备：（1)用25 ii 1不含血清培养基Opti-MEM?I稀释 25pmolmiRNA模拟剂（作用终浓度为50nM)，轻轻混匀，室温孵育5分钟；（2)用15 y 1不含 血清培养基Opti-MEM?I稀释200ng重组质粒，轻轻混匀；（3)用10 y 1不含血清培养基 Opt i-MEM?I稀释1 y 1脂质体2000,轻轻混匀并室温孵育5分钟。
[0047] 将上述三种试剂轻轻混匀，室温孵育20分钟。
[0048] 吸除96孔培养板中的培养基，用无血清培养基Opti-MEM? I洗1-2遍，轻轻晃 动，倾斜吸除，最后加50 ii 1 Opti-MEM? I培养基；将转染混合液加入相应细胞中，轻轻混 匀；将细胞培养板置于37°c二氧化碳培养箱中培养4-6小时，更换完全培养基，继续培养48 小时后检测荧光素酶活性。
[0049] (3)荧光素酶活性测定
[0050] 按Dual_Gl〇? Luciferase Assay System 说明书进行操作。
[0051] 1)将试剂盒的荧光底物与缓冲液混合后分装，-80°C保存。使用前平衡至室温。终 止液分装后_80°C保存。配置好的荧光底物使用前平衡至室温，并取适量加入终止液，现配 现用。
[0052] 2)取出待检测的培养板，吸去培养基，加入75 y 1/孔新鲜培养基，并加入75 y 1现 配的荧光底物，涡旋振荡10分钟，利用荧光照度仪检测荧光值（hLuc值）。
[0053] 3)加入现配的75 y 1终止液，振荡10分钟，利用荧光照度仪检测荧光值（hRluc 值）。设空白对照孔（blank)。每孔最终焚光素相对比值=(hRluc-blank)/(hLuc_blank)
[0054] 测定结果如图1和图2所示。
[0055] 在图1中，实验组1 :表达野生型TRAF3 3' -UTR序列的质粒+miR-338-5p模拟剂 的阴性对照；
[0056] 实验组2 :表达野生型TRAF3 3' -UTR序列的质粒+miR-338-5p模拟剂；
[0057] 实验组3 :表达突变TRAF3 3' -UTR序列的质粒+miR-338-5p模拟剂的阴性对照；
[0058] 实验组4 :表达突变TRAF3 3' -UTR序列的质粒+miR-338-5p模拟剂。
[0059] 结果显示：与实验组1比较，实验组2的荧光素酶相对活力显著下调（P <0? 05)。 实验组3与4之间没有显著差异。
[0060] 在图2中，实验组1 :表达野生型NF-kB1 3' -UTR序列的质粒+miR-338-5p模拟 剂的阴性对照；
[0061] 实验组2 :表达野生型NF-kB1 3' -UTR序列的质粒+miR-338-5p模拟剂；
[0062] 实验组3 :表达突变型NF-kB1 3'-UTR序列的质粒+miR-338-5p模拟剂的阴性对 昭. ，
[0063] 实验组4 :表达突变型NF-kB1 3' -UTR序列的质粒+miR-338-5p模拟剂。
[0064] 结果显示：与实验组1比较，实验组2的荧光素酶相对活力显著上调P <0? 05)。 实验组3与4之间没有显著差异。
[0065] 根据图1和及数据：miR-338_5p模拟剂显著下调了报告基因海肾荧光素酶的表 达，即miR-338-5p靶向抑制TRAF3。
[0066] 根据图2和及数据：miR-338_5p模拟剂显著上调了报告基因海肾荧光素酶的表 达，即miR-338-5p靶向上调NF-kB1。
[0067] 因此，TRAF3和NF-kB1受miR-338-5p的靶向调节。miR-338-5p靶向负调控 TRAF3, miR-338-5p 靶向正调控 NF-kB1。
[0068] 实施例2
[0069] 从新鲜切除的扁桃体组织中分离纯化⑶20+B淋巴细胞。
[0070] 1、扁桃体组织的处理：
[0071] 1)新鲜切除的扁桃体组织迅速置于冰盒，送至无菌室；
[0072] 2)用75 %酒精冲洗组织；
[0073] 3)将组织置于含青/链霉素500U/ml、氟康唑300U/ml的PBS中漂洗30分钟；
[0074] 4)将组织剪碎，置于200目不锈钢过滤网内，用研磨棒轻轻研磨，收集细胞悬液；
[0075] 5)细胞计数并流式分析细胞表型。
[0076] (2)流式分析细胞表型：
[0077] 1)取部分单细胞悬液，以荧光抗体（CD19、⑶20、BAFF-R、⑶3等）进行标记；
[0078] 2)室温孵育30分钟；
[0079] 3)用含 0.05% BSA 的 PBS 洗 2 遍；
[0080] 4)加400 y 1鞘液上机检测。
[0081] (3)磁珠分选CD20+B淋巴细胞
[0082] 1)根据流式检测结果得到的CD20+B淋巴细胞所占比例，取相应细胞数用以磁珠 分选；
[0083] 2) lOOOrpm离心5分钟，完全弃去上清；
[0084] 3)每107细胞加80 y 1MACS缓冲液，轻轻吹散，混匀；
[0085] 4)每加80 y 1 MACS缓冲液，对应加入20 y 1⑶20标记磁珠；
[0086] 5)混匀后，置于4°C冰箱孵育15分钟；
[0087] 6)每107细胞加1~2ml MACS缓冲液混匀，lOOOrpm离心10分钟，弃上清；
[0088] 7)每10s细胞重悬于500 y 1 MACS缓冲液中；
[0089] 8)选择LS分离柱和midiMACS分离器，安装好分选装置；
[0090] 9)用3ml MACS缓冲液湿润分离柱，用废液罐收集自分离柱流出的废液；
[0091] 10)将步骤7中的细胞悬液加入分离柱中，未标记的细胞流出，标记的目的细胞滞 留在柱子上；
[0092] 11)用3ml MACS缓冲液清洗离心管，将其加入分离柱，重复3次；
[0093] 12)将分离柱从分离装置上取下，置于目的细胞收集管上，加5ml MACS缓冲液，迅 速洗脱目的细胞；
[0094] 13)离心，弃去上清，加无血清0PTI-MEM培养基重悬，使细胞密度为6X106个/ ml ；
[0095] 14)计数细胞，分别用以直接转染miR-338_5p激动剂、拮抗剂及相应阴性对照；或 间接转染 TRAF3 siRNA、NFkBl siRNA 制剂；
[0096] 15)直接转染管中加等体积0PTI-MEM培养基，稀释细胞密度至3 X 106个/ml ;
[0097] 16)取部分细胞进行流式检测细胞表型（⑶20、BAFF-R等）。
[0098] 实施例3
[0099] 本实施例是将实施例2中所获得细胞进行转染试验，将待转染细胞置于96孔板中 培养，密度为3 X 105/孔，分成8组，每组12复孔。研究分组如下：
[0100] A、miR-338-5p激动剂组、miR-338-5p激动剂阴性对照组；
[0101] B、miR-338-5p拮抗剂组、miR-338-5p拮抗剂阴性对照组；
[0102] C、NF-kB1 siRNA 或 TRAF3 siRNA 转染组、NF-kB1 siRNA 或 TRAF3 siRNA 阴性对 照转染组；
[0103] D、NF-kB1 siRNA 或 TRAF3 siRNA+miR-338-5p 激动剂共转染组；
[0104] E、NF-kB1 siRNA 或 TRAF3 siRNA+miR-338-5p 拮抗剂共转染组。
[0105] miR-338-5p激动剂及相应阴性对照、miR-338-5p拮抗剂及相应阴性对照、siRNA 制剂的存贮浓度均为20 yM。
[0106] 转染时，将miR-338-5p相关制剂直接加入细胞悬液混勾，siRNA制剂通过脂质体 2000进行转染。具体方法如下：
[0107] a、直接转染miR-338-5p激动剂/拮抗剂方法：
[0108] 1)取98 y 1细胞悬液，添加2 y 1激动剂混匀；
[0109] 2)激动剂阴性对照、拮抗剂、拮抗剂阴性对照转染方法同前。终浓度均为200nM ;
[0110] b、脂质体2000转染TRAF3 siRNA、NF-kB1 siRNA及各自阴性对照：
[0111] 1)0. 25yl脂质体2000以25yl 0PTI-MEM稀释，轻轻混匀，室温孵育5分钟； 0. 25 y IsiRNA存贮液以25 y 1 0PTI-MEM稀释，轻轻混匀，室温孵育5分钟；
[0112] 2)将稀释好的脂质体2000和siRNA混合，室温孵育20分钟；
[0113] 3)取细胞悬液50 y 1，加入脂质体与siRNA混合液，轻轻混匀；
[0114] 4)设miR-338-5p激动剂组和拮抗剂组，每孔分别加入miR-338-5p激动剂或拮抗 剂各2 yl，混匀；
[0115]5)细胞板置37°C，5% C02培养箱中培养4~6小时；
[0116] 然后，每孔添加新鲜的完全培养基100 y 1，同时加入抗IgM抗体2 y g/ml和重组人 BAFF蛋白200ng/ml、或仅加入抗IgM抗体2 y g/ml作用。
[0117] 至培养第4天时，