一种羊妊娠相关糖蛋白核酸适配体及其应用的制作方法

[0001]
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种羊妊娠相关糖蛋白核酸适配体及其衍生物，尤其涉及该核酸适配体及衍生物在妊娠相关糖蛋白（pag）检测和家畜早期妊娠诊断中的应用。


背景技术：

[0002]
在羊养殖中，母羊繁殖力是决定羊养殖业生产效益的关键。若能在配种后对母羊准确的早期妊娠诊断，尽早区分已孕和未孕母羊，对未孕母羊及时采取复配措施，不仅有利于减少空胎率和空胎时间，提高母羊的繁殖效率；也有助于进行分群饲养管理，降低饲养成本。因此，早期妊娠技术是母畜高效生产的重要技术环节之一。目前，b型超声诊断法是羊妊娠诊断最常用的方法，但该法存在设备昂贵、效率低、耗时费力等缺陷，且无法实现早期妊娠诊断需要。因此，开发无创、快速、简便的早孕妊娠诊断技术已成为必然趋势。
[0003]
妊娠相关糖蛋白（pregnancy-associated glycoproteins, pag）是偶蹄动物胎盘滋养层细胞合成和分泌的一类糖蛋白，对维持妊娠发挥着重要作用，常作为一种标志物用于家畜早期妊娠诊断（zoli 等 1992；friedrich 等，2010；reese 等，2018）。近年来，基于免疫分析技术检测血液或奶样中pag已成为家畜早期妊娠的一种主流方法（dufour 等2017；kaya 等2016；commun 等2016），可对授精后3-4周的家畜进行早期妊娠诊断（rovani等2016；chaves等2017；ricci 等2015；张春刚等2015；karen 等2015）。目前，商品化的pag-elisa检测试剂盒已应用于生产，但该类试剂盒价格颇高，限制了在国内大规模推广使用。因此，筛选识别pag的新型识别分子，并研发相应的快速、简便、经济的检测方法，对家畜早孕诊断具有重大意义。
[0004]
近些年，核酸适配体（aptamer）作为新型识别分子逐渐成为研究热点。与传统的抗体相比，适配体具有适应范围广，高亲和力和高特异性；不受免疫条件和免疫原性限制；制备简单，可体外人工合成；变性与复性可逆，稳定性高；易于改造、标记和保存等优点。因此，核酸适配体作为一种理想的分子探针在分析检测领域得到广泛应用。目前，还未见到识别羊pag的核酸适配体的研究报道。
[0005]


技术实现要素：

[0006]
要解决的技术问题：针对现有家畜早孕检测技术的不足，本发明提供了一种羊妊娠相关糖蛋白核酸适配体及其应用。
[0007]
技术方案：一种羊妊娠相关糖蛋白核酸适配体，所述核酸适配体序列如seq idno .1所示：5
’
x
--
atcatcattcagcgtagggtttggcactgggcctgg-y-3
’
，其中，atcatcattcagcgtagggtttggcactgggcctgg为核心序列；所述序列中x为：ctacggtgccttgaagtgac，所述序列中y为：catagcaggtcacttccagg。
[0008]
优选的，所述核酸适配体序列可进行基团修饰，所述修饰的基团物质可以是生物
素、链霉亲和素、氨基、羧基、巯基、荧光分子、放射性物质、地高辛、酶、纳米材料。
[0009]
一种羊妊娠相关糖蛋白核酸适配体，所述核酸适配体序列还包括以下三种序列中的任意一种：（1）与seq idno .1的dna序列具有60%以上同源性，且能够特异性结合羊pag的dna序列，优选地，同源性可以为70％以上，80％以上，90％以上，或者99％以上；（2）seq idno .1所示核苷酸序列在两端完全或部分截去x、y的序列；（3）截取seq idno .1所示核心序列中的一段，且能够特异性结合羊妊娠相关糖蛋白的dna序列。
[0010]
一种羊妊娠相关糖蛋白核酸适配体衍生物，所述核酸适配体衍生物包括：（1）将seq id no. 1所示核酸适配体序列任意一条缺失、增加或替换一个或多个碱基，得到与该核酸适配体相同功能的核酸适配体衍生物；上述核酸适配体或核酸适配体衍生物在检测和制备pag的应用。
[0011]
上述核酸适配体或核酸适配体衍生物在家畜早期妊娠诊断产品中的应用。
[0012]
有益效果：本发明具有以下有益效果：（1）本发明提供的核酸适配体，对ovpag7具有高亲和力，解离常数达到13.6 nm，对牛pag蛋白也有一定的结合能力；（2）本发明获得的核酸适配体具有良好的亲和力和特异性，可人工合成，生产成本低、易于化学修饰；（3）可将本发明提供的适配体制备成分子探针、检测试剂等，用于pag蛋白的制备与检测，以及家畜早孕诊断，与传统的抗体相比，大大降低生产成本和检测成本。
[0013]
附图说明：图1 为每轮筛选获得的ssdna文库与ovpag7蛋白结合能力分析图；图2为每轮筛选获得的ssdna文库的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；图3为seqidno .1所示的适配体截去部分x、y序列后与ovpag7蛋白的解离常数测定图；图4为seqidno .1所示的适配体截去部分x、y序列后的二级结构图；图5为seqidno .1所示的适配体截去部分x、y序列后的特异性实验结果。
[0014]
图6 为seqidno .1所示核酸适配体应用于绵羊早孕检测的结果图。-为阴性对照，+为阳性对照，1-2为怀孕母羊血清，3-6为未孕母羊血清。
[0015]
图7为实施例4中妊娠母羊的b超验证结果图。
[0016]
具体实施方式
[0017]
以下结合具体实施例对发明进一步阐述，以便本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定而不用来限制本发明的范围。
[0018]
材料与方法下述实施例中羊妊娠相关糖蛋白7（ovpag7）、牛妊娠相关糖蛋白6（bpag6）由本实验室自制，其余所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂，可通过商业途径购买得到；
以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0019]
实施例1：羊pag核酸适配体的筛选1. 合成随机单链dna(ssdna)文库和引物：随机单链dna(ssdna)文库： 5
’-ꢀ
ctacggtgccttgaagtgac-n36-catagcaggtcacttccagg-3
’
，其中，n36 代表36个随机核苷酸，该文库由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；上游引物： 5
’-
fam
-ꢀ
ctacggtgccttgaagtgac-3
’
，下游引物： 5
’-ꢀ
20a-spacer18-cctggaagtgacctgctatg-3
’
，其中，下游引物中，20a表示由20个腺苷酸（a）组成的polya尾，spacer 18表示18原子的六乙二醇间臂，上述引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
[0020]
将随机单链dna文库、5
’
端引物和3
’
端引物分别用结合缓冲溶液（bb：nacl 136.89 mm，kcl 2.68 mm，na2hpo
4 8.09 mm，kh2ph
4 1.47 mm，cacl
2 0.9 mm，mgcl
·
6h2o 0.49 mm；ph 7 .4）溶解，于-20℃保存备用。
[0021]
2. 磁珠-ovpag7蛋白（mb-ovpag7）偶联取羧基化的磁珠50 μl，bb缓冲液洗涤，取0.1 m nhs+0.4 m edc混合溶液（v/v，1:1）50 μl加入到磁珠中，震荡反应20 min；活化完毕，磁分离，bb缓冲液洗涤，加入naac（10 mm, ph 5.0）和ovpag7蛋白（1 mg/ml），震荡反应60 min；偶联结束，磁分离，bb缓冲液洗涤后，加入100 μl的乙醇胺（1.0 m, ph8.5)，震荡反应20 min；磁分离，bb缓冲液洗涤，磁珠重悬于bb缓冲液，4℃保存备用。磁珠-牛血清白蛋白（mb-bsa）的偶联同以上方法。mb
-ꢀ
ovpag7作为正筛靶标，mb-bsa作为反筛靶标。
[0022]
3. 筛选3.1 孵育与分离：用bb缓冲液溶解1od随机单链dna文库，使其浓度为5 μm，pcr仪中95℃变性10 min，冰水浴5 min，瞬离，室温备用。取变性好的200 μl文库加入到mb-bsa磁珠中，震荡孵育60 min。磁分离，上清加入到mb-ovpag7，震荡孵育60 min，磁分离，弃上清，加入bb缓冲液，沸水煮10 min，磁分离，收集上清；3.2 pcr扩增：将步骤3.1中获得的文库加入到2 ml pcr mix，混匀，分装成每管100 μl，进行pcr扩增。pcr扩增程序：95℃ 1 min，95℃ 1 min 、60℃ 1 min、72℃ 1 min、25个循环，72℃ 5 min，25℃ 1 min；3.3 pcr产物浓缩：收集pcr扩增产物，加约5倍体积的正丁醇，涡旋混匀，7500 rpm离心5~10 min，弃上相正丁醇，下层为扩增的dsdna产物；3.4单链dna制备（长短链法）：取5 ml聚丙烯酰胺凝胶（page）混合液、40 μl 10%aps、10 μl temed，混匀，快速加入制胶板中，插入梳子，室温放置约20 min，使其凝固，将其放入电泳槽，加入1
×
tbe电泳液。将浓缩的pcr产物加入等体积的2
×
tbe/尿素变性缓冲液，pcr仪中 95℃变性10 min，然后将其加入到page胶的上样孔中，300 v电压下电泳至溴酚蓝到达胶底部，使带有polya的单链dna与fam标记的单链dna分开。取下page胶，于紫外灯下用干净的刀片切下带荧光的条带，装入0.5 ml碎胶离心管，放入2 ml离心管中，14000 rpm离心1 min，弃碎胶离心管，加入bb缓冲液，沸水煮10 min，上清转移至15 ml离心管中，依照步骤3.3浓缩单链dna。然后装入至3kd的透析袋，在bb缓冲液中4℃透析过夜，nanodrop-2000c超微量分光光度计测定核酸浓度。
[0023]
4. 多轮筛选将上述步骤3.4中得到的ssdna作为文库进行下一轮筛选，重复筛选8轮。为提高适配体的特异性和稳定性，从第5轮开始在筛选文库中加入10%的胎牛血清。筛选过程中用 thermo scientific
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varioskan
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flash多功能酶标仪检测每轮ssdna富集文库对靶标蛋白ovpag7的结合能力。
[0024]
5. 每轮ssdna文库与靶蛋白的结合力测定将每一轮获得的fam标记的ssdna文库用bb缓冲液稀释至浓度为0.5 μm，90 ℃变性10 min，冰水浴5 min，然后分别与mb-ovpag7孵育60 min，磁分离，用bb缓冲液清洗2次，200 μl bb重新悬浮磁珠，使用多功能酶标仪（λex=492nm，λem=518nm）检测每轮ssdna文库与靶标的结合情况。结果如图1所示，当荧光值不再增加时，表示适配体已得到富集，停止筛选。然后，将每轮ssdna文库经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，bio-rad凝胶成像仪检测，结果如图2所示，在76 bp处有单一的每轮ssdna电泳条带。
[0025]
6. 克隆与测序将第8 轮筛选得到的ssdna富集库用无修饰的引物扩增，pcr 产物经纯化后用pgem-t 载体（takara biotech. co., ltd）克隆，并转化到e.coli dh5α中。随机挑选40个阳性克隆送往生工生物工程（上海）股份有限公司合成测序，对测序成功的核酸适配体序列采用glustalx 软件对其进行同源性分析，将其分为3个家族。基于最低自由能原则，从每个家族中选出2条序列为代表，在两端固定引物序列分别截去10个碱基，送往上海生工合成，并在5
’
端标记fam基团，采用步骤5测定与ovpag7的结合能力，挑选出亲和力高的适配体序列进一步测定其解离常数和特异性。
[0026]
实施例2：核酸适配体解离常数（k
d
）测定选择实施例1中结合能力最高的核酸适配体，用bb缓冲液配制成一系列梯度浓度（0、100、200、400, 800、1600、3200、6400 nm）的适配体溶液；按实施例2中步骤5分析核酸适配体与mb-ovpag7的结合情况，利用graphpad prism 7.0 软件拟合结合曲线，计算核酸适配体的解离常数（k
d
值）。图3为seq idno .1所示适配体截去部分x、y序列后与靶标蛋白ovpag7的饱和结合曲线，其解离常数达到13.6 nm。采用在线mfold 对该适配体序列进行二级结构预测分析，结果如图4所示，该适配体具有典型的茎环结构。
[0027]
实施例3：核酸适配体的特异性分析将seq idno .1所示核酸适配体在两端分别截去10个碱基，送往上海生工合成，并在5
’
端标记biotin基团。将ovpag7、bpag6、bsa、ova等蛋白用10 mm pbs稀释至3 μg/ml，然后包被于96-孔板，4℃包被过夜。然后用200 μl pbst（10 mm pbs, 0.05% tween-20，ph 7.0）洗涤酶标板3次，加入200 μl封闭液（1% bsa）封闭2 h，pbst洗涤3次。加入100 μl 的biotin修饰的适配体（100 nm），温育20 min，pbst洗涤3次，拍干。每孔加入100 μl 的sa-hrp（0.5 u/ml），pbst洗涤3-5次，拍干后加入100 μl tmb底物显色液，反应5-7 min。最后加入100 μl 终止液终止反应，采用酶标仪在450 nm（od
450nm
）处测其吸光值。检测结果见图5，本发明提供的适配体可与pag蛋白特异性结合，而与bsa、ova则无交叉反应。
[0028]
实施例4：间接竞争酶联适配体检测母羊血清中pag将本发明提供的适配体用于母羊早期妊娠诊断。选择配种后21天的母羊，静脉采集血液，室温下放置约1-2 h，血清自动析出，收集血清。将血清样品用bb缓冲液稀释2倍，采用间
接竞争酶联适配体方法检测血清样品，同时以ovpag7溶液为阳性对照，以未怀孕羊血清作为阴性对照。检测步骤如下：将ovpag7蛋白（1 μg/ml）溶液加入96-孔板，4℃包被过夜。用200 μl pbst洗涤酶标板3次，加入200 μl封闭液（1% bsa）封闭2 h，pbst洗涤3次。将待测50 μl血清样品与100 μl biotin-适配体（100 nm）混合，孵育20 min后加入至包被有ovpag7的96-孔板中，室温反应20 min，pbst洗涤3-5次。加入100 μl 的sa-hrp（0.5 u/ml），pbst洗涤3-5次，拍板。加入100 μl tmb底物显色液，反应5-7 min。根据孔内颜色判断奶牛妊娠情况，阳性对照反应孔应为无色，阴性对照反应孔应为蓝色；如样品反应孔呈无色或显色较弱，判定奶牛为怀孕，如样品反应孔呈蓝色或接近阴性对照反应孔颜色，则判定为未孕。将检测结果与b超检测结果进行对比验证，计算诊断准确率。图6母羊血清样品的比色检测结果图，有2个样品的反应液基本接近无色，为阳性；4个样品的反应液呈蓝色，为阴性。将判定为怀孕和未孕的羊在配种后45 d采用b超法进行验证，其判定结果与b超检测结果一致。
[0029]
以上实施例仅为本发明的具体实施方式，但并不能理解为对本发明专利范围的限制。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。