一种动物体内新型冠状病毒的荧光PT-PCR检测方法及试剂盒与流程

一种动物体内新型冠状病毒的荧光pt
‑
pcr检测方法及试剂盒
技术领域
1.本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种动物体内新型冠 状病毒的荧光rt
‑
pcr检测方法及试剂盒。


背景技术：

2.申请号为cn202010096344.2公开了一种新型冠状病毒 2019
‑
ncov核酸检测技术，步骤包括样品制备及rna提取、反应体 系配置和pcr扩增、质量控制和结果分析与判定。操作简便、特异 性强、准确度高且可重复性强。
[0003][0004]
申请号为cn202010306852.9公开了一种具有抗突变性能的新型 冠状病毒核酸检测引物对、试剂盒及其应用，通过优选设计使得引物 对具有优异的抗突变性能，从而可以有效避免因新冠病毒基因突变导 致的检测灵敏度降低甚至假阴性现象的产生，从而实现对新型冠状病 毒sars
‑
cov
‑
2快速的、高敏感度和高准确性的实时荧光定量pcr 检测。
[0005]
申请号为cn202010060229.x公开了一种新型冠状病毒 2019
‑
ncov双通道实时荧光定量pcr检测引物和探针、试剂盒和方 法，采用单管双荧光通道同时检测新型冠状病毒2019
‑
ncov和内参 基因rnase p的存在，能检测肺泡灌洗液、鼻咽拭子、全血、血清、 粪便和组织等标本中新型冠状病毒2019
‑
ncov rna的存在。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的在于解决现有技术中用于动物体内新型冠状病毒检 测检测灵敏度不高的技术问题，提供一种动物体内新型冠状病毒的荧 光rt
‑
pcr检测方法及试剂盒，其检测限可达1拷贝/μl。
[0007]
本发明提供一种动物体内新型冠状病毒的荧光pt
‑
pcr检测方法， 包括以下步骤：
[0008]
s1、样本采集：从动物体内采集待检测样本，在2～8℃下保存12h；
[0009]
s2、核酸提取：在待检测样本中加入内标rna control，使用核 酸提取试剂盒提取待检测样本中的rna，得到样本并将样本冷冻保 存；
[0010]
s3、pcr试剂准备：在试剂盒中按体积比4:1量取pcr反应液a 和pcr反应液b置于离心管中震荡混匀后离心2～10s，按15μl/管分 装至pcr反应管中，得到pcr试剂；
[0011]
s4、pcr扩增检测：将样本、阴性对照、阳性对照各15μl分别 加入pcr试剂，震荡混匀后离心2～10s，在荧光pcr仪上进行扩增 检测；
[0012]
s5、质量判断：根据以下条件判断实验结果是否有效，
[0013]
判断条件一：阴性对照的结果为阴性；
[0014]
判断条件二：阳性对照的结果为阳性；
[0015]
当同时满足上述两个判断条件时，实验结果判断为是，进入步骤 s6；当上述两个判断条件有任意一条不满足时，实验结果判断为是， 返回步骤s3；
[0016]
s6、结果判定：
[0017]
阳性判断条件：fam通道ct值＜38且有扩增曲线；
[0018]
阴性判断条件：fam通道ct值≥38无扩增曲线，且rox通道 ct值≤36有明显扩增曲线。fam为新型冠状病毒扩增信号，rox为 内标扩增信号。
[0019]
本发明所述的一种动物体内新型冠状病毒的荧光pt
‑
pcr检测方 法，作为优选方式，步骤s1中所述待检测样本为血液样本。
[0020]
本发明所述的一种动物体内新型冠状病毒的荧光pt
‑
pcr检测方 法，作为优选方式，包括以下步骤：
[0021]
s1、样本采集：从动物体内采集待检测样本，在2～8℃下保存12h；
[0022]
s2、样本处理：将待检测样本置于研磨管中研磨后加入pbs缓冲 液混合均匀，在5000r/min下离心5min后取上清液；
[0023]
s3、核酸提取：在上清液中加入内标rna control，使用核酸提 取试剂盒提取待检测样本中的rna，得到样本并将样本冷冻保存；
[0024]
s4、pcr试剂准备：在试剂盒中按体积比4:1量取pcr反应液a 和pcr反应液b置于离心管中震荡混匀后离心2～10s，按15μl/管分 装至pcr反应管中，得到pcr试剂；
[0025]
s5、pcr扩增检测：将样本、阴性对照、阳性对照各15μl分别 加入pcr试剂，震荡混匀后离心2～10s，在荧光pcr仪上进行扩增 检测；
[0026]
s6、质量判断：根据以下条件判断实验结果是否有效，
[0027]
判断条件一：阴性对照的结果为阴性；
[0028]
判断条件二：阳性对照的结果为阳性；
[0029]
当同时满足上述两个判断条件时，实验结果判断为是，进入步骤 s7；当上述两个判断条件有任意一条不满足时，实验结果判断为是， 返回步骤s4；
[0030]
s7、结果判定：
[0031]
阳性判断条件：fam通道ct值＜38且有扩增曲线；
[0032]
阴性判断条件：fam通道ct值≥38无扩增曲线，且rox通道 ct值≤36有明显扩增曲线。
[0033]
本发明所述的一种动物体内新型冠状病毒的荧光pt
‑
pcr检测方 法，作为优选方式，步骤s1中所述待检测样本为组织样本。组织样 本可以为肺、扁桃体、淋巴结、肌肉等组织样本。
[0034]
本发明所述的一种动物体内新型冠状病毒的荧光pt
‑
pcr检测方 法，作为优选方式，pcr反应液a由引物、探针、5
×
neoscript rtpremix buffer、25
×
rox primer probe mix、rnase
‑
free te缓冲液组 成，所述pcr反应液b由25
×
neoscript rtase mix、rnase
‑
free te 缓冲液组成，阴性对照为rnase
‑
free te缓冲液，阳性对照包括 rnase
‑
free te缓冲液、pmd19
‑
t
‑
ncov
‑
o质粒原液。
[0035]
本发明所述的一种动物体内新型冠状病毒的荧光pt
‑
pcr检测方 法，作为优选方式，引物包括：
[0036]
上游引物：5
′‑
gcactcaatttgcttttgcttgt
‑3′
[0037]
下游引物：5
′‑
ggtgaaactgatctggcacgtaa
‑3′
；
[0038]
探针为
[0039]
5'
‑
fam
‑
ctgacggcgtaaaacacgtctatcagt
‑
bhq1
‑
3'。
[0040]
本发明所述的一种动物体内新型冠状病毒的荧光pt
‑
pcr检测方 法，作为优选方式，阴性对照结果为阴性时ct值≥38或无ct值，内 标结果为阳性时ct值≤36，阳性对照为阳性时ct值＜38。
[0041]
本发明所述的一种动物体内新型冠状病毒的荧光pt
‑
pcr检测方 法，作为优选方式，扩增检测的靶区域为新型冠状病毒核壳蛋白基因 区域的高度保守区，即该基因片段与其它物种无交叉反应且基因稳定 不易发生变异。
[0042]
本发明所述的一种动物体内新型冠状病毒的荧光pt
‑
pcr检测方 法，作为优选方式，试剂盒包括盒体、设置在盒体上的盒盖和设置在 盒体内的试剂管、离心管，试剂管包括pcr反应液a试剂管、pcr 反应液b试剂管、内标试剂管、阳性对照试剂管和阴性对照试剂管。
[0043]
本发明的有益效果是：
[0044]
(1)可用于多种动物的新型冠状病毒核酸检测；
[0045]
(2)灵敏度高，检测限可达1拷贝/μl；
[0046]
(3)特异性强，与犬、猫、猪、禽等多种动物的多种病毒无交 叉反应，实现对新冠病毒的特异性检测。
附图说明
[0047]
图1为一种动物体内新型冠状病毒的荧光pt
‑
pcr检测方法流程 图；
[0048]
图2为实施例2流程图；
具体实施方式
[0049]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方 案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部 分实施例，而不是全部的实施例。
[0050]
如图1所示，一种动物体内新型冠状病毒的荧光pt
‑
pcr检测方 法，包括以下步骤：
[0051]
s1、样本采集：使用无菌注射器从动物体内采集血液样本，在2～8℃ 下保存12h；
[0052]
s2、核酸提取：在每份血液样本中加入2μl内标rna control， 使用核酸提取试剂盒提取待检测样本中的rna，得到样本并将样本 冷冻保存，并在2h内完成pcr扩增检测；
[0053]
s3、pcr试剂准备：根据pcr反应管数n，在试剂盒中取n
×ꢀ
12μlpcr反应液a和n
×
3μlpcr反应液b置于离心管中震荡混匀 后离心2～10s，以15μl/管分装至pcr反应管中，得到pcr试剂；其 中，pcr反应液a由引物、探针、5
×
neoscript rt premix buffer、25
×ꢀ
rox primer probe mix、rnase
‑
free te缓冲液组成，pcr反应液b 由25
×
neoscript rtase mix、rnase
‑
free te缓冲液组成，阴性对照为 rnase
‑
free te缓冲液，阳性对照包括rnase
‑
free te缓冲液、 pmd19
‑
t
‑
ncov
‑
o质粒原液；
[0054]
引物包括：浓度为0.4μmol/l
[0055]
上游引物：5
′‑
gcactcaatttgcttttgcttgt
‑3′
[0056]
下游引物：5
′‑
ggtgaaactgatctggcacgtaa
‑3′
；
[0057]
探针：浓度为0.2μmol/l
[0058]
5'
‑
fam
‑
ctgacggcgtaaaacacgtctatcagt
‑
bhq1
‑
3'；
[0059]
s4、pcr扩增检测：用带滤芯的吸头分别取样本、阴性对照、阳 性对照各15μl装入pcr试剂管中，震荡混匀后离心2～10s，在荧光 pcr仪上进行扩增检测；
[0060]
pcr扩增检测的循环参数设定如下：
[0061][0062][0063]
s5、质量判断：根据以下条件判断实验结果是否有效，
[0064]
判断条件一：阴性对照的结果为阴性；
[0065]
判断条件二：阳性对照的结果为阳性；
[0066]
当同时满足上述两个判断条件时，实验结果判断为是，进入步骤 s6；当上述两个判断条件有任意一条不满足时，实验结果判断为是， 返回步骤s3；
[0067]
s6、结果判定：
[0068]
阳性判断条件：fam通道ct值＜38且有扩增曲线；
[0069]
阴性判断条件：fam通道ct值≥38无扩增曲线，且rox通道 ct值≤36有明显扩增曲线。
[0070]
实施例2
[0071]
如图2所示，一种动物体内新型冠状病毒的荧光pt
‑
pcr检测方 法，包括以下步骤：
[0072]
s1、样本采集：使用清洁器材从动物体内采集肺、扁桃体、淋巴 结、肌肉等组织样本，在2～8℃下保存12h；
[0073]
s2、样本处理：将0.2g组织样本置于研磨管中研磨后加入1ml pbs缓冲液混合均匀，在5000r/min下离心5min后取上清液；
[0074]
s3、核酸提取：在每份血液样本中加入2μl内标rna control， 使用核酸提取试剂盒提取待检测样本中的rna，得到样本并将样本 冷冻保存，并在2h内完成pcr扩增检测；
[0075]
s4、pcr试剂准备：根据pcr反应管数n，在试剂盒中取n
×ꢀ
12μlpcr反应液a和n
×
3μlpcr反应液b置于离心管中震荡混匀 后离心2～10s，以15μl/管分装至pcr反应管中，得到pcr试剂；
[0076]
其中，pcr反应液a由引物、探针、5
×
neoscript rt premix buffer、 25
×
rox primer probe mix、rnase
‑
free te缓冲液组成，pcr反应 液b由25
×
neoscript rtase mix、rnase
‑
free te缓冲液组成，阴性 对照为rnase
‑
free te缓冲液，阳性对照包括rnase
‑
free te缓冲液、 pmd19
‑
t
‑
ncov
‑
o质粒原液；
[0077]
引物包括：
[0078]
上游引物：5
′‑
gcactcaatttgcttttgcttgt
‑3′
[0079]
下游引物：5
′‑
ggtgaaactgatctggcacgtaa
‑3′
；
[0080]
探针为
[0081]
5'
‑
fam
‑
ctgacggcgtaaaacacgtctatcagt
‑
bhq1
‑
3'；
[0082]
s5、pcr扩增检测：用带滤芯的吸头分别取样本、阴性对照、阳 性对照各15μl装入
pcr试剂管中，震荡混匀后离心2～10s，在荧光 pcr仪上进行扩增检测；
[0083]
pcr扩增检测的循环参数设定如下：
[0084][0085]
s6、质量判断：根据以下条件判断实验结果是否有效，
[0086]
判断条件一：阴性对照的结果为阴性；
[0087]
判断条件二：阳性对照的结果为阳性；
[0088]
当同时满足上述两个判断条件时，实验结果判断为是，进入步骤 s7；当上述两个判断条件有任意一条不满足时，实验结果判断为是， 返回步骤s4；
[0089]
s7、结果判定：
[0090]
阳性判断条件：fam通道ct值＜38且有扩增曲线；
[0091]
阴性判断条件：fam通道ct值≥38无扩增曲线，且rox通道 ct值≤36有明显扩增曲线。
[0092]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范 围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技 术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变， 都应涵盖在本发明的保护范围之内。