一种慢病毒过表达病毒载体及其制备方法、用途与流程

本发明属于宫颈癌病毒检测
技术领域：
，具体涉及一种重组表达质粒、慢病毒过表达病毒载体及其制备方法、用途。
背景技术：
：据世界范围的统计，宫颈癌是导致女性死亡的第二大癌症，每年死于宫颈癌的妇女约有27万，其中绝大部分宫颈癌的产生都与人乳头瘤病毒感染(humanpapillomavirus；hpv)有关，同时长期持续性的感染高危亚型hpv病毒是引起宫颈癌的主要原因，而hpv16和hpv18是最致癌的hpv病毒亚型，分别约占全球宫颈癌病例的50％和20％，hpv高危亚型的检测对于女性宫颈癌的早期筛查和治疗非常重要。传统的女性宫颈癌的早期筛查主要是依靠细胞学检查，在宫颈细胞取样过程中容易使得病变细胞脱离，制片过程也极易使得细胞形态发生变化或者被其它炎症细胞和血细胞覆盖，同时结果判定太依靠于个人主观判定，因此很容易发生疾病漏诊。微流控芯片最初在美国被称为“芯片实验室”(lab-on-a-chip)，在欧洲被称为“微整合分析芯片”(micrototalanalyticalsystems)，随着材料科学、微纳米加工技术和微电子学所取得的突破性进展，尤其是与日益发展的利用体外诊断(ivd)技术检测与预防疾病相结合后，微流控芯片得到了迅猛发展，各种基于微流控芯片开发的体外诊断(ivd)平台，极大地节省了体外诊断的时间及人力成本、极大地提高体外诊断的效率。为此，基于微流控芯片检测hpv-16/hpv-18型病毒的阳性质控品最好是能模拟病毒在体内的真实感染情况且与待检测样品性质一致，均为细胞类型，最好可以借助细胞生长的方式大量的制备阳性质控品。王雪亮等在文献《人乳头瘤病毒16和18型核酸检测用质控品制备及其应用》中介绍了一种可模拟真实临床标本的hpv-16和hpv-18核酸检测用质控品，将宫颈癌细胞系siha和hela分别整合hpv16和hpv18型病毒的l1基因，故此将这两种细胞系分别培养、收集、并与hpv国际标准品进行定值和分装后，检测其作为阳性质控品的效果。但是此种质控品检测hpv18型病毒只能用hela细胞作为阳性质控品，检测hpv16型病毒只能用siha细胞作为阳性质控品，阳性质控品用途单一，不能达到节省成本的目的。谢珊在论文《人乳头瘤病毒高危型codehop检测及-16、-18型核酸检测质控物的研究》一文中公开了人乳头瘤病毒(hpv)高危型16、18核酸检测质控物，通过pcr方法克隆出hpv16临床检测常用的靶基因片段，利用分子克隆方法构建含hpv16靶基因的真核细胞载体pegfp-c1-hpv16质粒，转染已含hpv18的hela上皮细胞系，获得含hpv16、hpv18核酸的上皮细胞。然而此方法制备的细胞性质阳性质控品中的hpv16靶基因质粒在hela细胞长期传代过程中容易丢失，且制备一次该类型阳性质控品需要重新准备hpv16靶基因的质粒并且将之转染hela细胞，对于长期使用该类型阳性质控品显然是费时费力的，此外，还存在特异性、准确度较低以及重复性较差的问题。因此，研发一种稳定可控的，准确度和特异性较高，重复性好的且可以同时检测高危型hpv16和hpv18的阳性质控品，对于宫颈癌的诊断和治疗具有重大的意义。技术实现要素：因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种重组表达质粒、慢病毒过表达病毒载体及其制备方法、用途，所述慢病毒过表达病毒载体稳定可控，不会随着细胞传代次数增多而消失，且可以作为检测高危型hpv16和hpv18的阳性质控品，该阳性质控品具有准确度和特异性较高，重复性好的优势。为此，所述的慢病毒过表达病毒载体为重组表达质粒与包装系统共同转染宿主细胞后，得到慢病毒颗粒，用慢病毒颗粒感染宫颈癌细胞获得；所述的重组表达质粒为在plvx-ires-zsgreen1载体中多克隆位点中插入hpv16l1基因和hpv16e6/e7基因的核苷酸序列所得。所述多克隆位点为xhol位点；可选地，所述hpv16l1基因的核苷酸序列为seqidno：5第777-2372位；所述hpv16e6/e7基因的核苷酸序列为seqidno：5第1-776位；进一步地，所述的重组表达质粒为在plvx-ires-zsgreen1载体中xhol位点中插入seqidno：5所得。可选地，所述hpv16l1基因由通用引物组扩增获得；所述的通用引物组的正向引物序列如seqidno：1所示，反向引物序列如seqidno：2所示；所述hpv16e6/e7基因由特异性引物组扩增获得；所述的特异性引物组的正向引物序列如seqidno：3所示，反向引物序列如seqidno：4所示。可选地，所述的宫颈癌细胞为hela细胞；所述宿主细胞为hek293t细胞，所述包装系统为pmdlg/prre质粒、pvsv-g质粒和prsv-rev质粒。上述的慢病毒过表达病毒载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)在plvx-ires-zsgreen1载体中xhol位点中插入hpv16l1基因和hpv16e6/e7，得到重组表达质粒；(2)采用重组表达质粒、包装系统共同转染宿主细胞，培养得到含有慢病毒过表达病毒的培养液，纯化、浓缩、沉淀，得到慢病毒颗粒；(3)取慢病毒颗粒感染宫颈癌细胞中，筛选，保存，即得。上述的慢病毒过表达病毒载体或者上述的制备方法制得的慢病毒过表达病毒载体在检测hpv病毒感染中作为阳性质控品的应用。一种hpv病毒感染检测的阳性质控品，提取上述的慢病毒过表达病毒载体的dna，即得。优选的，所述hpv病毒为hpv-16或hpv-18型病毒可选地，所述阳性质控品还包括缓冲试剂，优选地，所述阳性质控品还包括缓冲试剂，优选地，所述缓冲试剂主要包含tris-hcl和edta。引物组，由3个引物对组成，seqidno：1和seqidno：2组成的引物对1；seqidno：3和seqidno：4组成的引物对2；seqidno：6和seqidno：7组成的引物对3。如下任一所述产品也属于本发明地保护范围(a)一种hpv病毒感染检测的试剂盒，包括上述的阳性质控品；(b)上述重组表达质粒；(c)重组细胞，是由上述重组表达质粒、pmdlg/prre质粒、pvsv-g质粒和prsv-rev质粒共同转染宿主细胞，得到的重组细胞(d)细胞培养液，(c)所述重组细胞的培养液；(e)慢病毒颗粒，由(d)所述的细胞培养液纯化、浓缩、沉淀，得到的慢病毒颗粒。本品制备过程中，采用磷酸钙法转染hek293t的慢病毒包装系统，然后将外源plvx-ires-hpv16-zsgreen1病毒质粒及其包含的e6/e7、l1基因导入hela细胞。本发明技术方案，具有如下优点：1.本发明提供的慢病毒过表达病毒载体，所述的慢病毒过表达病毒载体为重组表达质粒与包装系统共同转染宿主细胞后，得到慢病毒颗粒，用慢病毒颗粒感染宫颈癌细胞获得；所述的重组表达质粒为在plvx-ires-zsgreen1载体中多克隆位点中插入hpv16l1基因和hpv16e6/e7基因的核苷酸序列所得。上述慢病毒过表达病毒载体将hpv16型病毒l1、e6/e7基因克隆至hela细胞的基因组中，得到慢病毒过表达病毒载体，本发明的慢病毒过表达病毒载体以慢病毒颗粒的形式感染hela，不会随着hela细胞传代次数增多而消失，且一次制备后可以通过hela稳转株细胞的生长增殖方式大量繁殖，也可以通过hela稳转株细胞的液氮冻存法长久保存，可以作为同时检测hpv16、hpv18病毒的阳性质控品，且该阳性质控品具有准确度、特异性高，重复性好的优势。2.本发明提供的慢病毒过表达病毒载体，利用特定的引物(seqidno：1-4和seqidno：6-7)对样品进行扩增得到的hpv16l1基因和hpv16e6/e7基因制得的慢病毒过表达病毒载体，可以同时作为检测hpv16、hpv18病毒的阳性质控品，且检测结果准确、稳定、可靠、灵敏度高。3.通过分子水平检测hpv病毒，关键在于把握特异引物及特异探针的设计位置，为使本品符合绝大多数特异引物及特异探针的应用，避免出现无效阳性质控品，先将hpv基因组中l1、e6/e7基因连成基因簇，再重组至hela细胞基因组内，制备阳性质控品，满足绝大多数针对l1、e6/e7基因设计的特异引物及特异探针。4.本发明借助慢病毒能整合至宿主基因组上的特性，本发明中宫颈癌细胞的基因组上原带有hpv18病毒基因，又转入hpv16病毒基因，可模拟hpv病毒在体内真实的感染情况，且本品的性质接近临床样本，符合微流控芯片的工作原理和加样特点，意义重大。附图说明为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为实施例1中plvx-ires-hpv16-zsgreen1质粒，获得过程示意图；图2(a)为实施例1中plvx-ires-hpv16-zsgreen1质粒上hpv16-l1基因的测序结果；(b)为lvx-ires-hpv16-zsgreen1质粒上hpv16-l1基因(lvx-ires-zsgreen1-ds_seq-hpv16l1)与hpv16-l1(已知的)基因序列比对结果；图3(a)为实施例1中plvx-ires-hpv16-zsgreen1质粒上hpv16e6/e7基因的测序结果；(b)为lvx-ires-hpv16-zsgreen1质粒上hpv16-e6-e7基因(lvx-ires-zsgreen1-ds-seq-hpv16e6-e7)与hpv16-e6-e7(已知的)基因序列比对结果；图4为实验例2中，hek293t细胞慢病毒包装48h后荧光图；左图为细胞明厂图；右图为绿色荧光图；图5为hela-野生型(hela-wt)细胞形态图和hela-hpv16-l1/e6/e7细胞形态图；图6为实验例1中方法(1)测定的各细胞基因组dna的核酸电泳图；图7为实验例1中方法(2)测定的qpcr扩增曲线；图8为实验例1中方法(3)测定的qpcr扩增曲线。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明。实施例中所用的技术手段未特殊指明，均为常规方法。实施例中涉及到的试剂与耗材若无特殊说明均可从商业途径获取。plvx-ires-zsgreen1质粒载体在赵成利,梁瑜,谢文斌,等.vegf165慢病毒载体的构建及其在人骨髓间充质干细胞中的表达[j].中华显微外科杂志,2013,36(4):364-366公开过。实施例1慢病毒过表达载体的构建本实施例提供了一种慢病毒过表达载体的构建方法，包括如下步骤：1、合成hpv16e6/e7基因根据ncbi数据库中的记载的hpv16基因序列(taxonomyid:333760)信息，筛选并设计如下引物对hpv16(e6/e7)-f和hpv16(e6/e7)-r，上述引物见下表1，然后使用康为世纪公司的基因组dna提取试剂盒universalgenomicdnakit(商品货号:cw2298s)提取人乳头状病毒的临床hpv16阳性样本基因组，方法参照试剂盒说明书。以提取得到的临床hpv16阳性样本基因组为模板，进行pcr扩增hpv16e6/e7基因，反应体系见下表2，反应条件及过程如下：步骤1，于98℃保持15s；步骤2，于98℃保持10s；步骤3，于52℃保持15s；步骤4，于72℃保持30s；步骤5，循环步骤2至4，共35个循环；步骤6，于72℃保持10min。得到扩增产物1。表1合成hpv16e6/e7基因的引物序列表2pcr反应体系2、合成hpv16l1基因根据ncbi数据库中记载的hpv16基因序列(taxonomyid:333760)信息，筛选并设计如下引物对hpv16(l1)-f和hpv16(l1)-r，上述引物序列见下表3，然后使用康为世纪基因组dna提取试剂盒universalgenomicdnakit(cw2298s)提取人乳头状病毒的临床hpv16阳性样本基因组，方法参照试剂盒说明书。以提取得到的临床hpv16阳性样本基因组为模板，进行pcr扩增hpv16l1基因，反应体系见下表4，反应条件及过程如下：步骤1，于98℃保持15s；步骤2，于98℃保持10s；步骤3，于52℃保持15s；步骤4，于72℃保持30s；步骤5，循环步骤2至4，共35个循环；步骤6，于72℃保持10min。得到扩增产物2。表3合成hpv16l1基因的引物序列表4pcr反应体系以plvx-hpv16-e6-e7-l1-f(seqidno:6)和plvx-hpv16-e6-e7-l1-r(seqidno:7)为引物对，以扩增产物1和扩增产物2的混合物(摩尔比为1:1)为，pcr扩增条件为：步骤1，98℃15s；步骤2，98℃10s；步骤3，52℃15s；步骤4，72℃，30s；步骤5，循环步骤2至4，共35个循环，72℃10min，10℃30min。pcr体系为见下表5。扩增得到扩增产物3。表53、合成重组表达质粒(1)选用1％琼脂糖凝胶电泳观察扩增产物3，选用takaraminibestagarosegeldnaextractionkit回收2300bp左右的目的片段，方法参照该试剂盒说明书。同时将plvx-ires-zsgreen1质粒载体进行用xhoi酶进行单酶切，并进行胶回收，酶切反应条件：37℃放置2个小时，反应体系如下表所示。表6xhoi酶切反应体系plvx-ires-zsgreen1质粒10ngxhoi酶(20,000units/ml)1μl10×nebbuffer1μl(2)采用hieffplusonestepcloningkit试剂盒并按照说明书的方法进行分子克隆无缝连接，将seqidno:5所示的核苷酸分子连接至plvx-ires-zsgreen1过表达慢病毒载体上，获得的质粒命名为plvx-ires-hpv16-zsgreen1质粒，反应过程如图1所示，反应体系如下表7，反应条件：50℃放置20min。表7连接体系(3)将plvx-ires-hpv16-zsgreen1质粒进行大肠杆菌转化，反应条件：1)将上述装有plvx-ires-hpv16-zsgreen1质粒的反应管置于冰上冷却5min；2)取上述10μl冷却重组产物，加入到100μl感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min；42℃热激90秒，冰浴孵育2min；3)加入900μllb培养基，37℃孵育10min充分复苏；37℃，200rpm，摇菌45min；4)5000rpm离心3min，弃掉900μl上清。用液体培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有正确抗性的平板上轻轻涂匀。待菌液被吸收，将平板倒置，于37℃过夜培养。5)挑选白色菌落，转入50μg/mlkana抗性的培养液振荡，用质粒提取盒提取，得到纯化质粒。将纯化质粒送至上海生工进行测序，结果如图2和3所示，测序结果显示plvx-ires-hpv16-zsgreen1质粒上包含hpv16l1基因和hpv16e6/e7基因；plvx-ires-hpv16-zsgreen1质粒为在plvx-ires-zsgreen1载体中xhol位点中插入seqidno：5所得。4、将重组表达质粒plvx-ires-hpv16-zsgreen1、包装系统pmdlg/prre、pvsv-g和prsv-rev质粒进行大肠杆菌转化，经扩增、提取、纯化、得到纯化质粒。具体操作按北京全式金提取试剂盒hipureplasmid说明书进行。提取后各质粒浓度如下：表8质粒浓度体积plvx-ires-hpv16-zsgreen11.9μg/μl50μlpmdlg/prre1.8μg/μl50μlpvsv-g2.0μg/μl50μlprsv-rev1.6μg/μl50μl5、四质粒共同转染宿主细胞(1)配制成lenti-mix质粒混合液：将上述步骤获得的plvx-ires-hpv16-zsgreen1质粒与pmdlg/prre质粒、pvsv-g质粒和prsv-rev质粒，按摩尔比为1:1:1:1比例配制成lenti-mix质粒混合液使得该混合液od260/280为1.9。配制2xhbs转染试剂，并调节ph至6.99-7.00，并用0.22μm过滤器过滤除菌，4℃保存。配制cacl2转染试剂，浓度为0.25m，并用0.22μm过滤器过滤除菌，4℃保存。(2)hek293t细胞培养和转染：收集复苏传代代次低(传代代次在20代以内)的hek293t细胞，并在37℃，5％co2条件下进行培养，调整好细胞状态，杜绝细菌、真菌、支原体的污染。并于转染前24h，将状态良好的hek293t细胞进行传代铺板，待24h内细胞融合度在80％左右即可开始转染，转染前0.5h，更换一次完全培养基，在更换完全培养液0.5h内，将plvx-ires-hpv16-zsgreen1与lenti-mix按1:1的质量比混合成转染混合物，逐次轻柔的将转染混合物与0.25mcacl2、2xhbs试剂按照体积比为1：5：10的比例混匀若干次，于室温静置10min后，逐滴加入hek293t细胞培养盘内，加入1.2ml，轻柔混匀，完成转染后置于37℃，5％co2细胞培养箱内培养。转染后8-12h后，更准确的转染10h后，更换完全培养基一次，并置于37℃，5％co2细胞培养箱内继续培养，得到慢病毒感染hek293t细胞，简称hek293t-hpv16-l1/e6/e7细胞。6、慢病毒颗粒的制备收集步骤5转染后的hek293t细胞的培养液，浓缩，收集慢病毒颗粒，具体步骤如下：先配制5×peg8000慢病毒浓缩液，其中每200ml浓缩液中含50gpeg8000、含8.766gnacl，高温高压灭菌后，4℃保存。收集转染60h后的步骤5获得的细胞培养液，在3000rpm，4℃，10min条件下离心去细胞及碎片，取上清，再将上清用0.45um过滤器过滤。过滤后加入5×peg8000慢病毒浓缩液，使慢病毒浓缩液工作浓度为1×，充分混匀细胞培养液和慢病毒浓缩液，于4℃处理过夜。第二天，将细胞培养液和慢病毒浓缩液在10000g，4℃，30min条件下离心去上清，用预冷的dmem重悬离心后得到慢病毒颗粒，分装后于4℃暂存一周，长时间应保存于-80℃冰箱内。7、慢病毒颗粒感染宫颈癌细胞制备慢病毒过表达载体将步骤6制得的慢病毒颗粒感染状态良好的hela细胞，具体步骤如下：在37℃，5％co2条件下培养状态好的hela细胞(hpv18病毒宫颈癌细胞)，杜绝细菌、真菌、支原体污染，将hela细胞(细胞浓度约为5x105/ml,培养基体积为100ul)提前一天进行传代铺板，以第二天感染时细胞密度在40％-50％为宜，接种到96孔板。将慢病毒感染体积设置成不同梯度(将包被好的慢病毒颗粒按照10倍稀释设置为100、10、1，每个梯度3次重复，如稀释倍数为1，则hela细胞：浓缩得到的慢病毒颗粒体积为1:1，同时感染hela细胞(细胞提前换无血清培养基处理)，加入终浓度为10ug/ml的polybrene促感染剂，后置于37℃，5％co2条件下培养。感染24h后，更换无病毒完全培养基，继续培养。将被plvx-ires-hpv16-zsgreen1慢病毒感染的hela细胞(hela-hpv16-l1/e6/e7细胞)进行puro抗性筛选，并连续传代若干次，直至hela细胞稳定生长不再死亡。上述hela-hpv16-l1/e6/e7细胞即慢病毒过表达载体可以进行传代，冻存，可以稳定传代培养，也可以进行冻存处理，也可以提取该细胞基因组dna作为hpv16型和hpv18型病毒qpcr检测的阳性质控品。图5为hela-hpv16-l1/e6/e7细胞和hela-野生型细胞形态图。实施例2阳性质控品采用磁珠法提取实施例1获得的hela-hpv16-l1/e6/e7细胞的基因组dna，得到阳性质控品，具体操作详情见广州美基magpureuniversaldnalqkit提取试剂盒(货号：d6314-01)。实验例1hpv病毒的检测(1)采用磁珠法提取实施例1获得的hela-hpv16-l1/e6/e7细胞、hek293t-hpv16-l1/e6/e7细胞和hela细胞的基因组dna，具体操作按照广州美基magpureuniversaldnalqkit提取试剂盒(货号：d6314-01)说明书的方法进行，经核酸电泳及紫外分光光度计测得浓度，分装后冻存于-20℃。结果见下表9和图6所示。表9核酸浓度以及od值(2)qpcr-探针法检测各类型细胞基因组：按照步骤(1)的磁珠法提取各样本进行pcr扩增反应，并按如下表10qpcr反应体系混合，将各体系按如下程序进行qpcr反应(两步法)：预变性：94℃，30s；变性与延伸：94℃，5s、60℃，30s；变性与延伸共45循环，以hela细胞-野生型为阴性对照，相同条件下进行反应，结果见下表11所示。表10qpcr反应体系样品1μlqpcrmaster2xmix10μlhpv16e-f(5um)0.8μlhpv16e-r(5um)0.8μlhpv16e-t(5um)0.8μlddh2o6.6μl表11检测结果样本名称cq值hek293t-hpv16-l1/e6/e726.51hela细胞-野生型42.89hela-hpv16-l1/e6/e727.65(3)按照步骤(1)的方法提取hela-hpv16-l1/e6/e7、hela细胞-野生型样本、hpv16型病毒感染样本(为医院确诊为hpv16阳性患者的宫颈细胞样本)的dna进行pcr扩增反应，并按如下表混合qpcr反应体系。将各体系按如下程序进行qpcr反应(两步法)：预变性：94℃，30s；变性与延伸：94℃，5s、60℃，30s；变性与延伸共45循环。检测hpv16型病毒靶标基因l1存在情况，结果见下表14所示。表12表13pcr反应体系样品1μlqpcrmaster2xmix10μlhpv16e-f(5um)0.8μlhpv16e-r(5um)0.8μlhpv16e-t(5um)0.8μlddh2o6.6μl表14检测结果由上表和图7-8可知，本发明构建的hela-hpv16-l1/e6/e7稳定传代细胞，和hpv16型病毒感染样本一同处理，一同经过qpcr检测，可以得到一致的qpcr阳性结果，说明本次构建的细胞可以作为针对hpv16型和hpv18型病毒感染样本的阳性质控品，既可以运用于微流控芯片，也可以作为实验室检测宫颈癌感染病毒类型的阳性质控品。实验例2荧光显微镜观察取hek293t细胞慢病毒包装48h后，在荧光显微镜下观察，见图4，左图为细胞明厂图；右图为绿色荧光图；表明hek293t细胞已经被携带hpv16靶标基因的慢病毒质粒感染。显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。<110>西人马联合测控（泉州）科技有限公司<120>一种慢病毒过表达病毒载体及其制备方法、用途<130>ha201902824<160>10<170>patentinversion3.5<210>1<211>24<212>dna<213>人工序列<400>1atgcaccaaaagagaactgcaatg24<210>2<211>40<212>dna<213>人工序列<400>2aataaaagtcacctgcatttatggtttctgagaacagatg40<210>3<211>32<212>dna<213>人工序列<400>3atgcaggtgacttttatttacatcctagttat32<210>4<211>47<212>dna<213>人工序列<400>4taaagggaacaaaagctgttacagcttacgttttttgcgtttagcag47<210>5<211>2372<212>dna<213>人工序列<400>5atgcaccaaaagagaactgcaatgtttcaggacccacaggagcgacccagaaagttacca60cagttatgcacagagctgcaaacaactatacatgatataatattagaatgtgtgtactgc120aagcaacagttactgcgacgtgaggtatatgactttgcttttcgggatttatgcatagta180tatagagatgggaatccatatgctgtatgtgataaatgtttaaagttttattctaaaatt240agtgagtatagacattattgttatagtttgtatggaacaacattagaacagcaatacaac300aaaccgttgtgtgatttgttaattaggtgtattaactgtcaaaagccactgtgtcctgaa360gaaaagcaaagacatctggacaaaaagcaaagattccataatataaggggtcggtggacc420ggtcgatgtatgtcttgttgcagatcatcaagaacacgtagagaaacccagctgtaatca480tgcatggagatacacctacattgcatgaatatatgttagatttgcaaccagagacaactg540atctctactgttatgagcaattaaatgacagctcagaggaggaggatgaaatagatggtc600cagctggacaagcagaaccggacagagcccattacaatattgtaaccttttgttgcaagt660gtgactctacgcttcggttgtgcgtacaaagcacacacgtagacattcgtactttggaag720acctgttaatgggcacactaggaattgtgtgccccatctgttctcagaaaccataaatgc780aggtgacttttatttacatcctagttattacatgttacgaaaacgacgtaaacgtttacc840atattttttttcagatgtctctttggctgcctagtgaggccactgtctacttgcctcctg900tcccagtatctaaggttgtaagcacggatgaatatgttgcacgcacaaacatatattatc960atgcaggaacatccagactacttgcagttggacatccctattttcctattaaaaaaccta1020acaataacaaaatattagttcctaaagtatcaggattacaatacagggtatttagaatac1080atttacctgaccccaataagtttggttttcctgacacctcattttataatccagatacac1140agcggctggtttgggcctgtgtaggtgttgaggtaggtcgtggtcagccattaggtgtgg1200gcattagtggccatcctttattaaataaattggatgacacagaaaatgctagtgcttatg1260cagcaaatgcaggtgtggataatagagaatgtatatctatggattacaaacaaacacaat1320tgtgtttaattggttgcaaaccacctataggggaacactggggcaaaggatccccatgta1380ccaatgttgcagtaaatccaggtgattgtccaccattagagttaataaacacagttattc1440aggatggtgatatggttcatactggctttggtgctatggactttactacattacaggcta1500acaaaagtgaagttccactggatatttgtacatctatttgcaaatatccagattatatta1560aaatggtgtcagaaccatatggcgacagcttatttttttatttacgaagggaacaaatgt1620ttgttagacatttatttaatagggctggtactgttggtgaaaatgtaccagacgatttat1680acattaaaggctctgggtctactgcaaatttagccagttcaaattattttcctacaccta1740gtggttctatggttacctctgatgcccaaatattcaataaaccttattggttacaacgag1800cacagggccacaataatggcatttgttggggtaaccaactatttgttactgttgttgata1860ctacacgcagtacaaatatgtcattatgtgctgccatatctacttcagaaactacatata1920aaaatactaactttaaggagtacctacgacatggggaggaatatgatttacagtttattt1980ttcaactgtgcaaaataaccttaactgcagacgttatgacatacatacattctatgaatt2040ccactattttggaggactggaattttggtctacaacctcccccaggaggcacactagaag2100atacttataggtttgtaacccaggcaattgcttgtcaaaaacatacacctccagcaccta2160aagaagatgatccccttaaaaaatacactttttgggaagtaaatttaaaggaaaagtttt2220ctgcagacctagatcagtttcctttaggacgcaaatttttactacaagcaggattgaagg2280ccaaaccaaaatttacattaggaaaacgaaaagctacacccaccacctcatctacctcta2340caactgctaaacgcaaaaaacgtaagctgtaa2372<210>6<211>42<212>dna<213>人工序列<400>6ctatttccggtgaattccatgcaccaaaagagaactgcaatg42<210>7<211>47<212>dna<213>人工序列<400>7ctctagaactagtctcgattacagcttacgttttttgcgtttagcag47<210>8<211>22<212>dna<213>人工序列<400>8aggagcgacccagaaagttacc22<210>9<211>22<212>dna<213>人工序列<400>9acagcatatggattcccatctc22<210>10<211>17<212>dna<213>人工序列<400>10caacagttactgcgacg17当前第1页12