[0001]
本发明涉及发酵技术领域，具体涉及一种微生物发酵产多拉菌素的方法。
背景技术：
[0002]
多拉菌素是一种大环内酯类抗寄生虫药物，是一种以环已氨羧酸为前体，通过基因重组的阿维链霉菌新菌株发酵而成的一种阿维菌素类抗生素。多拉菌素为阿维链霉菌的次级代谢产物，通常，碳源、氮源以及温度等均会对其发酵生产造成影响，而在其发酵过程中，前体物质环己羧酸或其盐的加入十分关键，尽管前体物质的含量并不会影响阿维链霉菌的活性，但当环己酸含量较低时也将成为多拉菌素生产短板所在，而当其含量较高时则将会对阿维链霉菌的代谢产生抑制作用。
[0003]
中国专利cn109576196a公开了一种生产多拉菌素的发酵培养基及多拉菌素的生产方法，其中，发酵培养基组成包括：淀粉100-140g/l、淀粉酶0.1-0.2g/l、黄豆饼粉12-18g/l、棉籽饼粉12-18g/l、酵母粉0.5-1.5g/l、2,2-甲基丁酸0.01-0.2g/l、环己甲酸或者环己甲酸钠0.2-0.4g/l。该发明通过对发酵培养基及多拉菌素生产方法的改进，显著提高多拉菌素的发酵水平，在发酵370h，效价达到3545μg/ml，且整个生产工艺简单易操作，有利于工业化生产。但上述方法主要针对发酵培养基进行研究，其中环己甲酸等成分均为直接加入，除糖外未对其进行补加，进而将极可能影响发酵效率，影响多拉菌素的产量。
[0004]
针对以上问题，近年来，部分研究者开始研究不同时期补加前体、碳源以及氮源等方式，从而促进多拉菌素的生产。例如，中国专利cn104651427b公开了一种制备多拉菌素的方法，该方法通过控制环己羧酸或其盐、补料糖的补加时间、次数等对多拉菌素的生产进行控制，得到的方法适用于500l发酵罐通过发酵方式生产多拉菌素。但该发明中仍主要以常规性用料结合补加情况进行优化设定，尽管能够在一定程度上促进多拉菌素的生产，但其最终的产量可以预期，仍难以克服环已羧酸或其盐在发酵过程中的短板，因此所得到的多拉菌素平均发酵单位较低。
[0005]
针对现有的多拉菌素生产方法存在的发酵水平以及效率较低等问题，亟需寻找一种效率高的多拉菌素的生产方法，进而促进阿维链霉菌次级代谢产多拉菌素。
技术实现要素：
[0006]
本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种微生物发酵产多拉菌素的方法。该方法能够有效促进阿维链霉菌次级代谢产素，得到的多拉菌素效价较高。
[0007]
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
[0008]
本发明提供了一种微生物发酵产多拉菌素的方法，包括以下步骤：
[0009]
(1)将经过斜面培养基和种子培养基培养的种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养；
[0010]
(2)在发酵前期、中期和后期添加发酵诱导补加剂，发酵结束后得到多拉菌素；
[0011]
所述发酵培养基包括：淀粉、淀粉酶、棉籽饼粉、黄豆饼粉、酵母粉、氯化钠、轻质碳
酸钙、泛酸、大豆卵磷脂、环己甲酸钠和水。
[0012]
进一步地，所述发酵培养基包括：淀粉110-120g/l、淀粉酶0.08-0.15g/l、棉籽饼粉14-16g/l、黄豆饼粉8-15g/l、酵母粉0.5-1.5g/l、氯化钠1-3g/l、轻质碳酸钙8-10g/l、泛酸0.001-0.002g/l、大豆卵磷脂2-5g/l、环己甲酸钠0.1-0.2/l和余量水。
[0013]
优选地，所述发酵培养基包括：淀粉115g/l、淀粉酶0.1g/l、棉籽饼粉15g/l、黄豆饼粉12g/l、酵母粉1g/l、氯化钠2g/l、轻质碳酸钙8g/l、泛酸0.001g/l、大豆卵磷脂3g/l、环己甲酸钠0.1/l和余量水。
[0014]
进一步地，所述发酵诱导补加剂包括：环己甲酸钠和大豆异黄酮。
[0015]
进一步地，在发酵不同时期补加的所述发酵诱导补加剂分别为(补加的单位具体为补加总量占培养基总量的关系)：
[0016]
发酵前期：环己甲酸钠0.3-0.5g/l和大豆异黄酮0.5-0.8g/l；
[0017]
发酵中期：环己甲酸钠0.5-0.8g/l和大豆异黄酮0.4-0.5g/l；
[0018]
发酵后期：环己甲酸钠0.2-0.3g/l和大豆异黄酮0.2-0.4g/l。
[0019]
优选地，在发酵不同时期补加的所述发酵诱导补加剂分别为：
[0020]
发酵前期：环己甲酸钠0.4g/l和大豆异黄酮0.6g/l；
[0021]
发酵中期：环己甲酸钠0.6g/l和大豆异黄酮0.5g/l；
[0022]
发酵后期：环己甲酸钠0.2g/l和大豆异黄酮0.3g/l。
[0023]
进一步地，所述发酵中期和发酵后期加入的发酵诱导补加剂还包括麦芽糖糊精，发酵中期的麦芽糖糊精的补加量为10-12g/l，优选为10g/l；发酵后期的麦芽糖糊精的补加量为12-18g/l，优选为15g/l。
[0024]
进一步地，所述发酵前期为发酵培养25-35h时，所述发酵中期为发酵培养90-120h时，所述发酵后期为发酵培养185-200h时。优选地，所述发酵前期为发酵培养30h时，所述发酵中期为发酵培养100h时，所述发酵后期为发酵培养190h时。
[0025]
进一步地，所述发酵培养基的培养条件为：罐温25-30℃、罐压0.03-0.05mpa、空气流量50-100m3/h、转速80-120rpm、培养周期256-262h。优选地，所述发酵培养基的培养条件为：罐温28℃、罐压0.04mpa、空气流量80m3/h、转速100rpm、培养周期260h。
[0026]
进一步地，步骤(1)中所述泛酸和大豆卵磷脂的重量比为0.001-0.002:3。
[0027]
进一步地，步骤(1)中所述斜面培养基按重量百分比计包括露醇1-3％、黄豆饼粉1-3％、琼脂1-3％和余量水。
[0028]
进一步地，步骤(1)中所述种子培养基按重量百分比计包括：玉米淀粉1-2％、葡萄糖0.3-0.4％、黄豆饼粉1-2％、棉籽饼粉1-2％和余量水。
[0029]
进一步地，步骤(1)中所述斜面培养基的培养条件具体为：调节ph为7，温度为28℃-30℃，培养6-8天。
[0030]
进一步地，步骤(1)中所述种子培养基的培养条件具体为：调节ph至7，温度为28-30℃，培养40-45h，转速为250r/min。
[0031]
进一步地，所述发酵培养基的接种量为10％。
[0032]
本发明所取得的技术效果是：
[0033]
由于环己甲酸盐对于细胞而言有着一定的毒性，因此，其加入量较多时将抑制阿维链霉菌的代谢，但其含量较低时，则会导致多拉菌素含量的下降，本发明针对此点在发酵
不同时期进行环己甲酸盐的补加，避免环己甲酸盐的过量或少量添加对于多杀菌素生产的不利影响，同时，研究发现，大豆异黄酮以及麦芽糖糊精在不同发酵时期与环己甲酸钠共同补加时，将有效地驱动诱导发酵培养基与多拉菌素前体的作用关系并在一定程度上又促成了糖源的补加，同时发酵培养基中的相关组分如泛酸以及大豆卵磷脂也将与之产生一定的关联影响，进而促进次级代谢产素。
具体实施方式
[0034]
值得说明的是，本发明中使用的阿维链霉菌为本领域常规使用的阿维链霉菌突变株，具体为阿维链霉菌突变株atcc 53568，其余原料均为普通市售产品，因此对其来源不做具体限定。
[0035]
实施例1
[0036]
一种微生物发酵产多拉菌素的方法，包括以下步骤：
[0037]
(1)将经过斜面培养基和种子培养基培养的种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养，其中发酵培养基的接种量为10％；
[0038]
(2)在发酵前期、中期和后期添加发酵诱导补加剂，发酵结束后得到多拉菌素；
[0039]
其中，发酵培养基包括：淀粉110g/l、淀粉酶0.08g/l、棉籽饼粉14g/l、黄豆饼粉8g/l、酵母粉0.5g/l、氯化钠1g/l、轻质碳酸钙8g/l、泛酸0.001g/l、大豆卵磷脂2g/l、环己甲酸钠0.1/l和余量水。发酵培养基的培养条件为：罐温25℃、罐压0.03mpa、空气流量50m3/h、转速80rpm、培养周期262h。
[0040]
在发酵不同时期补加的发酵诱导补加剂分别为(补加的单位具体为补加总量占培养基总量的关系)：
[0041]
发酵前期(发酵培养25h时)：环己甲酸钠0.3g/l和大豆异黄酮0.5g/l；
[0042]
发酵中期(发酵培养90h时)：环己甲酸钠0.5g/l、大豆异黄酮0.4g/l和麦芽糖糊精10g/l；
[0043]
发酵后期(发酵培养185h时)：环己甲酸钠0.2g/l、大豆异黄酮0.2g/l和麦芽糖糊精12g/l。
[0044]
步骤(1)中斜面培养基按重量百分比计包括露醇1％、黄豆饼粉1％、琼脂1％和余量水。培养条件具体为：调节ph为7，温度为28℃，培养8天。种子培养基按重量百分比计包括：玉米淀粉1％、葡萄糖0.3％、黄豆饼粉1％、棉籽饼粉1％和余量水。培养条件具体为：调节ph至7，温度为28℃，培养45h，转速为250r/min。
[0045]
实施例2
[0046]
一种微生物发酵产多拉菌素的方法，包括以下步骤：
[0047]
(1)将经过斜面培养基和种子培养基培养的种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养，其中发酵培养基的接种量为10％；
[0048]
(2)在发酵前期、中期和后期添加发酵诱导补加剂，发酵结束后得到多拉菌素；
[0049]
其中，发酵培养基包括：淀粉120g/l、淀粉酶0.15g/l、棉籽饼粉16g/l、黄豆饼粉15g/l、酵母粉1.5g/l、氯化钠3g/l、轻质碳酸钙10g/l、泛酸0.002g/l、大豆卵磷脂5g/l、环己甲酸钠0.2/l和余量水。发酵培养基的培养条件为：罐温30℃、罐压0.05mpa、空气流量100m3/h、转速120rpm、培养周期256h。
[0050]
在发酵不同时期补加的发酵诱导补加剂分别为(补加的单位具体为补加总量占培养基总量的关系)：
[0051]
发酵前期(发酵培养35h时)：环己甲酸钠0.5g/l和大豆异黄酮0.8g/l；
[0052]
发酵中期(发酵培养120h时)：环己甲酸钠0.8g/l、大豆异黄酮0.5g/l和麦芽糖糊精12g/l；
[0053]
发酵后期(发酵培养200h时)：环己甲酸钠0.3g/l、大豆异黄酮0.4g/l和麦芽糖糊精18g/l。
[0054]
步骤(1)中斜面培养基按重量百分比计包括露醇3％、黄豆饼粉3％、琼脂3％和余量水。培养条件具体为：调节ph为7，温度为30℃，培养6天。种子培养基按重量百分比计包括：玉米淀粉2％、葡萄糖0.4％、黄豆饼粉2％、棉籽饼粉2％和余量水。培养条件具体为：调节ph至7，温度为30℃，培养40h，转速为250r/min。
[0055]
实施例3
[0056]
一种微生物发酵产多拉菌素的方法，包括以下步骤：
[0057]
(1)将经过斜面培养基和种子培养基培养的种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养，其中发酵培养基的接种量为10％；
[0058]
(2)在发酵前期、中期和后期添加发酵诱导补加剂，发酵结束后得到多拉菌素；
[0059]
其中，发酵培养基包括：淀粉115g/l、淀粉酶0.1g/l、棉籽饼粉15g/l、黄豆饼粉12g/l、酵母粉1g/l、氯化钠2g/l、轻质碳酸钙8g/l、泛酸0.001g/l、大豆卵磷脂3g/l、环己甲酸钠0.1/l和余量水。发酵培养基的培养条件为：罐温28℃、罐压0.04mpa、空气流量80m3/h、转速100rpm、培养周期260h。
[0060]
在发酵不同时期补加的发酵诱导补加剂分别为(补加的单位具体为补加总量占培养基总量的关系)：
[0061]
发酵前期(发酵培养30h时)：环己甲酸钠0.4g/l和大豆异黄酮0.6g/l；
[0062]
发酵中期(发酵培养100h时)：环己甲酸钠0.6g/l、大豆异黄酮0.5g/l和麦芽糖糊精10g/l；
[0063]
发酵后期(发酵培养190h时)：环己甲酸钠0.2g/l、大豆异黄酮0.3g/l和麦芽糖糊精15g/l。
[0064]
步骤(1)中斜面培养基按重量百分比计包括露醇2％、黄豆饼粉2％、琼脂2％和余量水。培养条件具体为：调节ph为7，温度为28℃，培养7天。种子培养基按重量百分比计包括：玉米淀粉1.5％、葡萄糖0.3％、黄豆饼粉1.5％、棉籽饼粉1.5％和余量水。培养条件具体为：调节ph至7，温度为28℃，培养42h，转速为250r/min。
[0065]
对比例1
[0066]
与实施例3的区别仅在于，发酵培养基包括：淀粉100g/l、淀粉酶0.2g/l、棉籽饼粉12g/l、黄豆饼粉18g/l、酵母粉0.3g/l、氯化钠5g/l、轻质碳酸钙6g/l、泛酸0.003g/l、大豆卵磷脂1g/l、环己甲酸钠0.6/l和余量水。
[0067]
对比例2
[0068]
与实施例3的区别仅在于，不加入发酵诱导补加剂。
[0069]
对比例3
[0070]
与实施例3的区别仅在于，发酵诱导补加剂中不含有大豆异黄酮。
[0071]
对比例4
[0072]
与实施例3的区别仅在于，发酵培养基中不加入泛酸和大豆卵磷脂。
[0073]
对比例5
[0074]
与实施例3的区别仅在于，仅在发酵前期进行补加发酵诱导补加剂，包括：环己甲酸钠1.2g/l、大豆异黄酮1.4g/l和麦芽糖糊精25g/l。
[0075]
抗生素在发酵液中的浓度，称为发酵单位，又称效价，其能够衡量抗生素的有效成分及性能，通常在相同的发酵周期下，发酵总亿单位(发酵单位与发酵液体积的乘积)越高，在单位产量上投人的固定成本就越小，经济效益也就越高，本发明在发酵培养结束后，将发酵液用滤纸过滤后测定并计算各实施例和对比例中多拉菌素的发酵效价，得到表1。
[0076]
表1
[0077]
实例效价(mg/l)实施例12107实施例22215实施例32239对比例11903对比例21430对比例31894对比例41975对比例51658
[0078]
由表1可知，本发明中各实施例中多拉菌素在256-262h的效价为2107-2239mg/l，其中，实施例3最优为2239mg/l。对比例1-5中多拉菌素的效价均明显低于实施例3，其中，对比例1与实施例3比较可知发酵培养基组成成分含量对于多拉菌素生产的影响作用，对比例2未加入发酵诱导补加剂，最终得到的多拉菌素的效果有着十分显著的降低，对比例5中尽管补加了发酵诱导补加剂，但由于仅在发酵前期进行了补加，尽管补加量与整体周期补加量相同，但效价仍相对较差，可见补加在本发明中的关键性作用；当发酵诱导补加剂中不含有大豆异黄酮时，如对比例3所示，效价也相对较低，可见大豆异黄酮在本发明技术方案中对于环己甲酸盐与发酵培养基之间的有效诱导驱动性。而对比例4则能够体现出本申请发酵培养基中的关键性组分例如泛酸与大豆卵磷脂的对于效价的作用影响。
[0079]
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。