一种基于超声波辅助槐糖脂沉降的半连续发酵方法与流程

本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种基于超声波辅助槐糖脂沉降的半连续发酵方法。

背景技术：

槐糖脂是(sophorolipids，sls)是最具前途的生物表面活性剂，具有低毒、生物降解性等特点，广泛应用于食品、化妆品、制药和石油工业。目前已报道多种微生物可以合成槐糖脂，例如candida，wickerhaniella，pichia等。其中candidabombicola菌株是目前槐糖脂合成生产能力最高的菌株之一，已经在工业生产中应用。槐糖脂的结构主要由两个葡萄糖组成的亲水基团与一个16-18碳的脂肪酸链的疏水基团以β-糖苷键形成酸型槐糖脂，如图1a。而酸型槐糖脂的末端羧基与亲水基团4”端羟基在内酯酶的作用下发生酯化反应形成内酯型槐糖脂，如图1b。此外，槐糖脂还根据在葡萄糖c6′和c6″上发生的乙酰化，分为非乙酰化、单乙酰化和双乙酰化产物，以及脂肪酸链长、饱和度等都会影响槐糖脂的结构和特性。研究表明槐糖脂是具有20多种不同结构的混合物。并且在发酵过程中，不同结构的槐糖脂具有不同的性质，内酯型槐糖脂的水溶性较差，容易在发酵液中形成结晶，而酸型槐糖脂的水溶性较好。因此槐糖脂发酵是一个包含固体结晶、油脂、菌体等多相的复杂发酵体系。请继续参考图1a和图1b，非乙酰化(r1,r2＝-oh)，单乙酰化(r1＝-oh，r2＝-och3)和双乙酰化(r1,r2＝-och3)。

生物表面活性剂由于其绿色环保、生物相容性较好等优点，具有非常广阔的市场。而生产槐糖脂的菌株是非致病性酵母，安全性比鼠李糖脂高(由pseudomonasaeruginosa生产)。但是，由于较高的生产成本，槐糖脂的竞争力低于化学表面活性剂。由于在发酵过程中累积的槐糖脂以及油脂会影响发酵液的流变特性和传质混合，影响发酵后期槐糖脂合成。因此半连续发酵成为提高槐糖脂产量、降低成本的一种重要手段。目前，对于半连续发酵主要根据槐糖脂与发酵液发生分层，然后回收槐糖脂，循环利用发酵液上清分离，是目前提高槐糖脂产量降低成本的主要方法。由于原位分离中槐糖脂的沉降是关键点，因此如何加快槐糖脂的沉降速率具有重要意义。

因此，亟需提供一种基于超声波辅助槐糖脂沉降的半连续发酵方法，通过引入超声波辅助加快槐糖脂原位分离的速度，减少菌体损失，从而实现高效、快速槐糖脂基于原位分离的半连续发酵。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供一种基于超声波辅助槐糖脂沉降的半连续发酵方法，在槐糖脂发酵过程中引入超声波处理以分离槐糖脂，可以在油脂比例较低的环境下加快槐糖脂的沉降速率，同时降低原位分离底物和细胞的损失。

为了实现上述目的，本发明采取了以下技术方案。

本发明提供了一种基于超声波辅助槐糖脂沉降的半连续发酵方法，所述方法包括：种子培养的步骤；槐糖脂发酵的步骤；其中，在所述槐糖脂发酵的步骤中，对发酵液进行超声波处理，辅助槐糖脂沉降。

进一步，所述槐糖脂发酵的步骤包括：将经种子培养后的菌株接种至发酵培养基中，接种量为2.9％(od600为80)，发酵温度为25℃，通气量为0.5vvm，初始转速为200rpm，在发酵罐中进行发酵，其中，发酵过程中，以3g/h速率流加油脂到发酵液中，并维持发酵液ph为3.5。

进一步，在所述槐糖脂发酵的过程中，所述超声波处理的步骤包括：将发酵液转移至置于超声波平台的分离装置中，并对所述发酵液进行超声波处理10min，超声波功率为100～300w，以沉降槐糖脂，将沉降的槐糖脂分离出来，后将上清液回补到发酵罐中，继续进行槐糖脂发酵，直至发酵结束。

进一步，在所述槐糖脂发酵的过程中，当发酵液中的槐糖脂产物的浓度达到100g/l后对发酵液进行超声波处理，以分离槐糖脂。

进一步，在所述槐糖脂发酵的过程中，通过调节转速控制发酵液溶氧(do)，在0～36h内维持溶氧(do)在40％以上，36h后维持溶氧(do)在25％以上。

进一步，在所述超声波处理中，所述发酵液中的所述油脂和所述槐糖脂的重量比(g/g)为0.10～0.20。优选地，所述油脂和所述槐糖脂的重量比(g/g)为0.10～0.16。

进一步，所述油脂为菜籽油。

进一步，在所述槐糖脂发酵的步骤中，发酵液中的葡萄糖的浓度维持在30～80g/l。

进一步，所述种子培养的步骤包括：将菌种加入到种子培养基中，在转速为200rpm、温度为25℃的条件下摇甁培养48h。

进一步，所述种子培养基包括：50g/l的葡萄糖、1g/l的kh2po4、4g/l的(nh4)2so4、0.5g/l的mgso4·7h2o和10g/l的玉米浆。所述种子培养基经过115℃高温高压蒸汽灭菌30min。

进一步，所述发酵培养基包括：100g/l的葡萄糖、1g/l的kh2po4、4g/l的(nh4)2so4、0.5g/l的mgso4·7h2o和10g/l的玉米浆。所述发酵培养基经过115℃高温高压蒸汽灭菌30min。

本发明中，所述半连续发酵方法采用c.bombicolaatcc22214菌株发酵生产槐糖脂，采用的c.bombicolaatcc22214是从广州市菌种保藏中心购买，20％的甘油管保藏在-80℃。

本发明的有益效果在于：

本发明提供一种基于超声波辅助槐糖脂沉降的半连续发酵方法，在槐糖脂发酵步骤中引入超声波以加快槐糖脂的沉降速率，降低原位分离底物和细胞的损失。超声波不但能够加快槐糖脂颗粒的聚集，使小颗粒变成较大颗粒，进而加快沉降，而且超声波能够迅速除气泡，以减少气泡上升对槐糖脂沉降过程中的干扰。本发明的半连续发酵方法能够有助于油脂比例较低环境中的槐糖脂沉降，不仅能够降低油脂对发酵液粘度等的影响，而且能够减少原位分离过程中油脂的损失，加快槐糖脂的分离。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1a为酸型槐糖脂的化学结构示意图。

图1b为内酯型槐糖脂的化学结构示意图。

图2为本发明半连续发酵方法中的槐糖脂发酵的步骤的装置示意图。

图3a为试验例1的超声波对菌株生长影响的数据图。

图3b为试验例1的超声波对槐糖脂生产影响的数据图。

图4a为试验例2中100w超声波功率时的超声波辅助槐糖脂沉降速率图。

图4b为试验例2中200w超声波功率时的超声波辅助槐糖脂沉降速率图。

图4c为试验例2中300w超声波功率时的超声波辅助槐糖脂沉降速率图。

图4d为试验例2中在不同功率(0～300w)条件下的最大沉降速率图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需要说明的是，在本文中术语“包括”是指“包括但不限于”。用语第一、第二、第三等仅仅作为标示使用，并没有强加数字要求或建立顺序。本发明的各种实施例可以以一个范围的型式存在；应当理解，以一范围型式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本发明范围的硬性限制；因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单一数值。例如，应当认为从1到6的范围描述已经具体公开子范围，例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及所数范围内的单一数字，例如1、2、3、4、5及6，此不管范围为何皆适用。另外，每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。本文中所揭露的大小和数值不应意图被理解为严格限于所述精确数值。相反的，除非另外指明，各种大小旨在表示所引用的数值以及功能上与所述数值相同的范围。例如所揭露的大小为「10微米」是指「约10微米」。

本发明实施例提供一种基于超声波辅助槐糖脂沉降的半连续发酵方法，所述方法包括：种子培养的步骤；槐糖脂发酵的步骤；其中，在所述槐糖脂发酵的步骤中，对发酵液进行超声波处理，辅助槐糖脂沉降。

本实施例中，所述半连续发酵方法采用c.bombicolaatcc22214菌株发酵生产槐糖脂，采用的c.bombicolaatcc22214是从广州市菌种保藏中心购买，20％的甘油管保藏在-80℃。

本实施例中，所述槐糖脂发酵的步骤包括：将经种子培养后的菌株接种至发酵培养基中，接种量为2.9％(od600为80)，发酵温度为25℃，通气量为0.5vvm，初始转速为200rpm，在发酵罐中进行发酵，其中，发酵过程中，以3g/h速率流加油脂到发酵液中，并维持发酵液ph为3.5。

本实施例中，请参考图2所示，在所述槐糖脂发酵的过程中，所述超声波处理的步骤包括：将发酵罐中的发酵液转移至置于超声波平台的分离装置中，并对所述发酵液进行超声波处理3～10min，超声波功率为100～300w，以沉降槐糖脂，将沉降的槐糖脂分离出来，得到粗槐糖脂，后将分离装置中的上清液回补到发酵罐中，继续进行槐糖脂发酵，直至发酵结束。

在一些实施例中，在所述槐糖脂发酵的过程中，当发酵液中的槐糖脂产物的浓度达到100g/l后对发酵液进行超声波处理，以分离槐糖脂。

在一些实施例中，在所述槐糖脂发酵的过程中，通过调节转速控制发酵液溶氧(do)，在0～36h内维持溶氧(do)在40％以上，36h后维持溶氧(do)在25％以上。

在一些实施例中，在所述超声波处理中，可以在线监测发酵罐中的槐糖脂的浓度或产量，控制发酵液中所述油脂与所述槐糖脂的重量比(oil/sls)为0.10～0.20g/g。例如，所述油脂与所述槐糖脂的重量比可以为0.10、0.12、0.14、0.16、0.18或0.20g/g。

在一些实施例中，所述油脂可以为菜籽油。

在一些实施例中，在所述发酵的过程中，发酵液中的葡萄糖的浓度维持在30～80g/l。

在一些实施例中，所述种子培养的步骤包括：将菌种加入到种子培养基中，在转速为200rpm、温度为25℃的条件下摇甁培养48h。

在一些实施例中，所述种子培养基包括：50g/l的葡萄糖、1g/l的kh2po4、4g/l的(nh4)2so4、0.5g/l的mgso4·7h2o和10g/l的玉米浆。所述种子培养基经过115℃高温高压蒸汽灭菌30min。

在一些实施例中，所述发酵培养基包括：100g/l的葡萄糖、1g/l的kh2po4、4g/l的(nh4)2so4、0.5g/l的mgso4·7h2o和10g/l的玉米浆。所述发酵培养基经过115℃高温高压蒸汽灭菌30min。

本发明中，随着发酵周期增加，槐糖脂含量会逐渐提高，在一定油脂比例下，槐糖脂会发生沉降。沉降平均速率如公式(1)所示；进一步发现槐糖脂沉降高度与槐糖脂浓度成正比，如公式(2)所示；最后推到槐糖脂沉降速率的计算公式如公式(3)所示：

(1)

(2)

(3)

其中，式中代表槐糖脂沉降的平均速度(cm/s)，h1代表10ml沉降管中发酵液高度(cm)，h2代表10ml沉降管中槐糖脂高度(cm)，t代表沉降时间(s)，c代表槐糖脂浓度(g/l)，a、b分别代表拟合系数。

实施例1：

本实施例提供一种基于超声波辅助槐糖脂沉降的半连续发酵方法，所述方法包括种子培养的步骤和槐糖脂发酵的步骤，具体如下所示。

本实施例中，种子培养：在1l的挡板摇瓶中，加入200ml培养基，在转速和温度分别为200rpm和25℃的摇床中培养48h。

本实施例中，槐糖脂发酵：在5l的发酵罐中，初始体积为2.5l，接种量为2.9％(od600为80)，进行发酵；发酵温度为25℃，通气量为0.5vvm，初始转速为200rpm；溶氧(do)通过调节转速在0-36h维持在40％以上，36h后维持在25％以上。培养过程中通过4mnaoh调节使ph维持在3.5。补料分批发酵周期为168h，菜籽油(3g/h)通过流加到发酵液中，葡萄糖浓度维持在30g/l-80g/l。

其中，在本实施例槐糖脂半连续发酵过程中，控制油脂(菜籽油)和槐糖脂比例为0.10(g/g)，实现槐糖脂的理性沉降，具体请参考如图2所示：当发酵罐中的槐糖脂产物的浓度达到100g/l后，将发酵罐中的发酵液通过蠕动泵从a口快速泵到分离装置中，同时分离装置置于超声波机中，超声波功率为100w，超声时间为10min，间歇1min后，从c口分离出槐糖脂，上清液则从b口重新回补到发酵罐中，继续发酵；重复上述槐糖脂分离的步骤，直到发酵罐中槐糖脂浓度低于60g/l停止分离。

本实施例中，在所述超声波处理中，可以在线监测发酵罐中的槐糖脂的浓度或产量，以便更好地调控油脂与槐糖脂的比例。

对比例1：

对比例1与实施例1相比，区别仅在于：对比例1中的超声波功率为200w，其他条件与实施例1完全相同。

对比例2：

对比例2与实施例1相比，区别仅在于：对比例2中的超声波功率为300w，其他条件与实施例1完全相同。

试验例1：

本试验例对本发明的半连续发酵方法中的菌株生长和槐糖脂生产的情况进行检测，以观察超声波对菌株生长和生产的影响。

方法：取实施例1、对比例1和对比例2中适量的发酵液，以不同超声不同功率(如100、200、300w)和超声时间(如0、10、20、30、40、50、60min)进行超声波处理，再将处理后的发酵液稀释适当浓度涂平板，观察菌株生长情况。同时，将超声处理过的发酵液进行离心，将菌体接种到只含有葡萄糖和油脂的培养基中，用于合成槐糖脂，对比超声菌株和未超声菌株的生产情况。结果详见图3a和图3b所示。

图3a为超声波对菌株生长影响的数据图。

图3b为超声波对槐糖脂生产影响的数据图。

由图3可知，菌株在发酵过程中经过不同的超声波功率和超声时间处理后，菌株的生长和生产并未受到影响。

试验例2：

①本试验例对半连续发酵方法中的槐糖脂沉降进行速率检测，观察沉降速率并记录试验数据。

方法：采用与实施例1相同的半连续发酵方法，本试验例中在油脂(菜籽油)与槐糖脂的质量比(g/g)为0.10～0.22的条件下使用超声波辅助槐糖脂沉降，并且检测槐糖脂沉降速率；其中超声波的功率分别为100w、200w、300w，超声处理的时间分别为0s、10s、30s、60s、120s、180s。记录试验数据，详见图4a、图4b和图4c所示。

图4a为100w超声波功率时的超声波辅助槐糖脂沉降速率图。

图4b为200w超声波功率时的超声波辅助槐糖脂沉降速率图。

图4c为300w超声波功率时的超声波辅助槐糖脂沉降速率图。

根据图4a、图4b和图4c可知，随着的超声波处理时间的增加槐糖脂的沉降速率也提高；另一方面随着超声波功率的提高，槐糖脂沉降速率也显著提高。但是不同油槐糖脂比例下槐糖脂沉降速率存在最大值，当达到最大值是不会受超声时间和功率的影响。另外，与未经超声波处理相比，本发明的方法经过超声波处理后，可以显著提高槐糖脂的沉降速率；能够使较低油槐糖脂比例下实现高效的槐糖脂分离，进而还能降低细胞、葡萄糖和油脂的损失。

②本试验例为了了解半连续发酵方法中在不同功率下超声波辅助下的最大沉降速率，在油脂(菜籽油)与槐糖脂的质量比(g/g)为0.10～0.22的情况下超声波辅助槐糖脂沉降，其中超声波的功率分别为0w、100w、200w、300w，其他条件与实施例1中的半连续发酵方法相同。记录试验数据，详见图4d所示。

图4d为不同功率(0～300w)下的最大沉降速率图。

根据图4d可知，在超声波功率为0w(即空白对照组)的对比下，超声波对于不同油脂槐糖脂比例的槐糖脂沉降速率影响不同，油脂比例从高到低，超声波使沉降速率提高了46.9％至485.41％。可知超声波可以有效辅助槐糖脂的沉降，可实现在较低油脂含量的情况下具有较高的槐糖脂沉降速率。

③对上述超声波辅助槐糖脂沉降的半连续发酵方法中的细胞、葡萄糖和油脂平均损失率和分离效率进行统计，以及，未经超声波处理的直接原位分离(空白对照试验)沉降槐糖脂的半连续发酵方法中的细胞、葡萄糖和油脂平均损失率和分离效率，详见表1所示。

表1

其中，

根据表1中的数据可知，超声波辅助沉降使细胞、葡萄糖和油脂的比损失分别降低了68.2％、16.2％和65.5％，使原位分离效率提高25.7％，在槐糖脂发酵步骤中采用超声波辅助槐糖脂沉降的效果显著，在较低的油脂比条件下可以提高槐糖脂的沉降速率，即可以提高槐糖脂分离效率，同时还可以降低发酵液中的细胞损失、葡萄糖损失和油脂的损失。因此，超声波辅助原位分离能够在复杂的槐糖脂发酵体系中，高效的槐糖脂分离以及较低的损失率。

综上所述，虽然槐糖脂沉降能够通过调节发酵液中油脂比例实现沉降，但是在原位分离过程中随着槐糖脂的分离，通常会带出一部分细胞，葡萄糖，油脂。例如当油脂槐糖脂比例控制在1：4时，虽然槐糖脂能够较快沉降，但是其损失的油脂也较多；而油脂比例低于3：20时，虽然能够减少油脂损失，但是其沉降速率也减慢。但根据图4，例如当油脂与槐糖脂的比例为0.10g/g时，沉降速率最大达到0.0165cm/s。由此可知，本发明在槐糖脂发酵过程中引入超声波，可以在油脂比例较低的条件下加快槐糖脂的沉降速率，同时降低原位分离底物和细胞的损失，有益效果显著。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。