一种针对噻虫嗪的半抗原、完全抗原制备方法及其应用与流程

[0001]
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种针对噻虫嗪的半抗原、完全抗原制备方法及其应用。


背景技术：

[0002]
噻虫嗪属烟碱类杀虫剂，是烟碱型乙酰胆碱受体的作用体，主要作用于昆虫神经接合后膜，通过与烟碱乙酰胆碱受体结合，干扰昆虫神经系统正常传导，引起神经通道的阻塞，造成乙酰胆碱的大量积累，从而使昆虫异常兴奋，全身痉挛、麻痹而死。噻虫嗪属低毒类杀虫剂，具有较强的触杀、胃毒和内吸作用。多用于水果、蔬菜、茶叶、粮食作物，可有效防治各种蚜虫、叶蝉、飞虱类、粉虱、马铃薯甲虫、金龟子幼虫、线虫、地面甲虫、潜叶蛾等害虫，以及对多种类型化学农药产生抗性的害虫。虽然噻虫嗪效果显著，使用后虫害能够得到有效控制，但不排除该农药的残留会对人、畜构成威胁，已有相关研究表明烟碱类杀虫剂会干扰蜜蜂归巢，会对哺乳动物神经系统的发育产生影响。近两年，欧盟已限制了烟碱类杀虫剂药在一些作物上的使用。我国食品安全国家规定标准gb2763
‑
2016《食品中农药最大残留限量》中规定蔬菜结球甘蓝中噻虫嗪的最大残留量限量为0.2mg/kg、黄瓜为0.5mg/kg；水果中西瓜为0.2mg/kg；谷物中糙米为0.1mg/kg，小麦为0.1mg/kg。
[0003]
现今常用检测噻虫嗪农药残留的方法为色谱法，包括气相色谱法(gc)、高效液相色谱法(hplc)、气质联用(gc
‑
ms)、液质联用(lc
‑
ms)、超临界流体色谱(sfc)、毛细管电泳(ce)等的仪器方法，但这些方法需要昂贵的仪器、专业的操作人员，且样品前处理复杂、成本高、时间长、不能实现大量样品的快速检测，因此，建立快速、灵敏、价廉的噻虫嗪检测方法具有重要意义。酶联免疫分析法(elisa)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。建立高效的免疫学检测方法，其首要条件是进行半抗原和完全抗原的制备。优秀的半抗原、完全抗原可以激发被免疫动物产生灵敏度高、特异性好的抗体。


技术实现要素：

[0004]
本发明的一个目的在于提供一种噻虫嗪半抗原以及噻虫嗪完全抗原，可有效地刺激被免疫动物产生灵敏度高、特异性强的噻虫嗪抗体。
[0005]
本发明的另一个目的在于提供上述噻虫嗪半抗原以及噻虫嗪完全抗原的制备方法,该方法简单易行。
[0006]
本发明制备得到的噻虫嗪半抗原及噻虫嗪完全抗原可用于噻虫嗪的免疫分析方法建立，应用于食品中噻虫嗪的残留检测。
[0007]
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0008]
本发明提供的噻虫嗪半抗原，其结构式如式i所示：
[0009][0010]
本发明提供的噻虫嗪完全抗原，其结构式如式ii所示：
[0011][0012]
其中，式ii中的pr代表载体蛋白，具体可为牛血清蛋白(bsa)。
[0013]
本发明还提供噻虫嗪半抗原的制备方法。
[0014]
所述噻虫嗪半抗原的制备方法，包括下述步骤：
[0015]
在碱性条件下，使噻虫嗪和4
‑
巯基苯甲酸进行反应，得到所述噻虫嗪半抗原。
[0016]
所述反应在溶剂中进行，所述溶剂可为n,n
‑
二甲基甲酰胺。
[0017]
所述碱性条件可由氢氧化钠提供，所述噻虫嗪与氢氧化钠的摩尔比为1:2
‑
3，具体可为1:3。
[0018]
所述噻虫嗪和4
‑
巯基苯甲酸的摩尔比为1:1.1
‑
1:1.5，具体可为1:1.1
[0019]
所述反应在加热回流条件下进行，所述反应的温度可为110℃，时间可为3～4小时。
[0020]
所述方法还包括下述步骤：反应结束后，待反应体系冷却至室温，加入水淬灭反应，调节反应体系ph值到中性并加入乙酸乙酯分层，收集有机层干燥浓缩后得到噻虫嗪半抗原粗产品。具体可采用浓盐酸调节反应体系ph值。
[0021]
所述方法还进一步包括对上述得到的噻虫嗪半抗原粗产品进行纯化的步骤，具体如下：将噻虫嗪半抗原粗产品重新用乙酸乙酯溶解，加入100
‑
200的硅胶搅拌均匀，浓缩除去溶剂后柱色谱分离，得到纯化后的噻虫嗪半抗原；其中，所述柱色谱分离的洗脱剂为体积比为3:1的石油醚、乙酸乙酯混合溶剂。
[0022]
本发明还提供了噻虫嗪完全抗原的制备方法。
[0023]
所述噻虫嗪完全抗原是由所述噻虫嗪半抗原与载体蛋白偶联后得到。所述噻虫嗪完全抗原可以作为免疫原也可以作为包被原。其中，所述噻虫嗪完全抗原作为免疫原，其采用的载体蛋白具体可为牛血清白蛋白(bsa)；所述噻虫嗪完全抗原作为包被原，其采用的载体蛋白具体可为卵清白蛋白(ova)。
[0024]
所述噻虫嗪半抗原与载体蛋白的偶联摩尔比为20:1
‑
40:1，具体可为20:1；
[0025]
本发明所提供的噻虫嗪完全抗原是采用活化酯法将载体蛋白偶联于所述噻虫嗪半抗原的羧基碳上。
[0026]
具体制备方法，包括下述步骤：
[0027]
a)将噻虫嗪半抗原溶于二甲基甲酰胺中，加入二环己基碳二亚胺和n
‑
羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌得到a液；
[0028]
b)将载体蛋白溶于碳酸盐缓冲液中，得到b液；
[0029]
c)将所述a液与b液混合并搅拌，得到c液；
[0030]
d)将c液置于透析袋并于磷酸缓冲液中透析，收集透析袋中的溶液，即为噻虫嗪完全抗原。
[0031]
上述方法步骤a)中，所述噻虫嗪半抗原、二甲基甲酰胺、二环己基碳二亚胺和n
‑
羟基琥珀酰亚胺的用量比为20μmol∶1
‑
2ml∶60
‑
120μmol∶60
‑
120μmol，具体可为：20μmol∶1ml∶60μmol∶60μmol；所述搅拌的时间可为18
‑
24小时，
[0032]
上述方法步骤b)中，所述载体蛋白具体可为牛血清蛋白(bsa)、卵清白蛋白(ova)。
[0033]
所述载体蛋白和碳酸盐缓冲液的用量比为0.4μmol∶3
‑
6ml，具体可为：0.4μmol∶3ml。
[0034]
上述方法步骤c)中，所述搅拌的条件为：4℃
‑
25℃(具体可为4℃)搅拌10
‑
12小时(具体可为10小时)。
[0035]
上述方法步骤d)中，所述透析每3小时换液一次，共透析6次。
[0036]
本发明还提供了由所述噻虫嗪完全抗原制备的噻虫嗪特异性抗体。
[0037]
所述特异性抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体。
[0038]
所述多克隆抗体可通过噻虫嗪完全抗原免疫实验动物(如bal b/c小鼠)，收集血清纯化获得。
[0039]
本发明还提供了一种检测噻虫嗪的酶联免疫试剂或试剂盒。
[0040]
该检测噻虫嗪的酶联免疫试剂或试剂盒，包括所述的噻虫嗪完全抗原和所述的噻虫嗪特异性抗体。
[0041]
本发明还提供了噻虫嗪半抗原或所述噻虫嗪完全抗原的应用。
[0042]
所述应用为在制备抗噻虫嗪特异性抗体中的应用。
[0043]
本发明还提供了所述抗噻虫嗪特异性抗体的应用。
[0044]
所述应用选自下述至少一方面：
[0045]
(1)在检测噻虫嗪中的应用；
[0046]
(2)在制备噻虫嗪的elisa检测用试剂盒中的应用；
[0047]
(3)在制备噻虫嗪的胶体金检测试纸条中的应用。
[0048]
本发明的制备方法简单易行，制备得到的噻虫嗪半抗原、噻虫嗪完全抗原，可有效地刺激被免疫动物产生灵敏度高、特异性强的噻虫嗪抗体，可用于免疫分析中，满足国内对噻虫嗪的残留检测。
附图说明
[0049]
图1为间接竞争酶联免疫方法(icelisa)检测噻虫嗪的标准抑制曲线。
具体实施方式
[0050]
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的
精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0051]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0052]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0053]
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0054]
实施例1、制备式i所示的噻虫嗪半抗原
[0055][0056]
下述“份”均指“摩尔份数”。
[0057]
1)将1份噻虫嗪溶解在3
‑
4份n,n
‑
二甲基甲酰胺中，加入2
‑
3份氢氧化钠和1.1份4
‑
巯基苯甲酸，反应体系110℃加热回流3～4小时，待反应体系冷却至室温，加入10份水淬灭反应，用浓盐酸调节反应体系ph到中性并加入20份乙酸乙酯分层。收集有机层干燥浓缩后得到目标产物的粗产品。
[0058]
2)将1份上述目标产物粗产品重新用1份乙酸乙酯溶解，加入1份100
‑
200的硅胶搅拌均匀，浓缩除去溶剂后柱色谱分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯，体积比为3:1，浓缩洗脱液得到化合物：(e)
‑4‑
((5
‑
((5
‑
甲基
‑4‑
(硝基亚氨基)
‑
1,3,5
‑
恶二嗪
‑3‑
基)甲基)噻唑
‑2‑
基)硫代)苯甲酸，即噻虫嗪半抗原。
[0059]
经核磁氢谱和高分辨质谱进行结构鉴定，所得化合物确为目标产物。
[0060]1h nmr(300mhz,cdcl3)δ12.45(s,1h),8.00(d,j＝8.3hz,2h),7.88(d,j＝8.3hz,2h),7.66(s,1h),5.01(d,j＝17.5hz,4h),4.75(s,2h),2.85(s,3h).hrms calcd for c
15
h
15
n5o5s2:[m+h
+
]410.0587,found 410.0561.
[0061]
实施例2、制备式ii所示的噻虫嗪抗原及噻虫嗪完全抗原
[0062][0063]
以实施例1的噻虫嗪半抗原制备噻虫嗪完全抗原，包括以下步骤：
[0064]
1)将噻虫嗪半抗原溶于二甲基甲酰胺中，加入二环己基碳二亚胺和n
‑
羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌18
‑
24小时得到a液；其中，噻虫嗪半抗原、二甲基甲酰胺、二环己基碳二亚胺和n
‑
羟基琥珀酰亚胺的用量比依次为20μmol∶1ml∶60μmol∶60μmol；
[0065]
2)将载体蛋白(bsa)溶于碳酸盐缓冲液(ph值7.0)中，得到b液；其中，载体蛋白和碳酸盐缓冲液的用量比为0.4μmol∶3ml；
[0066]
3)将上述a液滴加到b液中并于4℃搅拌10
‑
12小时，得到c液；
[0067]
4)将c液置于透析袋并于磷酸缓冲液中透析，每3小时换液一次，共透析6次，收集透析袋中的溶液，即为免疫原溶液，即所述噻虫嗪完全抗原，﹣20℃保存。
[0068]
噻虫嗪包被抗原的合成：
[0069]
用ova代替bsa，其它步骤同上，得到噻虫嗪包被抗原。
[0070]
实施例3、噻虫嗪完全抗原的鉴定
[0071]
用实施例2制备的噻虫嗪完全抗原按表1方案免疫bal b/c小鼠，四次免疫后第7天采眼眶静脉血清进行检测，判断所制备的噻虫嗪抗原是否具有免疫活性。
[0072]
表1免疫方案
[0073][0074][0075]
1)将实施例2制备的噻虫嗪包被抗原(1mg/ml)按表2稀释(稀释剂为样品稀释液，样品稀释液:500ml ph为7.5的pbs中加入0.1ml tween
‑
20，0.5g明胶)后加入酶标板，每孔100μl，37℃温育3h后取出，用pbst洗净；
[0076]
2)将已包被的板子按表2对照孔每孔加入50μl的样品稀释液，抑制孔每孔加入50μl 200ng/ml的噻虫嗪标样；
[0077]
3)取采集的小鼠血清，用样品稀释液按表2的倍数稀释后，每孔加入50μl，随后将酶标板置于37℃温育0.5h后取出，用pbst洗净；
[0078]
4)向酶标孔中加入1μg/ml的羊抗小鼠抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司及商品目录号：111
‑
035
‑
003)，每孔100μl，随后将酶标板置于37℃温育0.5h后取出，用pbst洗净，向酶标孔中加入100μl的显色液，室温显色，待对照孔与抑制孔浓度差为1.0左右时，每孔用50％浓硫酸终止反应，492nm读取吸光值；
[0079]
5)实验结果显示，吸光值随抗原、血清的稀释倍数加大，呈现逐渐下降的规律。小鼠血清效价定义为od值为1.0时抗血清的最大稀释倍数，抑制率＝[(对照孔od值
‑
抑制孔od值)/对照孔od值]
×
100％，从表2可知，小鼠血清效价为4000，当包被抗原(1.0mg/ml)稀释倍数为1：16000，血清为1:4000时，噻虫嗪对血清的抑制效率最高，52.04％。
[0080]
表2小鼠血清效价及其对噻虫嗪的抑制反应检测
[0081][0082]
注:c表示酶标板中的对照孔，i表示酶标板中的抑制孔(200ng/ml)
[0083]
以此抗原免疫bal b/c小鼠，经筛选获得的单克隆抗体建立间接竞争酶联免疫检测方法(ic
‑
elisa)，检测范围为4～101ng/ml，检测限为1.95ng/ml；该方法的ic
50
为15ng/ml，曲线的相关系数为0.9993。
[0084]
表3单克隆抗体对不同烟碱类农药的ic
50
与交叉反应率
[0085][0086]
ni表示在50μg/ml的分析物中未观察到抑制作用
[0087]
实施例5、食品中噻虫嗪的检测
[0088]
准确称取两份等量的20.0g苹果、西红柿试样于80ml离心管中，加入40ml乙腈，用高速组织捣碎机在15000r/min，匀浆提取1min，加入5g氯化钠，再匀浆提取1min，在3800r/min离心5min，取上清液20ml(相当于10g试样量)，在40℃水浴中旋转浓缩至约0.5ml，将浓缩液置于氮气吹干仪上吹干。
[0089]
3)1份用于ic
‑
elisa检测，所用溶剂为10ml pbs，1份用于高效液相色谱
‑
串联质谱检测，所用溶剂为1ml乙腈+水(3+2)；苹果试样以20、30、50ng/ml噻虫嗪为添加浓度，西红柿试样以15、20、30ng/ml噻虫嗪进行添加回收检测，见表4。结果表明，以该方法制备的完全抗原免疫小鼠所得的抗体建立的ic
‑
elisa方法对苹果、西红柿中噻虫嗪检测，回收率在75％
‑
120％，经高效液相串联质谱法lc
‑
ms
‑
ms验证回收率在77％
‑
110％之间，表明以此抗原制备的抗体所建立的ic
‑
elisa法具有良好的实用性。
[0090]
表4噻虫嗪在苹果、西红柿中的添加回收试验
[0091][0092]