋巴细胞分泌IgG的能 力。
[0019] 可作为优选的是，所述B淋巴细胞为已处于BAFF刺激作用下B淋巴细胞。
[0020] miR-338-5p的新用途，所述新用途是指miR-338-5p在制备调节B淋巴细胞分泌 IgG能力药物中的用途。
[0021 ] 祀向作用于miR-338-5p核酸制剂的新用途，所述新用途是指在制备调节B淋巴细 胞分泌IgG能力药物中的用途。
[0022] 本发明的有益效果是：
[0023] 本发明通过利用生物信息学和现代生物学技术手段对miR-338-5p进行研究分 析，发现miR-338-5p靶向作用于TRAF3和NF-kB1，可以调节已处于BAFF刺激作用下B细 胞分泌IgG的能力。
[0024] 这一结果表明可以将miR-338_5p及核酸制剂设计为小核酸药物，具备药物治疗 的潜力。不仅仅是治疗抗体介导排斥的潜在药物，而且对于与BAFF信号增强显著相关的如 系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等自身免疫病亦具有潜在的治疗作用。
【附图说明】
[0025] 图1是miR-338-5p靶向调控TRAF3的双荧光素酶报告实验结果；
[0026] 图2是miR-338-5p靶向调控NF-kB1的双荧光素酶报告实验结果；
[0027] 图3是miR-338-5p激动剂和拮抗剂、以及NF-kB1 siRNA转染对CD20+B淋巴细 胞表达NF-kB1 mRNA水平的影响结果；
[0028] 图4是miR-338-5p激动剂和拮抗剂、以及NF-kB1 siRNA转染对CD20+B淋巴细 胞表达NF-kB1 (pl05/p50)蛋白水平的影响结果；
[0029] 图5是miR-338-5p激动剂和拮抗剂、以及NF-kB1 siRNA转染对CD20+B淋巴细 胞分泌IgG能力的影响结果；
[0030] 图6是miR-338-5p激动剂和拮抗剂、以及TRAF3 siRNA转染对⑶20+B淋巴细胞 表达TRAF3 mRNA水平的影响结果；
[0031] 图7是miR-338-5p激动剂和拮抗剂、以及TRAF3 siRNA转染对⑶20+B细胞分泌 IgG能力的影响结果；
[0032] 图8是NF-kB1 mRNA相对表达量与细胞培养上清中IgG浓度的相关性示意图；
[0033] 图9是肾移植患者与健康对照人群血清中miR-338_5p表达水平的比较；
[0034] 图10是血清可溶性BAFF与miR-338-5p水平相关性分析；
[0035] 图11是血清miR-338-5p与血清抗HLA II抗体水平的相关性分析；
[0036] 图12是血清可溶性BAFF与血清抗MICA抗体水平的相关性分析；
[0037] 图13是血清可溶性BAFF与血清抗HLA&MICA抗体水平的相关性分析。
【具体实施方式】
[0038] 实施例1
[0039] miR-338_5p的革E基因筛选及验证，miR-338_5p为公知序列，其序列可在miRBase 数据库（http ://www. mirbase.org)中查询得到：
[0040] 1、miR数据库搜索：搜索公用miR数据库，发现miR-338-5p的靶基因有608个， 包括TRAF3和NF-kBl。TRAF3只受miR-338-5p调节，与其他差异miR不存在调控关系。 构建了 miR-338-5p 的 miR-Reg-Net，根据 TargeScan 分析和 G0 分析，TRAF3 的 3' -UTR 含有miR-338-5p的互补位点，可能是miR-338-5p的靶基因；而NF-kBI的3' -UTR含有 miR-338_5p的互补位点，亦可能是miR-338_5p的革E基因。
[0041] 2、双荧光素酶报告基因检测miR-338-5p对TRAF3和NF-kB1表达的调控作用：
[0042] (1)报告质粒载体的构建
[0043] 分别将TRAF3和NF-kB1基因的3' -UTR克隆至载体pmiR-RB-R印ortTM上的海 肾荧光素酶基因（hRluc)下游位点，以海肾荧光素酶基因作为报告基因，以荧光素酶基因 (hLuc)作为内参基因，通过检测海肾荧光素酶活性的相对变化来鉴定miR-338-5p对TRAF3 和NF-kB1基因是否有调控作用。同时构建突变载体（以TRAF3和NF-kB1基因的3'-UTR 定向突变体进行构建）。
[0044] (2)细胞转染
[0045] 取5代以内对数生长期、生长状态良好的293T细胞，用DMEM高糖培养基（含10% 胎牛血清、100U/mL青霉素、100 y g/mL链霉素）培养，以3 X 104个/孔的细胞密度铺96孔 板，分为4组：实验组1 :3' -UTR报告载体+miR-338-5p模拟剂；实验组2 :3' -UTR报告载 体+miR-338-5p模拟剂的阴性对照；实验组3 :3' -UTR突变体报告载体+miR-338-5p模拟 剂；实验组4 :3' -UTR突变体报告载体+miR-338-5p模拟剂的阴性对照。
[0046]转染混合液的制