一种检测二氧化硫衍生物的荧光探针、检测物、制备方法和应用与流程

本发明属于应用生物技术领域，具体是涉及到一种检测二氧化硫衍生物的荧光探针、检测物、制备方法和应用。

背景技术：

作为抗菌剂、抗氧化剂和酶抑制剂，二氧化硫的衍生物(亚硫酸根/亚硫酸氢根)被广泛用作食品、医药产品和饮料等领域。然而，研究表明，过高浓度的亚硫酸根/亚硫酸氢根对细胞、组织和生物分子有较大的伤害，从而引起许多疾病，如癌症、偏头痛、缺血性心脏病和过敏反应等。由于潜在的健康问题，许多国家严格限制了食品、饮料中的亚硫酸根/亚硫酸氢根的含量。如美国食品和药物管理局要求食品中亚硫酸盐的含量不能超过10mg/ml。因此，开发一种灵敏、高选择型、低成本的分析方法用于食品、生物中亚硫酸根/亚硫酸氢根的检测十分必要。

目前，亚硫酸根/亚硫酸氢根的检测方法主要有电化学法、色谱法、化学发光法以及酶技术。然而，上述方法大多数都需要样本进行预处理、检测仪器昂贵复杂且耗时长。相比之下，荧光探针法由于具有反应快、选择性高、便宜、方便以及可以直接用于生物物种的检测等优点，更具有吸引力。然而，目前发展的基于与醛的亲核反应、迈克尔加成反应、乙酰丙酸盐的选择性脱保护等机理的亚硫酸根/亚硫酸氢根荧光探针仍然存在一定的不足。如许多荧光探针发射波长短，这易受激发光的干扰且不利于生物深层组织亚硫酸根/亚硫酸氢根的检测；一些荧光探针响应时间长以及水溶性差(需要有机溶剂或表面活性剂的协助)，这不利于其在生物中的应用。另外一些荧光探针仅能进行荧光检测亚硫酸根/亚硫酸氢根，无法实现肉眼的比色检测，这不利于食品中亚硫酸根/亚硫酸氢根的快速检测。

检测二氧化硫衍生物、次氯酸根的荧光探针的设计合成及生物成像应用，谭锐，华南师范大学硕士研究生学位论文，2017.5.26，描述了应该探针的具体种类，包括结合型荧光探针、置换型荧光探针和化学计量计型荧光探针。其中常见的荧光染料包括：香豆素类荧光染料、萘酰亚胺类荧光染料、氟硼吡咯(bodipy)类荧光染料、荧光素和罗丹明类荧光染料、花菁类荧光染料。二氧化硫衍生物及细胞核荧光探针的设计合成及细胞成像，李琛，中国科学技术大学硕士论文，2019年5月，p29描述花菁类荧光染料的设计。由于花菁染料具有较大的消光系数和较高的荧光量子产率，选择苯并半花菁为受体，为了增加其水溶性将其做成碘盐的形式，苯并半花菁碘盐为受体，含氮环化物作为供体，将两者通过苯并双键连接后，探针分子则为d-π-a结构。基于ict机理，设计了三个荧光探针分子，α,β不饱和双键作为反应位点，随着含氮环状物的环大小和环张力的改变，其给电子能力会发生一定程度的改变。

中国专利申请号为cn201910389203.7，名称为一种用于二氧化硫_亚硫酸(氢)盐检测的荧光探针及其制备方法和应用，公开了一种荧光探针，结构式为：

其中，式(i)中，r1为h，烷基，烷氧基，氨基，烷基取代的单取代氨基，烷基取代的二取代氨基，卤素以及硝基中的一种或多种组合；n为1-3的整数；r2为烷基，芳基，烷基芳基以及芳基烷基中的一种；x为卤素；其中，r2上任意的氢原子可任选的被取代或非取代。此探针分子为d-π-a结构，随着亚硫酸钠溶液浓度的提高，反应液的颜色由紫色逐渐消褪，与270μm亚硫酸钠反应后的溶液颜色几乎变为无色。在探针(10μm)与so3^2-(500μm)反应30min后，荧光强度达到稳定。虽然采用的是碘盐的形式，但是其水溶性并不好，需要采用溶剂进行溶解，溶剂为乙醇或者二甲亚砜等。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种检测二氧化硫衍生物的荧光探针、检测物、制备方法和应用，本申请响应速度快、水溶性好，灵敏度高，不仅能满足生物体中亚硫酸根/亚硫酸氢根的检测需求，而且可以实现对食品中亚硫酸根/亚硫酸氢根的快速检测。

本发明包括一种检测二氧化硫衍生物的荧光探针，所述二氧化硫衍生物为带有亚硫酸根或亚硫酸氢根离子的盐类，所述荧光探针的结构式为：

其中tfo^-为三氟甲磺酸根离子。

所述带有亚硫酸根或亚硫酸氢根离子的盐类为任何能够游离出亚硫酸根或亚硫酸氢根离子的物质，包括无机盐类和有机盐类。

本发明提供一种包含荧光探针的检测物，比如检测试剂，检测试纸等。

本发明提供一种荧光探针的制备方法，包括如下步骤，将化合物1和三氟甲磺酸甲酯溶于有机溶剂中，混合，过滤，反应得到所述荧光探针，所诉化合物1的结构式为：

所述化合物1和三氟甲磺酸甲酯的摩尔比为1:(2-4)，所述有机溶剂为三氯甲烷。

本发明提供一种荧光探针的应用，所述应用为，

荧光探针在检测细胞或生物体中亚硫酸根或亚硫酸氢根离子的浓度中的应用，或者

荧光探针在检测食品或药品中亚硫酸根或亚硫酸氢根的浓度或者残留量中的应用。

发明的荧光探针在检测细胞或生物体中亚硫酸根或亚硫酸氢根离子的浓度时，由于亚硫酸根或亚硫酸氢根离子的浓度并不能直接指示某种特定疾病的患病程度，其直接目的不是获得也不能获得诊断结果或健康状况，而只是从人体或动物体获取作为中间结果的信息，因此，其不属于疾病的诊断方法。

本申请探针以双喹啉盐为荧光染料，以三氟甲磺酸喹啉盐中4位c＝c双键为亚硫酸根/亚硫酸氢根的反应位点。探针自身具有a-π-a结构，没有荧光发射。当加入亚硫酸根/亚硫酸氢根时，亚硫酸根/亚硫酸氢与三氟甲磺酸喹啉盐中的4位c＝c双键发生1,4-加成反应，接着重排，探针分子形成了d-π-a结构，在620nm处有红色荧光发射出现，溶液颜色随至由无色变成红色。

本发明在碳碳双键的一端连接荧光染料喹啉a，在双键的另一端也连接有喹啉b，而不是一般的苯环基团(此时为d-π-a结构，有荧光)。发明人发现，三氟甲磺酸喹啉作为亚硫酸根或亚硫酸氢根的识别基团，碘代喹啉作为拉电子基团，此时探针分子由于分子内电子转移(ict)过程禁止，无荧光，形成a-π-a结构。三氟甲磺酸喹啉与亚硫酸根/亚硫酸氢根作用后，经重排，由拉电子基团变成供电子基团，分子内可实现ict过程，发出远红外荧光。

本申请喹啉b的连接位点和喹啉a的连接位点不同，碳碳双键一端连接在喹啉a的n原子的对位，另一端连接在喹啉b的n原子的间位。发明人发现，只有三氟甲磺酸喹啉间位与碳碳双键相连，4位c＝c双键才能与亚硫酸根或亚硫酸氢根作用，才能检测亚硫酸根或亚硫酸氢根。碘代喹啉与双键相连的位置不固定，但氮正离子须与双键形成有效的共轭体系。

本申请连接在其中一个喹啉上的阴离子为碘离子，连接在另一个喹啉上的阴离子为三氟甲磺酸根离子。发明人发现，喹啉上的阴离子为三氟甲磺酸根离子作为识别基团与亚硫酸根或亚硫酸氢根作用后通过重排可以很好的离去，形成给电子结构；另外一个喹啉上的阴离子为碘离子只是合成的一种方式，只要该喹啉氮能形成氮正离子即可。

本发明的有益效果是，本申请的荧光探针，为比色远红外亚硫酸根/亚硫酸氢根荧光探针，具有全水溶性，能直接溶解在水中，不需要额外的有机溶剂进行溶解；响应快，在15s内就能完成检测；检测的显色方式是从无色到有色，能直接肉眼检测，检测更加直观方便，假阳性低；本发明对亚硫酸氢钠的最低检测限为0.11μm，灵敏度更高。本发明不仅能满足生物体中亚硫酸根/亚硫酸氢根的检测需求，而且可以实现对食品或药品中亚硫酸根/亚硫酸氢根的快速检测。

附图说明

图1为探针化合物dq的¹hnmr图谱。

图2为探针化合物dq的¹³cnmr图谱。

图3为探针化合物dq加入亚硫酸根/亚硫酸氢根前后的荧光强度变化图。

图4为探针化合物dq的荧光强度与亚硫酸氢根浓度变化关系图。

图5为本发明荧光探针的荧光强度与亚硫酸氢根浓度的线性关系图。

图6为探针化合物dq加入亚硫酸氢根紫外可见光吸收光谱图。

图7为探针化合物dq与亚硫酸氢根作用前后荧光强度随时间的变化图。

图8为探针化合物dq与亚硫酸氢根作用前后荧光强度随ph的变化图。

图9为探针化合物dq与不同的生物活性物种作用后的荧光强度变化图。

(1)dqonly，(2)f^-，(3)cl^-，(4)br^-；(5)i^-，(6)aco^-，(7)no2^-，(8)no3^-，(9)hpo4^-，(10)co3^2-，(11)h2po4^-，(12)clo3^-，(13)s^2-，(14)scn^-，(15)so4^2-，(16)hcy，(17)cys，(18)gsh，(19)h2o2，(20)clo^-，(21)hso3^-。

图10探针dq对亚硫酸氢根的比色检测图。

图11为本发明探针检测亚硫酸氢根的响应机理图。

具体实施方式

实施例1

本发明荧光探针(即探针dq)的制备方法的反应路线如下：

将化合物1(212mg，0.5mmol)和三氟甲磺酸甲酯(164mg，1mmol)溶于10ml三氯甲烷中，溶液室温搅拌过夜，抽滤，得化合物dq(223mg，产率76％)。如图1-2所示，¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ(ppm):10.15(s,1h),9.64(s,1h),9.54(d,j＝6.4hz,1h),9.02(d,j＝8.4hz,1h),8.73(d,j＝16.4hz,1h),8.61-8.52(m,4h),8.39-8.29(m,3h),8.22-8.12(m,2h),4.75(s,3h),4.64(s,3h)；¹³cnmr(100mhz,dmso-d6)δ(ppm):151.4,150.4,149.6,145.3,139.3,138.3,136.6,135.9,135.7,131.4,131.2,130.4,130.0,129.4,127.2,126.5,125.9,120.3,119.9,118.0,46.4,45.7。

实施例2探针dq对亚硫酸氢根响应的吸收光谱和对亚硫酸根/亚硫酸氢根的荧光光谱

将探针化合物dq溶于pbs溶液中(20mm,ph7.4)，配置成1mmol/l的溶液。向移取的探针dq溶液中加入pbs缓冲液(20mm,ph7.4)，稀释至10μm(20mm,ph7.4)的待测溶液。向待测溶液加入亚硫酸根或亚硫酸氢根，用荧光光谱和紫外光谱仪测试其荧光发射光谱的变化情况，反应机理如图11所示。由图3可知，探针dq在620nm处无荧光发射，加入亚硫酸根或亚硫酸氢根之后，探针在620nm处都出现了强荧光发射峰，这说明亚硫酸根或亚硫酸氢根都可以引起探针荧光发射的增强。由图4可知，探针溶液在620nm处的荧光发射随着亚硫酸氢根浓度的不断增加而增强。由图5可知，荧光强度和亚硫酸根浓度成线性关系，检测下线为0.11μm(计算公式为lod＝3σ/k，其中σ为空白样品连续测定多次的标准偏差，k为标准曲线斜率)，说明探针dq能够定量、超灵敏的检测亚硫酸氢根离子。从图6可以看出，加入亚硫酸氢根之前，探针溶液的在323nm处有一强的紫外吸收，加入亚硫酸氢根之后，323nm处紫外吸收变弱，同时在550nm处新出现了一新的紫外吸收峰，溶液颜色由无色变成红色。由此可见，该探针dq在全水溶液中可以实现对亚硫酸根或亚硫酸氢根的肉眼和远红外检测。

实施例3探针dq对亚硫酸氢根的时间研究

通过测试探针dq对亚硫酸氢根响应的荧光强度变化，探讨了dq对亚硫酸氢根作用的动力学。由图7可知，在探针dq溶液加入亚硫酸氢根后，荧光强度随时间的变化而逐渐增强，荧光强度在15秒中内可以达到最大，说明探针dq可以快速检测亚硫酸氢根离子。

实施例4ph值变化对探针dq与亚硫酸氢根作用的荧光强度影响

通过测试不同ph条件下探针dq对亚硫酸氢根响应的荧光强度变化，探讨了ph值变化对探针dq与亚硫酸氢根作用的影响。由图8可知，ph在4-10之间，探针dq均能对亚硫酸氢根响应。由此可见，探针dq可在生理ph条件下实现对亚硫酸氢根的检测。

实施例5探针dq对亚硫酸氢根的选择性研究

在探针dq溶液中分别加入不同的生物活性物种，分别测试了探针dq的荧光强度变化。由图9可知，在探针dq溶液中加入亚硫酸氢根后，荧光强度在620nm处发生了明显的增强，而加入其它生物活性物种，荧光强度在620nm处几乎没有发生变化，说明探针dq能够选择性的实现亚硫酸氢根检测。

实施例6探针dq对亚硫酸氢根的比色检测

将滤纸浸泡1mmol/l的探针溶液中，烘干制成试纸条，然后将试纸条浸入不同浓度的亚硫酸氢根水溶液中(a.none，b.1×10^-6m，c.1×10^-5m，d.1×10^-4m，e.1×10^-3m和f.1×10^-2m)，晾干后再可见光下拍照，从a到f，颜色由无色逐渐变化为紫红色，且颜色逐渐加深。由图10可知，在可见光下，试纸条的颜色随着亚硫酸氢钠浓度增大不断加深，说明探针dq能够方便的实现亚硫酸氢根的试纸条检测。

实施例7溶解度试验

直接称取5.8mg探针化合物dq溶于10mlpbs溶液中(20mm,ph7.4)，摇匀后得到澄清透明溶液。说明探针化合物dq可以直接溶于水溶液中，水溶性好。