去免疫化溶葡萄球菌酶和使用方法

本申请为国际申请pct/us2015/030765进入中国国家阶段的中国专利申请(申请号为201580038125.6，申请日为2015年5月14日，发明名称为“去免疫化溶葡萄球菌酶和使用方法”)的分案申请。

引言

本申请要求2014年5月14日提出的美国专利申请序列号61/993,056、2014年5月27日提出的美国专利申请序列号62/003,256、2015年2月12日提出的美国专利申请序列号62/115,326和2015年4月30日提出的美国专利申请序列号62/155,079的优先权权益，这些专利申请的内容以引用的方式整体并入本文中。

本发明是在政府支持下以美国国家卫生研究院(thenationalinstitutesofhealth)颁予的许可号1r21ai098122进行的。政府在本发明中具有一定权利。

背景

金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)定殖于人类和动物的皮肤和粘膜，并连同葡萄球菌属(genusstaphylococcus)的其它成员一起，与多种感染病相关。金黄色葡萄球菌含有许多毒力因子，包括称为“识别粘附基质分子的微生物表面组分”的表面蛋白，其促进与表面的粘附并起始感染(gordon和lowy(2008)clin.infect.dis.46:s350-s359)。金黄色葡萄球菌还可以形成生物膜(donlan和costerton(2002)clin.microbiol.rev.15:167-193)，此允许其逃避免疫系统与抗生素。大部分菌株具有多醣荚膜并分泌多种酶，这些酶在感染期间用以增强细菌传播(foster(2005)nat.rev.microbiol.3:948-958)。金黄色葡萄球菌还会引起中毒性休克综合症，且研究已经展示金黄色葡萄球菌细胞壁的肽聚糖和脂胞壁酸共同起作用，引起大鼠中毒性休克(kimpe等人,(1995)proc.natl.acad.sci.usa92:10359-10363)。

青霉素后出现的葡萄球菌的抗生素抗性首先用于治疗葡萄球菌感染。到20世纪60年代，超过80％临床分离株中存在的此抗性的发展(lowy(2003)j.clin.invest.111:1265-1273)促使新的更有效的药物发展以抗击机会病原体。这些努力产生了甲氧西林，甲氧西林是一种经设计以减轻葡萄球菌感染负荷的窄谱性青霉素酶抗性药物。然而，仅仅一年就发现了首批甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(mrsa)临床分离株。

最初，mrsa感染仅仅与长期住院治疗和侵入性手术程序相关，并被分类为护理获得性mrsa(hca-mrsa)。然而，近年来，mrsa又显现为社区获得性感染(ca-mrsa)，其影响着高强度身体接触的群体，例如比赛运动员、军队新兵和托儿中心的幼儿(romano等人,(2006)j.athl.train.41:141-145；kazakova等人,(2005)newengl.j.med.352:468-475；zinderman等人,(2004)emerg.infect.dis.10:941-944；adcock等人,(1998)j.infect.dis.178:577-580)。

金黄色葡萄球菌细胞壁由n-乙酰基葡糖胺和n-乙酰基胞壁酸的交替多糖亚单元构成，其中每个n-乙酰基胞壁酸连接至肽链。肽聚糖的交联通过四个主要青霉素结合蛋白(pbp1、pbp2、pbp3和pbp4)实现，这些青霉素结合蛋白经由五甘氨酸肽间桥连接胞壁肽链。当金黄色葡萄球菌获得meca基因时，产生甲氧西林抗性，meca基因编码具有转肽酶活性但对青霉素和β-内酰胺抗生素的亲和力降低的青霉素结合蛋白pbp2a。抗性细胞仍然产生pbp，但考虑到pbp2a的表达，在甲氧西林和其它β-内酰胺存在下肽聚糖合成继续(hiramatsu等人,(2001)trendsmicrobiol.9:486-493)。

溶葡萄球菌酶是一种由模仿葡萄球菌(staphylococcussimulans)产生的甘氨酰基-甘氨酸锌依赖性肽链内切酶，其选择性地靶向五甘氨酸肽间横桥。已经分离溶葡萄球菌酶的基因并表征。已经进行基因截短，以去除36个残基的信号肽和224个残基长的前肽，由此促进与起始甲硫氨酸的融合以在细胞内表达，或者与外源性信号序列的融合，例如以允许单一种类的溶葡萄球菌酶分泌至大肠杆菌的壁膜间隙中(参见例如us2005/0118159)。成熟的247个残基酶由n端催化结构域(138个氨基酸)构成，该n端催化结构域经由18个残基的连接子连接至c端细胞壁结合结构域(92个氨基酸)(lu等人,(2013)antimicrob.agentschemother.57:1872-1881)。

溶葡萄球菌酶已经显示有望成为治疗金黄色葡萄球菌感染的治疗剂。已展示所述蛋白质溶解葡萄球菌菌株(schindler和schuhardt(1964)proc.natl.acad.sci.usa51:414421)和临床分离株(cropp和harrison(1964)can.j.microbiol.10:823-828)，并在动物模型中显示显著功效(schuhardt和schindler(1964)j.bacteriol.88:815-816；schaffner等人,(1967)yalej.biol.med.39:230-244；goldberg等人,(1967)antimicrob.agentschemother.7:45-53；kokai-kun等人,(2007)j.antimicrob.ther.60:1051-1059；placencia等人,(2009)ped.res.65:420-424；climo等人,(1998)antimicrob.agentschemother.42:1355-60)，包括葡萄球菌生物膜的模型(kokai-kun等人,(2009)j.antimicrob.ther.64:94-100)。在若干这些研究中，在长时间接受药物的动物中观测到针对溶葡萄球菌酶的抗体(climo等人,(1998)antimicrob.agentschemother.42:1355-1360)。类似地，使用鼻内溶葡萄球菌酶的人类临床试验指示抗溶葡萄球菌酶抗体滴度轻微升高(kokai-kun(2012),antimicrobialdrugdiscovery:emergingstrategies(tegos和mylonakis编)ch.10,147-165)。

为了提高药物动力学并降低免疫原性，溶葡萄球菌酶已与支链聚乙二醇(peg)有关。虽然聚乙二醇化降低免疫反应性，但酶的聚乙二醇化显著降低其活性(walsh等人,(2003)antimicrob.agentschemother.47:554-558)。另外，us2008/0095756描述溶葡萄球菌酶的细胞壁结构域的去免疫化。然而，未描述具有去免疫化催化结构域的变异体。

发明概述

本发明为一种去免疫化溶葡萄球菌酶，其在seqidno:49的ser124、ser122、asn121、arg118、ile99、lys95、tyr93、leu83、lys46、ile41、asn13、asn12中一个或多个上具有突变。在一个实施方案中，溶葡萄球菌酶去糖基化。在另一个实施方案中，突变为ser124gly、ser122asp、asn121gly、arg118thr、ile99gln、lys95glu、tyr93his、leu83met、lys46his、ile41glu、asn13his、asn12gly或其组合。在另一实施方案中，去免疫化溶葡萄球菌酶进一步在c端结合结构域中包括一个或多个氨基酸取代。提供一种含有去免疫化溶葡萄球菌酶和抗生素的药物组合物，以及预防或治疗微生物感染的方法。

附图简述

图1a-1e展示本发明的溶葡萄球菌酶变异体的序列比对。

图2展示溶葡萄球菌酶催化结构域的表位定位。将预测结合事件的总数针对溶葡萄球菌酶一级序列绘图。使用epimatrix，预测mhcii对偶基因drb*0101、0301、0401、0701、0801、1101、1301和1501的表位。最大评分为8且表示预测结合所有8个对偶基因的表位。在位置116观测到此类表位。episweep突变的位点用箭头和残基编号表示。表位组分成五个不同簇。还指示发现对溶葡萄球菌酶表达和活性不利的随后略去的突变(phe38gly和ser124tyr)。

图3展示针对全长设计计算的免疫原性评分的集合。设计中的每个肽被评估为八种mhc类别ii对偶基因的强(ic50<1μm)、中度(1μm<ic50<10μm)或弱(10μm<ic50<100μm)结合子。接着将强、中度和弱结合子求和以获得图中所示的总分。具有“a”的线指示野生型溶葡萄球菌酶催化结构域中强结合子的数目，而具有“b”的线展示中度结合子的数目。柱上的数字表示每个设计的突变负荷。*指示回复设计。

图4a-4c展示柔性5和柔性9变异体的体内功效和免疫原性分析。图4a：在用金黄色葡萄球菌感染和用野生型lst、变异体柔性5、变异体柔性9或pbs对照处理后c57bl/6小鼠的肺中的细菌负荷。每组n＝6。图4b：humi小鼠(都从单一供体人类化)皮下免疫接种野生型lst(wt)、变异体柔性5或变异体柔性9，并收获脾细胞且用相同蛋白质或者dmso离体再刺激。增殖测量为氚化胸腺嘧啶的吸收。每组n＝4，汇集，并一式三份测量。图4c，转基因dr4小鼠通过多次皮下注射野生型lst而免疫接种。最后加打后，使小鼠恢复20周，分成两组，并用野生型lst或变异体柔性5再攻击。收获脾细胞，且用再攻击蛋白质或dmso离体再刺激，且增殖测量为氚化胸腺嘧啶的吸收。每组n＝5，汇集并一式三份测量。统计显著性通过单向anova(图4a)或双向anova(图4b和4c)评估。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。

图5展示变异体lib5(顶)、opt4(中间)和lst^wt(底)的预测dr4t细胞表位。九聚体表位显示为lst氨基酸序列中对应位置的水平线(x轴)。lst^wt含有16个假定表位，opt4含有5个，且lib5仅仅含有三个。lst^wt中重叠表位密度区域在x轴上用实心方块突出显示。lib5(顶)和opt4(中间)中去免疫化突变的位置显示为实心垂直条。每个设计的突变(m)和表位(e)数指示在右侧。

图6a和6b分别展示溶葡萄球菌酶催化结构域和细胞壁结合结构域的整体表位图谱。预测hla对偶基因drb1*0101、0301、0401、0701、0801、1101、1301和1501的表位。九个残基肽表位用实线(1％-2％阈值)和虚线(3％-5％阈值)指示。在x轴上指示溶葡萄球菌酶催化结构域一级序列，且在y轴上展示与每个肽表位相关的hla对偶基因。用于可设计性分析的较高风险区在顶部用实心方框标记。虚线方框表示中等风险区域，其在去免疫化柔性9去免疫化催化结构域的研发期间也重新设计。

图7展示f11、f12和f13针对mrsa菌株usa400的最低抑制浓度(mic)。

图8展示c57bl/6小鼠中f11变异体的体内功效。小鼠通过腹膜内注射2×10⁸mrsa菌株usa400来攻击，且1小时后，小鼠用100μg野生型lst、f11或pbs处理。展示存活百分比。

发明详述

现在已经展示溶葡萄球菌酶的催化结构域可以去免疫化，而不会显著改变酶活性。具体地说，溶葡萄球菌酶的episweep分析用以鉴别mhcii结合事件。产生在催化结构域中含有突变的去免疫化溶葡萄球菌酶变异体，表达，纯化，并展示活性水平可与商业来源的溶葡萄球菌酶相当。通过将催化结构域的突变与细胞壁结合结构域的突变组合，本发明提供了一种完全去免疫化溶葡萄球菌酶变异体和其用于治疗微生物感染的方法。

如本文所用，术语“去免疫化”在提及溶葡萄球菌酶时使用时，是指其中特异性去除和/或修饰高免疫原性区域或残基的溶葡萄球菌酶(例如溶葡萄球菌酶变异体、其衍生物和/或同源物)。术语“去免疫化”为本领域中已知，且尤其已用于从包括抗体在内的其它治疗分子去除t细胞表位(参见例如wo98/52976或wo00/34317)。

体液抗体形成需要辅助t细胞与抗原特异性b细胞的合作。为了降低分子的免疫原性，一种方法是降低抗原与b细胞相互作用和刺激b细胞的能力和/或降低其刺激辅助t细胞的能力。然而，考虑到b细胞表位具有不确定的长度并常依赖于标靶抗原的三级结构的事实，鉴别其存在着问题。相比之下，t细胞表位是短(9-15个氨基酸)的线性肽(参见例如doytchinova和flower(2006)mol.immunol.43(13):2037-44)。另外，证据表明降低t细胞活化更容易实现且能够极大地影响抗体产生(参见例如tangri等人,(2005)j.immunol.174:3187-3196)。包括刺激t细胞的抗原决定子的氨基酸序列称为t细胞表位且在主要组织相容性复合物(mhc)分子情况下展示在抗原呈递细胞上。改变t细胞表位结合mhc分子的能力(例如通过抑制表位与mhc分子的结合、改变表位与mhc分子之间的亲和力、在mhc分子的结合区内时以改变表位的取向的方式改变表位或通过改变mhc分子对其呈递的方式改变表位)能够使改变的表位不能或不太能刺激免疫原性反应(例如刺激辅助t细胞和b细胞反应)。因此，使用本文中描述的方法，鉴别溶葡萄球菌酶的表位并随后改变以降低溶葡萄球菌酶的免疫原性和其诱发体液抗体反应的能力。

因此，去免疫化涉及t细胞表位、较佳辅助t细胞表位的鉴别、修饰和/或去除。在此情况下，术语t细胞表位在mhci类和/或ii类分子情况下是指由t细胞识别的t细胞表位(即小肽)。用于鉴别t细胞表位的方法是本领域中已知的(参见例如wo98/52976、wo00/34317和us2004/0180386)。多种鉴别方法包括(但不限于)肽穿线、肽-mhc结合、人类t细胞分析、细胞因子表达模式的分析、elispot检定、ii类四聚体表位定位、搜索mhc结合基元数据库和t细胞表位的其它去除/修饰。在具体实施方案中，使用结构引导的去免疫化法，例如episweep法所采用的方法。episweep整合基于结构的蛋白质设计、基于序列的蛋白质去免疫化和用于寻找设计空间的帕累托前沿的算法(parker等人,(2013)j.comput.biol.20:152-65)。

通过应用以上叙述的技术鉴别出t细胞表位后，可以通过所鉴别的mhc结合肽内的一个或多个氨基酸取代，从溶葡萄球菌酶或其片段(例如催化结构域)消除、取代和/或修饰表位，如本文中进一步描述。在一些实施方案中，产生一个或多个消除或极大地减少与mhci类和/或ii类分子的结合的氨基酸取代，或者将mhc结合肽改变成保留其结合mhci类或ii类分子的能力但未能触发t细胞活化和/或增殖的序列。

已展示成熟溶葡萄球菌酶具有两个功能域，结合金黄色葡萄球菌外部细胞壁的92个残基的c端结构域和具有肽链内切酶活性的n端活性位点(baba和schneewind(1996)emboj.15:4789-4797)。部分由于溶葡萄球菌酶两个分开结构域的不同溶解特征，故溶葡萄球菌酶尚未成功地结晶。然而，使用本文中描述的电脑模拟方法，已经产生包括不同突变组合的高功能性的溶葡萄球菌酶蛋白质。选择催化结构域中每个位置的易变氨基酸(除活性位点残基外)，产生预测具有较低免疫原性，同时保留稳定性的溶葡萄球菌酶变异体。评估每个突变的表达和活性。仅仅选择在两方面都令人满意的突变，并再次重复去免疫化过程。在所产生的计划的适当能量最小化后，选择具有最佳预测能量评分的设计并通过实验测试。接着纯化能够表达的溶葡萄球菌酶变异体并进一步表征活性、稳定性和免疫原性。

因此，本发明提供了多种溶葡萄球菌酶变异体，包括免疫原性表位的修饰(例如突变，例如氨基酸取代)，其保留活性，同时显示降低的免疫原性。如本文所用，术语“溶葡萄球菌酶”是指编码全长溶葡萄球菌酶或其部分的氨基酸序列和/或核酸序列、任何溶葡萄球菌酶突变体或变异体(例如seqidno:1-48或218-220中任一个的溶葡萄球菌酶)、任何溶葡萄球菌酶截短(例如其中已经从蛋白质的氨基端、羧基端或两者去除一个或多个氨基酸)和保留针对葡萄球菌的细胞壁肽聚糖中含甘氨酸桥的蛋白水解袭击的体外和体内蛋白水解能力的任何重组表达的溶葡萄球菌酶蛋白质。溶葡萄球菌酶变异体(例如本文中描述的去免疫化溶葡萄球菌酶)也可以呈截短形式表达。经修饰的全长溶葡萄球菌酶或溶葡萄球菌酶变异体可以通过蛋白质的翻译后加工(通过存在于宿主细胞菌株中的酶或借助于在此过程的任何阶段引入的酶或试剂)或通过结构基因的突变来产生。如本文所描述的溶葡萄球菌酶变异体可以包括缺失、插入、结构域去除、点和替换/取代突变。

本发明不限于任何具体的溶葡萄球菌酶变异体。实际上，本发明提供多种变异体，包括(但不限于)实施例中描述和图1a-1e中描绘的变异体。在一些实施方案中，当与野生型序列比较时，溶葡萄球菌酶变异体具有单一氨基酸取代(例如任一本文中描述的氨基酸取代)：aathehsaqwlnnykkgygygpyplginggmhygvdffmnigtpvkaissgkiveagwsnygggnqigliendgvhrqwymhlskynvkvgdyvkagqiigwsgstgystaphlhfqrmvnsfsnstaqdpmpflksagygkaggtvtptpntgwktnkygtlyksesasftpntdiitrttgpfrsmpqsgvlkagqtihydevmkqdghvwvgytgnsgqriylpvrtwnkstntlgvlwgtik(seqidno:49)。在一些实施方案中，当与野生型序列比较时，溶葡萄球菌酶变异体具有两个氨基酸取代。在其它实施方案中，当与野生型序列比较时，溶葡萄球菌酶变异体具有三个氨基酸取代。在其它实施方案中，当与野生型序列比较时，溶葡萄球菌酶变异体具有四个或更多个氨基酸取代。在某些实施方案中，溶葡萄球菌酶变异体在催化结构域中具有一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，溶葡萄球菌酶突变体在ser124、ser122、asn121、arg118、ile99、lys95、tyr93、leu83、lys46、ile41、asn13、asn12或其组合具有突变。在一些实施方案中，溶葡萄球菌酶变异体具有以下突变之一或组合：ser124gly、ser122asp、asn121gly、arg118thr、ile99gln、lys95glu、tyr93his、leu83met、lys46his、ile41glu、asn13his和asn12gly。在其它实施方案中，溶葡萄球菌酶变异体在c端结合结构域中也具有一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，溶葡萄球菌酶变异体在asn236、arg186、ala169、ser166、tyr160或其组合具有c端结合结构域突变。在一些实施方案中，溶葡萄球菌酶变异体在c端结合结构域突变中具有以下突变之一或组合：asn236asp、arg186thr、ala169gly、ser166asn和tyr160his。c端结合结构域中其它适合的氨基酸取代包括(但不限于)us2008/0095756中公开的氨基酸取代。

类似地，本发明不限于任何具体的突变类型。本发明的突变包括(但不限于)氨基酸交换、插入、缺失、添加、取代、倒置和/或复制。这些突变/修饰还包括保守和/或同源氨基酸交换。已经描述关于如何制备表型/功能上沉默的氨基酸取代的指导(参见例如bowie(1990),science247:1306-1310)。

本发明还提供了氨基酸序列与图1中所示的多肽序列(seqidno:1-48)或seqidno:218-220中至少60％、更优选至少70％、更优选至少80％、更优选90％、更优选至少95％和最优选99％一致或同源的溶葡萄球菌酶变异体。

在一些实施方案中，本发明的溶葡萄球菌酶变异体引起的免疫反应(例如如通过抗溶葡萄球菌酶抗体滴度测量)比未去免疫化溶葡萄球菌酶引起的免疫反应少90％、更优选少80％、更优选少70％、更优选少60％、更优选少50％、更优选少40％、更优选少30％、更优选少20％且甚至更优选少10％。

在一些实施方案中，本发明提供了一种质粒，其具有编码去免疫化溶葡萄球菌酶变异体的核酸序列。在某些实施方案中，质粒为具有编码溶葡萄球菌酶变异体的核酸序列的表达载体(例如其显示杀菌活性和降低的免疫原性和)。在一些实施方案中，溶葡萄球菌酶变异体表达为融合蛋白，例如与促进纯化的序列(例如组氨酸延伸)融合。在一些实施方案中，本发明的表达载体具有编码去免疫化溶葡萄球菌酶变异体的核酸序列，该去免疫化溶葡萄球菌酶变异体具有如seqidno:1-48(图1a-1e)或seqidno:218-220中阐述的氨基酸序列。

除溶葡萄球菌酶变异体核酸外，本发明的质粒还可以包括调控序列，例如启动子、转录强化子和/或允许溶葡萄球菌酶变异体诱导性表达的序列。举例来说，一种适合的诱导系统为四环素调控的基因表达系统(参见例如gossen和bujard(1992)proc.natl.acad.sci.usa89:5547-5551；gossen等人(1994)trendsbiotech.12:58-62)。在一些实施方案中，诱导系统为异丙基-b-d-硫代半乳糖苷(iptg)诱导性启动子。

使用表达质粒，本发明的溶葡萄球菌酶变异体可以通过大量已知的方法产生。举例来说，溶葡萄球菌酶变异体可以从以下表达和分离：球形芽孢杆菌(bacillussphaericus)(us4,931,390)；乳酸乳球菌(lactococcuslactis)nice表达系统(nisin控制的基因表达)(mierau等人,(2005)microb.cellfact.4:1-9)；pet23b(+)和pbad/thio-topo大肠杆菌表达系统(szweda等人,(2005)j.biotechnol.117:203-213)；bl21(de-3)大肠杆菌(sharma等人,(2006)prot.exp.purific.45:206-215)；或巴斯德毕赤氏酵母(pichiapastoris)，如本文和其它地方关于产生治疗蛋白所描述(gasser等人,(2013)futuremicrobiol.8:191-208；walsh(2010)naturebiotechnol.28:917-924；shekhar(2008)chem.biol.15:201-202；meyer等人,(2008)bioproc.internat.6:10-21)。在具体实施方案中，本发明的溶葡萄球菌酶变异体通过在巴斯德毕赤氏酵母中表达而获得，巴斯德毕赤氏酵母的特征在于有效和选择性分泌、高蛋白滴度和高细胞密度培养(vogl等人,(2013)curr.opin.biotechnol.24:1094-1101)。此外，巴斯德毕赤氏酵母被认为是一种安全(gras)生物体，具有可以用于蛋白质分泌的若干信号序列，且具有已知的最强启动子之一(aox)。因为其允许蛋白质直接分泌至培养基中，所以巴斯德毕赤氏酵母极大地简化了蛋白质回收和下游纯化。

本发明的溶葡萄球菌酶变异体可以通过大量已知的方法来纯化。举例来说，由于其具有高正电荷，所以已使用阳离子交换步骤从例如模仿葡萄球菌、球形芽孢杆菌或乳酸乳球菌等细菌宿主纯化溶葡萄球菌酶(recsei等人,(1990)上述；mierau等人,(2005)上述；fedorov等人,(2003)biochemistry(moscow)68:50-53)。当在大肠杆菌中表达时，已使用亲和层析法纯化溶葡萄球菌酶(szweda等人,(2005)上述；sharma等人,(2006)上述)。

可以用若干不同的方式测定溶葡萄球菌酶活性：最低抑制浓度(mic)、最低杀菌浓度(mbc)、圆盘扩散和浊度降低(kusuma和kokai-kun(2005)antimicrob.agentschemother.49:3256-3263)。进行mic检定以获得预防金黄色葡萄球菌细胞生长所需的溶葡萄球菌酶最低浓度，而在mic检定后通常进行mbc检定，以确定杀死金黄色葡萄球菌所需的药物最低浓度。mic检定被认为是测定治疗剂值的金标准。进行圆盘扩散检定以通过测定当含溶葡萄球菌酶的圆盘位于金黄色葡萄球菌菌苔上且随时间扩散至板培养基中时所产生的清除区直径来测量活性。浊度降低检定涉及测量当细胞进行溶解时金黄色葡萄球菌培养物的吸光度随时间的下降(schindler和schuhardt(1964)proc.natl.acad.sci.usa51:414-421)。

可以使用若干不同的方法测定蛋白质稳定性。用于测量热稳定性的三种公认方法包括例如差示扫描量热法(dsc)、差示扫描光散射(dsls)和差示扫描量荧光测定法(dsf)。所有方法都是基于测定在温度增加下蛋白质展开的速率，此为蛋白质稳定性的量度。举例来说，如果温度的小幅上升引起蛋白质展开，那么认为蛋白质不是很稳定。dsc直接测量与热变性相关的吸热并已经证明其足够定量评估蛋白质治疗剂的稳定性(wen等人,(2011)j.pharmaceut.sci.101:955-964)。dsls方法基于以下假设测量蛋白质稳定性：当蛋白质暴露于递增的温度时，蛋白质变性不可逆。使用光散射，此方法监测作为变性结果的聚集物。在dsf中，使用荧光染料，其在结合疏水性残基后发荧光。随着温度增加，蛋白质开始展开且暴露其核心中发现的疏水性残基，引起荧光信号的增加。在一定的温度变化范围内监测此信号增加且用以确定tm值。

为了评估免疫原性，产生体外和体内模型。因为mhc分子在t细胞依赖性免疫反应中起重要作用，所以体外检定可以用于测试肽结合mhc的能力(salvat等人,(2014)j.vis.exp.85)。另外，例如大鼠、小鼠和非人类灵长类动物等若干动物模型目前用于蛋白质治疗剂的临床前评估中，其中模型越接近人类，其预测患者中有害抗体的产生越准确(brinks等人,(2013)pharma.res.30:1719-1728)。

在一些实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其含有本发明的溶葡萄球菌酶变异体。举例来说，在一些实施方案中，本发明提供了一种组合物，其含有溶葡萄球菌酶变异体和药学上可接受的载剂。在某些实施方案中，本发明提供了一种溶葡萄球菌酶变异体(例如去免疫化溶葡萄球菌酶)，其用于药物组合物中，用于治疗或预防葡萄球菌感染(例如皮肤、伤口或器官)或作为多种活性金黄色葡萄球菌感染的疗法。在优选实施方案中，本发明的药物组合物包括治疗有效量的本发明溶葡萄球菌酶以及药学上可接受的载剂。本发明不受所利用的药学上可接受的载剂的类型限制。实际上，多种载剂是本领域众所周知的，包括(但不限于)无菌液体，例如水、油，包括石油、动物油、植物油、花生油、豆油、矿物油、芝麻油等等。还可以采用盐水溶液、右旋糖水溶液和甘油溶液作为液体载剂，尤其用于注射用溶液制剂。适合的药学载剂描述于remington'spharmaceuticalsciences,第18版中。

治疗有效量为合理地相信溶葡萄球菌酶变异体在治疗感染中提供缓解、帮助、防治或预防作用的一定量度的量。治疗有效量可以是相信足够阻断细菌定殖或感染的量。类似地，治疗有效量可以是相信足够减轻(例如根除)已存在的细菌感染的量。本发明的药物组合物尤其可用于预防、改善和/或治疗细菌感染。

本发明的组合物可以局部(例如表面)或全身(例如静脉内)施用。用于不经肠施用的制剂包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、例如橄榄油等植物油和例如油酸乙酯等可注射有机酯。水性载剂包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括生理盐水和缓冲培养基。不经肠媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖(ringer'sdextrose)、右旋糖和氯化钠、乳酸化林格氏或不挥发性油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏右旋糖的补充剂)等等。防腐剂和其它添加剂也可以存在，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等等。此外，本发明的药物组合物可以包含其它药剂，取决于药物组合物的预期用途。

根据本发明，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等等在本文中一般用以指获得所需药理学和/或生理作用。根据完全或部分预防感染，所述作用可以是预防性的，和/或根据完全或部分治疗(例如根除)细菌感染，可以治疗性的。如本文所用，术语“治疗”包括预防受试者(例如可能易感染(例如医院感染)但尚未被诊断为感染的受试者)中细菌感染；抑制细菌感染；和/或(c)减轻感染(例如完全或部分减少负责感染的细菌的存在)。

葡萄球菌感染，例如金黄色葡萄球菌引起的感染，是尤其例如医院、学校和养老院等环境中发病率和死亡率的重要原因。尤其处于风险中的患者包括婴儿、老年人、免疫受损者、免疫抑制者和患有需要频繁住院的慢性病状的人。也处于获得葡萄球菌感染的风险中的患者包括进行住院患者或门诊患者手术的患者、在重症监护室(icu)内的患者、进行连续血液透析的患者、具有hiv感染的患者、aids患者、烧伤受害者、免疫性减弱的人(例如由药物治疗或疾病引起)、长期生病或虚弱的患者、老年受试者、具有不成熟免疫系统的婴儿和具有血管内(例如植入)装置的人。因此，在一些实施方案中，含有溶葡萄球菌酶变异体的组合物施用这些类型受试者的任一个以及具有细菌感染或容易细菌感染(例如由金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌(s.epidermidis)引起)的其它受试者。

在一些实施方案中，本发明的溶葡萄球菌酶变异体被调配成水溶液、半固体配方或用于重构的干制剂(例如冻干、结晶或非晶形，有或无其它溶质用于渗透平衡)。可以在例如无毒稳定的药学上可接受的水性运载介质中在约3至8、典型5至8的ph值下调配或重构，用于通过常规方案和方式施用，或呈半固体配方，例如乳膏。传递可以例如经眼施用、静脉内(iv)、肌肉内、皮下或腹膜内途径，或鞘内，或通过吸入或用于涂布医学装置、导管和可植入装置，或通过直接安装至感染部位中，以允许实现血液和组织含量超过活性剂的最低抑制浓度(mic)(例如以实现微生物滴度减少，从而治愈、减轻或预防感染)。在一些实施方案中，抗微生物剂被调配成半固体配方，例如乳膏(例如用于表面或鼻内配方中)。

此外，溶葡萄球菌酶变异体可以与其它抗微生物剂同时或交替地共同施用，以便更有效地治疗感染性疾病。配方可以呈以下或重构成以下：用于表面、眼睛或鼻内涂覆的半固体配方；适于经眼施用的液体；静脉内推注或周围注射；或添加至较大体积静脉内滴注溶液；或可以呈较大体积或重构成较大体积，以通过缓慢的静脉内输注来施用。举例来说，溶葡萄球菌酶变异体可以结合干扰或抑制细胞壁合成的抗生素施用，这些抗生素为例如青霉素、萘夫西林和其它α或β-内酰胺抗生素、头孢菌素(例如头孢金素(cephalothin))、氨基糖苷、磺酰胺、抗叶酸剂、大环内酯、喹诺酮(quinolone)、糖肽(例如万古霉素(vancomycin))和多肽。在一些实施方案中，溶葡萄球菌酶变异体结合一种或多种抑制蛋白质合成的抗生素(例如氨基糖苷，例如链霉素(streptomycin)、四环素(tetracycline)和链阳性菌素(streptogramin))施用。本发明不受与去免疫化溶葡萄球菌酶共同施用的药剂的类型限制。实际上，多种药剂可以共同施用，包括(但不限于)每一个以引用的方式整体并入本文中的us6,028,051、us6,569,830和us7,078,377中描述的那些药剂。在一些实施方案中，溶葡萄球菌酶变异体与以下一起施用：单克隆抗体；其它非结合抗菌酶，例如溶葡萄球菌酶、溶菌酶、变溶菌素和胞酰胞壁质酶；肽(例如防御素)；和硫醚抗生素(例如乳链菌肽)；或任何其它含羊毛硫氨酸的分子(例如枯草菌素)。

与溶葡萄球菌酶变异体共同施用的药剂可以连同溶葡萄球菌酶变异体一起呈固定组合调配，或可以呈可获得和实用的任何配方和通过已知在感染部位提供足够含量的这些药剂的任何投药途径临时使用。

在优选实施方案中，根据本发明的溶葡萄球菌酶变异体具有对应的未去免疫化抗微生物剂的抗菌活性的至少一部分。由于免疫原性降低，所以本发明的溶葡萄球菌酶变异体施用的剂量可以增加和/或时间间隔更不频繁。在一些实施方案中，溶葡萄球菌酶变异体保留对应的未去免疫化抗微生物剂的活性的至少10％。在一些实施方案中，溶葡萄球菌酶变异体保留未去免疫化抗微生物剂的活性的至少20％。在一些实施方案中，溶葡萄球菌酶变异体保留未去免疫化抗微生物剂的活性的至少30％。在一些实施方案中，溶葡萄球菌酶变异体保留未去免疫化抗微生物剂的活性的至少40％。在一些实施方案中，溶葡萄球菌酶变异体保留未去免疫化抗微生物剂的活性的至少50％。在一些实施方案中，溶葡萄球菌酶变异体保留未去免疫化抗微生物剂的活性的至少60％。在一些实施方案中，溶葡萄球菌酶变异体保留未去免疫化抗微生物剂的活性的至少70％。在一些实施方案中，溶葡萄球菌酶变异体保留未去免疫化抗微生物剂的活性的至少80％。在一些实施方案中，溶葡萄球菌酶变异体保留未去免疫化抗微生物剂的活性的至少90％。在一些实施方案中，溶葡萄球菌酶变异体保留未去免疫化抗微生物剂的活性的90％或更多(例如95％、97％、99％或更多)。

去免疫化溶葡萄球菌酶的适合剂量和方式可以随感染的严重程度和感染生物体的敏感性而变，且在组合疗法的情况下，可能取决于共同施用的具体药剂(例如抗葡萄球菌剂)。剂量可以在约0.05至约500mg/kg/天范围内(例如在一些实施方案中，在0.1-10mg/kg/天范围内，在一些实施方案中，在10-100mg/kg/天范围内，在一些实施方案中，在100-200mg/kg/天范围内，在一些实施方案中，在200-400mg/kg/天范围内，在一些实施方案中，在400-500mg/kg/天范围内)，不过可以提供更高(例如500-1000mg/kg/天)或更低(例如0.1-0.5mg/kg/天)，呈单次或分次剂量给与，或通过连续输注给与。在一些实施方案中，去免疫化溶葡萄球菌酶一天一次、一天两次、一天三次或更频繁地(例如一天四次或更多次)施用。在一些实施方案中，去免疫化溶葡萄球菌酶一周一次、一周两次或每隔一天施用。在一些实施方案中，去免疫化溶葡萄球菌酶每隔一周一次、一个月一次、每两个月一次、每三个月一次、每四个月一次、每五个月一次、每六个月一次、每九个月一次、每年一次或更少频繁地施用。

在某些实施方案中，本发明的去免疫化溶葡萄球菌酶是无糖基化的。可如本文所述进行无糖基化，并可在残基ser126和/或thr127处包括突变。示例性突变包括ser126pro和thr127ala。

在一些实施方案中，本发明的去免疫化溶葡萄球菌酶可以经进一步修饰以进一步降低溶葡萄球菌酶分子的免疫原性，同时保留抗微生物活性。举例来说，在一些实施方案中，去免疫化溶葡萄球菌酶结合于水溶性聚合物。本发明不受去免疫化溶葡萄球菌酶结合的水溶性聚合物的类型限制。实际上，可以使用多种水溶性聚合物，包括(但不限于)聚(环氧烷)、聚氧乙基化多元醇和聚(乙烯醇)。聚(环氧烷)包括(但不限于)聚乙二醇(peg)、泊洛沙姆(poloxamer)和泊洛沙胺(poloxamine)。本发明不受所用的结合类型限制(例如使去免疫化溶葡萄球菌酶连接至一种或多种水溶性聚合物(例如peg))。在一些实施方案中，聚(环氧烷)经由聚(环氧烷)的酰胺键(例如由例如n-羟基琥珀酰亚胺酯等活性酯形成)结合于游离氨基。在一些实施方案中，在结合后酯键保留在结合物中。在一些实施方案中，连接通过去免疫化溶葡萄球菌酶分子中存在的赖氨酸残基进行。在一些实施方案中，结合通过短效的可降解键进行。本发明不受所利用的可降解键的类型限制。实际上，涵盖多种键可用于本发明，包括(但不限于)生理学上可裂解的键，包括酯、碳酸酯、氨基甲酸脂、硫酸酯、磷酸酯、酰氧基烷基醚、乙缩醛和缩酮键。在一些实施方案中，利用以下中描述的任一方法、试剂和/或键，使去免疫化溶葡萄球菌酶结合于peg：us4,424,311；us5,672,662；us6,515,100；us6,664,331；us6,737,505；us6,894,025；us6,864,350；us6,864,327；us6,610,281；us6,541,543；us6,515,100；us6,448,369；us6,437,025；us6,432,397；us6,362,276；us6,362,254；us6,348,558；us6,214,966；us5,990,237；us5,932,462；us5,900,461；us5,739,208；us5,446,090和us6,828,401；和wo02/02630和wo03/031581。在一些实施方案中，本发明的去免疫化溶葡萄球菌酶-水溶性聚合物结合物由第三方(例如nektar,sancarlos,ca)生产。在一些实施方案中，结合物包括存在于聚合物与去免疫化溶葡萄球菌酶之间的键中的可裂解键(例如使得当裂解时，聚合物或键部分不保留在去免疫化溶葡萄球菌酶分子上)。在一些实施方案中，结合物包括存在于聚合物本身中的可裂解键(例如使得当裂解时，少部分的聚合物或键部分保留在去免疫化溶葡萄球菌酶分子上)。

在一些实施方案中，本发明的去免疫化溶葡萄球菌酶用于治疗和/或预防生物膜(例如如us2003/0215433和wo03/082148中所描述)。在其它实施方案中，本发明的去免疫化溶葡萄球菌酶用于预防和/或治疗微生物感染，包括葡萄球菌属成员的细菌感染。根据此类方法，向需要治疗的受试者(例如出现金黄色葡萄球菌感染或处于出现金黄色葡萄球菌感染风险中的受试者)施用有效量的去免疫化溶葡萄球菌酶，从而预防或治疗微生物感染。得益于此治疗的受试者包括展现感染的临床征象或症状的受试者、暴露于细菌(例如金黄色葡萄球菌)的受试者或怀疑暴露于细菌(例如金黄色葡萄球菌)的受试者。有效治疗将减少、减弱、抑制或改善众所周知的感染征象或症状。在一些实施方案中，治疗包括鼻部涂覆，例如如us2003/0211995中所描述；或表面涂覆，例如如us2004/0192581中所描述。

所选剂量将取决于多种因素，包括所采用的具体去免疫化溶葡萄球菌酶的活性、施用途径、施用时间、具体去免疫化溶葡萄球菌酶的排泄或代谢速率、治疗持续时间、与所采用的具体去免疫化溶葡萄球菌酶组合使用的其它药物、化合物和/或物质、所治疗患者的年龄、性别、体重、病状、整体健康和先前病史以及医学领域中众所周知的类似因素。

本领域的普通医师或兽医可以容易确定和指定所需要的药物组合物的有效量。举例来说，医师或兽医可以从低于实现所需治疗作用所需水平的水平开始去免疫化溶葡萄球菌酶的剂量，且逐渐增加剂量，直到实现所需作用。认为此在技术人员技能内。

有效剂量还可以在领域公认的金黄色葡萄球菌感染模型中确定。存在许多不同的体内模型系统，本领域技术人员可以用以进一步证明在人类中将安全和有效的剂量的功效并帮助鉴别这些剂量。此类动物模型系统为公认的并在研发新的人类药物期间使用。此类模型系统的实例包括(但不限于)金黄色葡萄球菌伤口感染的豚鼠模型(kernodle和kaiser(1994)antimicrob.agentschemother.38:1325-1330)；兔中金黄色葡萄球菌脓肿的兔模型(fernandez等人,(1999)antimicrob.agentchemother.43:667-671)；金黄色葡萄球菌皮肤感染的小鼠模型(gisby和bryant(2000)antimicrob.agentschemother.44:255-260)；深度皮肤金黄色葡萄球菌感染的小鼠模型(godin等人,(2005)j.antimicrob.chemother.55:989-994)；和小鼠腹膜内感染模型(patel等人,(2004)antimicrob.agentschemother.48:4754-4761)。在此类模型中，可以针对感染测试治疗剂，其中所建立的感染来自用多种金黄色葡萄球菌菌株接种动物。此类模型中功效的证明用多种方式测量，并包括(但不限于)死亡率降低，通过对取自动物的组织或血液样品的微观检验确定的细菌细胞数减少，乃至评估动物中的伤口愈合。

仅出于举例的目的，本发明包括但不限于如下技术方案：

技术方案1.一种去免疫化溶葡萄球菌酶，其在seqidno:49的ser124、ser122、asn121、arg118、ile99、lys95、tyr93、leu83、lys46、ile41、asn13或asn12中一个或多个处包含突变。

技术方案2.如技术方案1所述的去免疫化溶葡萄球菌酶，其中所述溶葡萄球菌酶是无糖基化的。

技术方案3.如技术方案1所述的去免疫化溶葡萄球菌酶，其中所述突变包含ser124gly、ser122asp、asn121gly、arg118thr、ile99gln、lys95glu、tyr93his、leu83met、lys46his、ile41glu、asn13his、asn12gly或其组合。

技术方案4.如技术方案1所述的去免疫化溶葡萄球菌酶，其在c端结合结构域中包含一个或多个氨基酸取代。

技术方案5.一种药物组合物，其包含如技术方案1所述的去免疫化溶葡萄球菌酶和药学上可接受的载剂。

技术方案6.如技术方案5所述的药物组合物，其进一步包含抗生素。

技术方案7.如技术方案6所述的药物组合物，其中所述抗生素包含β-内酰胺、头孢菌素、氨基糖苷、磺酰胺、抗叶酸剂、大环内酯、喹诺酮、糖肽、多肽或其组合。

技术方案8.一种用于预防或治疗微生物感染的方法，其包括向需要治疗的受试者施用如技术方案5所述的药物组合物，由此预防或治疗所述受试者的微生物感染。

技术方案9.如技术方案8所述的方法，其中所述感染是细菌感染。

技术方案10.如技术方案9所述的方法，其中所述细菌感染由来自葡萄球菌属细菌引起。

提供了以下非限制性实施例以进一步说明本发明。

实施例1:溶葡萄球菌酶催化结构域的去免疫化

材料与方法

试剂和培养基。引物通过标准脱盐，从idttechnologies(coralville,ia)订购。pcr清除和凝胶提取试剂盒来自zymoresearch(irvine,ca)。商业溶葡萄球菌酶购自sigma(st.louis,mo)。使用qiaprepspinminiprep试剂盒(qiagen；valencia,ca)纯化质粒。除非另作说明，否则所有酶都从newenglandbiolabs(ipswich,ma)获得，且所有试剂都从vwrscientific(philadelphia,pa)获得。来源于溶葡萄球菌酶催化结构域的肽从genscript(piscataway,nj)订购，并超过85％纯。mhc-iidr分子购自benaroyaresearchinstitute(seattle,wa)，抗-mhc-iidr抗体购自biolegend(sandiego,ca)，且delfiaeu标记的抗生蛋白链菌素来自perkinelmer(boston,ma)。

表位预测。使用epimatrix预测溶葡萄球菌酶催化结构域的t细胞表位含量，epimatrix是一种预测已经展示与临床上观测到的治疗剂免疫原性非常相关的评分矩阵。epimatrix是一种用于预测hla结合的袖珍型方法(groot和moise(2007)curr.opin.drugdiscover.12月10日)。在此方法中，蛋白质被分成重叠9聚体肽，接着评估每一个与hla对偶基因的结合潜能。考虑八种最常见的hla对偶基因(drb1*0101、drb1*0301、drb1*0401、drb1*0701、drb1*0801、drb1*1101、drb1*1301、drb1*1501)，其代表超过90％的人口(southwood等人,(1998)j.immunol.160:3363-3373)。基于结合潜能，分配每种肽对应的标准化z评分，接着定位至簇免疫原性量表，此量表表示与随机产生的肽所预期的含量的表位含量偏差(groot等人,(2013)exp.rev.clin.pharmacol.6:651-662)。认为epimatrix“z”量表上评分超过1.64的肽(大约最高5％)很可能结合于对应mhc分子，而最高1％中肽评分(量表上超过2.32)极有可能结合(koren等人,(2007)clin.immunol.124:26-32)。如果对于四个或更多个对偶基因，肽的评分高于1.64，那么称含有epibar(weber等人,(2009)adv.drugdeliv.rev.61:965-976)。

溶葡萄球菌酶的同源性模型化。episweep基于两个定量量度分析去免疫化变异体：表位评分和力场能量值。然而，算法使用蛋白质的结构计算能量。因为溶葡萄球菌酶的晶体结构未知，所以基于类似于溶葡萄球菌酶的催化结构域的蛋白质的可得晶体结构，构筑溶葡萄球菌酶模型。通过比较溶葡萄球菌酶的序列与pdb数据库并选择三种高度类似的蛋白质结构(pdb寄存编号：2b0pa、2b44a和1qwya)，来选择模板。出于同源性模型化的目的，认为超过30％的序列一致性足够准确(rost(1999)prot.eng.designselect.12:85-94)。所有模板结构都属于lytm(一种来自金黄色葡萄球菌的自溶素)，其与溶葡萄球菌酶的催化结构域具有48％序列一致性和63％相似性(lu等人,(2013)上述)。

通过采用modeller，使用lytm晶体结构，建立催化结构域模型，modeller是一种同源性模型化方案，其基于模板结构的坐标建立蛋白质的三维结构(shen和sali(2006)proteinsci.15:2507-2524)。产生250个模型并根据dope统计势选择最准确的一个(shen和sali(2006)上述)。

对于没有足够的坐标信息来允许完整和准确地构筑模型的蛋白质区域，使用蛋白质环模型化方法fread，来重塑已存在的间隙(choi和deane(2010)proteins78:1431-1440)。所得同源性模型针对amber99sb与隐式溶剂模型(gb/sa)减到最少。通过使用scwrl4将电脑模拟突变应用至原始模型(krivov等人,(2009)proteins:struct.funct.bioinform.77:778-795)，接着能量重新最小化，将去糖基化野生型(125npt)模型化。

进化信息。去免疫化过程需要使预测参与mhc结合的残基突变。然而，t细胞表位可能存在于蛋白质任一部分中。因此，突变的随机选择会引起适当折叠和功能的破坏。此问题可以通过采用发现在序列上与标靶序列不太相似的点突变来减轻。为了确定哪些突变可用于去免疫化过程，通过运行psi-blast(3次迭代，e-值<0.001)收集总共10,000个lst^cat同源物。对这些序列进行过滤，以去除与野生型具有>50％间隙或<35％序列一致性的序列。对一组多样的218个代表性序列进行次选择，以使彼此具有至多90％序列一致性。允许的突变是预测消去至少一个假定表位，而如根据背景概率分布所预期频繁地出现的突变(mccaldon和argos(1988)proteins4:99-122)。其它筛选程序排除pro和cys的突变、涉及活性位点残基的突变(32his、36asp、82his、113his和115his)和先前认为不利的突变(thr43asp、ser50asp、asn121asp和leu135ser)。

episweep。基于结构的episweep是一种蛋白质重新设计工具，其允许蛋白质去免疫化，同时保留蛋白质稳定性和功能性。该算法将经验证的免疫信息与结构模型组合，产生帕累托最佳设计，帕累托最佳设计接着可以通过实验针对最佳免疫原性、稳定性和活性评分进行选择。已经描述episweep选择最佳设计的方法(parker等人,(2013)j.computation.biol.20:152-165)。简单地说，该算法通过假定蛋白质主链为刚性并从一组离散旋转异构体选择最佳侧链构象解决了稳定性问题，构象经选择以使总蛋白质能量减到最少。评估所有旋转异构体和旋转异构体对与主链以及彼此发生冲突的可能性。举例来说，将发现含有具有显著范德华半径重叠或具有格外高的旋转异构体内或旋转异构体间能量的旋转异构体的构象弃去(parker等人,(2013)上述)。

对于溶葡萄球菌酶催化结构域的episweep分析，允许突变负荷在两个至八个突变之间变化，且限制算法不允许活性位点的突变(his32、asp36、his82、his113和his115)。此外，算法将不仅在每个突变负荷下产生帕累托最佳计划(具有最低可能的旋转异构体能量的设计)，而且还产生其它19个次最佳计划(与帕累托最佳计划相比具有依序更差的旋转异构体能量的设计)。进行此分析，以校正可能由刚性主链假设引起的任何可能的错误，因为蛋白质的特征为高度柔性。事实上，已经注意到其它侧链最佳化改变了episweep设计的帕累托最优性，因此可能影响到设计选择(parker等人,(2013)上述)。

ser126pro主链的episweep分析。对于使用ser126pro溶葡萄球菌酶主链的分析，算法仅仅考虑12个耐受良好的突变(ser124gly、ser122asp、asn121gly、arg118thr、ile99gln、lys95glu、tyr93his、leu83met、lys46his、ile41glu、asn13his和asn12gly)。因为ser122asp突变是极有效的表位去除子(表6)，所以也限制算法在所有产生的计划中都包括此突变。使用分子模型化软件tinker，针对amber(amber99sb)力场和隐式溶剂模型(gb/sa)，进行episweep设计的其它加工后能量最小化。

质粒和菌株。巴斯德毕赤氏酵母菌株gs115和表达载体ppic9从invitrogen(grandisland,ny)获得，金黄色葡萄球菌菌株sa113和金黄色葡萄球菌金黄色亚种(atcc25923)从美国典型菌种保藏中心(theamericantypeculturecollection)(manassas,va)获得。金黄色葡萄球菌的其它菌株(甲氧西林敏感品菌株6445和3425-1，和mrsa菌株3425-3)是临床分离株。

为表达巴斯德毕赤氏酵母而最佳化的溶葡萄球菌酶基因的合成.如所述，进行合成溶葡萄球菌酶基因的合成(zhao等人,(2014)appl.environ.microbiol.80:2746-53)。大部分密码子被替换以反映巴斯德毕赤氏酵母的密码子偏爱(zhao等人,(2000)shengwugongchengxuebao16:308-11)。为破坏基因序列中长a+t核苷酸延伸，根据需要引入第二频繁的密码子。

基于pcr的单点突变体的合成。如所述来合成溶葡萄球菌酶单点突变体(zhao等人,(2014)上述)。简单地说，使用剪接重叠延伸pcr，利用表1中列出的引物，来引入突变。举例来说，通过首先使用syn_f和s122g_r以及s122g_f和syn_r引物扩增溶葡萄球菌酶基因，来引入ser122gly突变。接着所得(凝胶纯化)基因片段以等摩尔比率混合，并用作使用syn_f和syn_r引物的随后反应中的模板。最终产物是具有ser122gly突变的全长溶葡萄球菌酶基因。所有pcr反应都使用phusion高保真度dna聚合酶进行。接着用ecori和xhoi消化具有所需突变的溶葡萄球菌酶基因，并使用t4dna接合酶接合至ppic9质粒。接合的最终产物是与来自酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)的α交配因子分泌信号融合的溶葡萄球菌酶基因。将所得质粒转化至大肠杆菌dh5α电胜任细胞(f^-□80laczδm15δ(laczya-argf)u169reca1enda1hsdr17(r^-km⁺k)phoasupe44λ^-thi1gyra96rela1)中。使用syn_f和syn_r引物，评估克隆中溶葡萄球菌酶基因的存在，并进行定序，以证实突变的存在(引物aox1_f和aox1_r)。

表1

lst整合设计的克隆。在无arg118thr突变下合成在第一轮筛选中未表达且含有arg118thr突变的溶葡萄球菌酶变异体，并再次检查表达。使用引物t118r_f和t118r_r(表1)，剪接重叠延伸pcr用以使arg118thr突变回复至野生型(thr118)。

为制备ppic9质粒用于插入合成基因，将沉默突变引入溶葡萄球菌酶连接子(残基135-136)中以容纳用于限制酶aflii的切割位点。为了引入必要的突变，剪接重叠延伸pcr与引物aflii_f和aflii_r(表1)一起使用。合成基因用xhoi和aflii限制酶消化，并使用t4dna接合酶接合在类似消化的ppic9质粒中。将所得质粒转化至大肠杆菌dh5α电胜任细胞中并对所得克隆进行定序以证实突变的存在。

巴斯德毕赤氏酵母的表达和纯化。在通过序列分析证实dh5α克隆存在正确的催化结构域突变后，用saci高保真度限制酶消化经纯化的质粒，接着电穿孔至巴斯德毕赤氏酵母菌株gs115中。所得转化体在md板(1.34％酵母氮源、0.000004％生物素、2％右旋糖和1％琼脂)上生长。对于表达研究，克隆在500ml摇瓶中在bmgy培养基(1％酵母提取物、2％胨、1.34％酵母氮源、0.000004％生物素、1％甘油、100mm磷酸盐缓冲液，ph6)中在30℃下生长，该摇瓶用四层粗滤布覆盖以增强流至酵母的氧流量。24小时后，细胞在台式离心机中在3,000rpm下离心10分钟。接着细胞再悬浮于100mlbmmy诱导培养基(1％酵母提取物、2％胨、1.34％酵母氮源、0.000004％生物素、0.5％甲醇、100mm磷酸盐缓冲液，ph6)中并在30℃下生长随后48小时。以12小时的时间间隔，添加100％甲醇，最终浓度为1％。诱导48小时后，摇瓶培养物在台式离心机中在3,000rpm下离心15分钟。所得上清液进行过滤以去除任何酵母细胞并用10mm的ph7.5的kh2po4缓冲剂1:5稀释。稀释的上清液流过填充500μlsp-sepharose快速流动树脂(gehealthcare；cleveland,oh)的重力柱。柱用于10mmkh2po4中的50mmnacl的5ml含在ph7.5下洗涤。蛋白质用于的10mmkh2po4中的200mmnacl的500μl等分试样在ph7.5下洗脱。使用sds-page测定溶葡萄球菌酶的纯度。使用nd-1000光谱仪(nanodroptechnologies；wilmington,de)定量蛋白质浓度。为确保准确性，针对野生型溶葡萄球菌酶与其变异体，使用0.4的吸光度调节系数，调整蛋白质吸光度量度。简单地说，调节系数计算为报导的abs0.1％(＝1g/l)值(protparam,expasy)的倒数。

培养物上清液的溶解检定,金黄色葡萄球菌细胞在胰蛋白酶大豆肉汤(tsb)中在37℃下在震荡下生长至对数中期或者生长至饱和。细胞通过离心收获，并在磷酸盐缓冲生理盐水(pbs：2.7mmkcl、1.5mmkh2po4、8.9mmna2hpo4、136.9mmnaclph7.4)中洗涤一次。在来自greinerbio-one(monroe,nc)的96孔黑色透明底板中进行检定。最终(250μl)反应物由都在pbs中的10μl巴斯德毕赤氏酵母培养物上清液、od600＝1.5的金黄色葡萄球菌细胞和5μmsytoxgreen(thermofisherscientific；waltham,ma)构成。使用spectramaxgemini荧光微板读数器(moleculardevices；sunnyvale,ca)，使用504/523nm的激发/发射收集数据，并从迹线的最陡直线部分的斜率确定速率。用500ng商业来源的溶葡萄球菌酶(sslys)作为内部对照，进行每个检定。

从sds-page凝胶估计每个检定中使用的蛋白质的量。简单地说，10μl培养物上清液连同0.5μg、0.7μg和1μgsslys一起在sds-page凝胶上在分开的泳道中跑动。使用来自thermofisherscientific(carlsbad,ca)的gelcode蓝色染色试剂将凝胶染色，并使用来自imagelab5.1软件(bio-radlaboratories；hercules,ca)的定量工具定量亮带。

使用纯化蛋白质的溶解检定。使用如先前第2章部分3.2.6中描述的动力学检定，检查经纯化的溶葡萄球菌酶变异体的活性。每个反应中使用200ng经纯化的酶(代替培养物上清液)。

mic检定。通过添加酶的2倍连续稀释液至含有补充有2％nacl和0.1％牛血清白蛋白的mullerhinton肉汤(bd)中约40,000金黄色葡萄球菌sa113(或金黄色葡萄球菌6445、3425-1、3425-3)细胞的聚丙烯96孔板(costar3879)的孔中达100μl总体积，来确定野生型溶葡萄球菌酶和其变异体的mic。培养板在orbitp4回转式震荡器(labnet；edison,nj)上在37℃下在900rpm震荡下生长过夜。经纯化的溶葡萄球菌酶的抑制活性通过完全抑制细菌生长的酶的浓度来测定。针对每种酶，一式三份地进行检定。

pngasef处理。将巴斯德毕赤氏酵母培养物上清液用1μl10xg7缓冲液和相同体积的remove-itpngasef处理。将反应物在37℃下培育1小时并通过sds-page分析结果。

饱和突变诱发。使用已知的方法进行溶葡萄球菌酶催化结构域位置125的饱和突变诱发(zhao等人,(2014)上述)。简单地说，通过使用溶葡萄球菌酶合成基因作为模板和简并nnk引物，进行剪接重叠延伸pcr，来进行饱和突变诱发。将所得到的32成员的文库转化至巴斯德毕赤氏酵母中，且转化体在ypd培养基(1％酵母提取物、2％胨、1％甲醇、1％琼脂)上在30℃下生长48小时。为了找到表达活性酶的酵母克隆，将含有金黄色葡萄球菌sa113细胞的熔融顶部琼脂(0.5％酵母提取物、1％胨、1％nacl、0.75％琼脂)倾倒在ypm酵母板上且在37℃下培育10小时。使用引物syn_f和syn_r挑选形成晕环的菌落并扩增，且使用引物aox1_f和aox1_r对基因定序。

使用巴斯德毕赤氏酵母培养物上清液的mic检定。溶葡萄球菌酶mic基本上如所述(zhao等人,(2014)上述)测定。简单地说，在tsb中连续稀释100μl等分试样的巴斯德毕赤氏酵母培养物上清液。每个孔接种100μl含约10⁶cfu/ml金黄色葡萄球菌sa113的tsb。微板在37℃下培育24小时。培养物上清液中抑制活性被评估为mic50，处理稀释产生50％生长抑制。通过在微板读数器中测量650nm下光散射，定量mic50。

热稳定性。溶葡萄球菌酶变异体的相对热稳定性通过如先前所述的差异扫描荧光测定法来测定(niesen等人,(2007)nat.protocols2:2212-2221)。蛋白质和sypro橙在pbs中稀释(最终浓度分别为20μl反应体积中100μg/ml和5x)，并使用appliedbiosystemsabi7500快速实时pcr系统，从25至94℃以1℃增量，定量荧光。使用fastthermocyclers(vwr；radnor,pa)的pcr板进行反应。使用预设tamra参数定量荧光。通过用‘dsfanalysisv3.0.xlsx’excel表和graphpadprismv.6.02软件进行数据分析，来确定熔融温度。

mhc结合检定。如先前所述，使用384孔高通量检定，进行mhcii竞争结合检定(salvat等人,(2014)上述)。针对八种对偶基因进行结合检定：drb1*0101、0301、0401、0701、0801、1101、1301和1501。简单地说，将由每种mhcii对偶基因的已知肽抗原构成的100nm生物素标记的对照肽在聚丙烯384孔板中与50nm经纯化的重组mhcii蛋白质和lst或变异肽片段的连续稀释液(100μm至10nm)一起培育。使用涂布在高度结合elisa板上的构象特异性抗hla-dr抗体l243，从平衡溶液捕捉肽-mhcii复合物。使用delfia抗生蛋白链菌素-铕结合物和时间分辨的荧光(spectramaxgeminifluorescencemicroplatereader)定量结合的对照肽。

生物膜降解检定。金黄色葡萄球菌sa113在tsb中在37℃震荡下生长过夜。接着细胞在补充有5％乙醇和0.1％葡萄糖的tsb中1:100稀释并添加100μl细胞悬浮液至96孔板(costar3595)的孔中。细胞静置在37℃下过夜，无震荡，以形成生物膜。接着所得生物膜在水中洗涤三次，并用100μl中200ng酶处理75分钟。未处理孔含有含0.1％bsa的pbs。处理后，板在水中洗涤三次，并用0.1％结晶紫染色15分钟。接着板在水中再次洗涤三次，且干燥。将200μl30％乙酸添加至每个孔并在震荡下在25℃下溶解结晶紫染色15分钟。将脱色物(150μl)转移至新的96孔板并在spectramax190光谱仪(moleculardevices；sunnyvale,ca)中在550nm下测量每个孔的吸光度。

鼠类肺感染模型。使金黄色葡萄球菌菌株atcc25923的过夜lb培养物成球粒，用pbs洗涤两次，并再悬浮以得到40μlpbs中10⁸-10⁹菌落形成单位(cfu)。通过输入细菌悬浮液在lb琼脂(difco)上连续稀释，确定实际接种物，接着在37℃下培育24小时。成年雌性c57bl/6j小鼠(8至12周龄；jacksonlaboratories,detroit,mi)暂时用异氟烷麻醉并经由口咽吸气，接种40μl细菌悬浮液。感染后1小时，第二次40μlpbs接种，含有2.5μg野生型lst、2.5μg变异体柔性5、2.5μg变异体柔性9或空白对照。感染后24小时，处死小鼠，且切除肺，置于1ml冷pbs中并均质化。通过将连续稀释液涂铺至lb琼脂上，接着在37℃下培育24小时来确定肺匀浆中活细菌数。

humi鼠类免疫原性研究。通过如所述，手术移植人类骨髓、肝和胸腺组织至nod/scid/γc^-/-小鼠(dartmouthtransgenics&geneticconstructssharedresource)，来构筑humi小鼠(brainard等人,(2009)j.virol.83:7305-21)。从相同人类供体人类化所有动物。实验使用的小鼠具有至少其总外周血白血球25％的人类淋巴细胞。移植后十四周，将12只雌性humi小鼠分成3组，每组4只，并通过单次50μl皮下注射完全弗氏佐剂(completefreund’sadjuvant，cfa)中的100μg野生型lst、100μg变异体柔性5或100μg变异体柔性9来接种。免疫接种后两周，处死小鼠并针对每个组，收获脾细胞且汇集。汇集的脾细胞(5×10⁵个/孔)用含有5％胎牛血清、l-谷氨酰胺、抗生素和最终浓度为10μg/mllst或变异体(或1％dmso作为对照)的培养基一式三份涂铺至96孔板中。培育72小时后，孔用1μci[³h]胸苷(dupontnen,boston,mass.)进行脉冲，且6小时后收获至unifilter96孔gf/c板上，以通过闪烁计数(packardmicrosantnxt计数器)评估胸苷并入。

转基因dr4鼠类免疫原性研究。将12只雌性6-8周龄dr4转基因小鼠(abb剔除/转基因hla-dr4；b6.129s2-h2-ab1tm1grutg(hla-dra/h2-ea,hla-drb1*0401/h2-eb)1kito；taconicfarms,germantown,ny)分成四组，每组三只，并通过50μl野生型lst的皮下注射液使用以下四个方案之一进行免疫接种：(i)初始用cfa中100μg酶免疫接种，接着在第14天和第28天加打不完全弗氏佐剂(incompletefreund’sadjuvant，ifa)中100μg；(ii)初始用cfa中20μg酶免疫接种，接着在第14天和第28天加打ifa中20μg；(iii)初始用pbs缓冲液中100μg酶免疫接种，接着在第7天、第14天、第21天和第28天加打pbs缓冲液中100μg；(iv)初始用pbs缓冲液中20μg酶免疫接种，接着在第7天、第14天、第21天和第28天加打pbs缓冲液中20μg。在第13天、第20天、第27天、第34天和第62天测量针对野生型lst的血清igg抗体滴度。最后加打后五周，所有12只小鼠展现1:40血清稀释下同等的最大elisa信号且所有信号都在1:160稀释下的20％内。小鼠无进一步操纵下圈养，直至研究第23周，此时再次测量血清igg抗体滴度且小鼠被分成具有同等平均抗体滴度的两个实验组。注意在第9周至第23周恢复时期期间，两只小鼠(最低滴度100μg无佐剂和一个高滴度100μg佐剂)开始经历掉发、重量减轻和活动性降低并根据iacuc批准方案处死。在第24周，一组用ifa中100μg野生型lst再攻击，且另一组用ifc中100μg变异体柔性5攻击。在第26周，处死小鼠并针对每个组，收获脾细胞且汇集。如上所述进行增殖检定。

生物信息分析。使用clustalw进行溶葡萄球菌酶和其同源序列ale-1和lytm的序列比对。

表位预测

asn125gln突变体的溶葡萄球菌酶催化结构域的epimatrix分析(zhao等人,(2014)上述)展示该结构域具有许多预测的t细胞表位，总表位评分为46。蛋白质具有14例预测最高1％结合子(评分>2.32)和32例最高5％结合子(评分>1.64)。还发现序列含有三个epibar(至少四个对偶基因具有1.64或更高的评分的肽)，其中肽¹¹⁶fqrmvnsfs¹²⁴(seqidno:88)被预测为对所有八种对偶基因具有高度免疫原性(表2)。

表2

选择最频繁的突变用于初步设计分析

episweep产生总共1,533个计划，其中81个计划被评估为在两个至八个突变的突变负荷下的帕累托最佳计划。此时，可仅仅选择一组设计，接着针对适当折叠和活性进行实验分析。然而，先前的根据基于序列的episweep产生去免疫化溶葡萄球菌酶的工作未产生活性变异体。基于结构的episweep被设计成一种交替法，其应产生更佳的结果。假定不准确的溶葡萄球菌酶代表可能引起误差，使用迭代反馈策略，其中测试15个最频繁的突变(个别)对蛋白质折叠(表达)和活性的影响。

结果(表3)展示最频繁的15个突变存在于总计划的9％-67％和帕累托最佳计划的1％-65％中。发现突变都在催化结构域的表面上。episweep不常使用隐藏的残基。实际上，隐藏的残基ser49gly和ser49ala分别占据第18和第20突变。预测参与mhc结合的氨基酸包括碱性(arg/lys)、极性不带电(ser/asn/tyr)和非极性残基(phe/leu/ile)。这些残基经非极性(gly/met)、酸性(asp/glu)、碱性(his)或极性不带电(thr/gln/tyr)氨基酸置换。

表3

预测突变显著减少肽与mhc的结合且产生更少免疫原性的变异体(表4)。在所有产生的肽中，可以看到突变命中的数目(预测肽结合的对偶基因的数目)低于野生型肽。举例来说，预测野生型qrmvnsfsq(seqidno:107)肽中位置118的arg至thr突变消去两个表位且导致跨越所有对偶基因，z评分为0。一些更多免疫原性的区域更难以处理单一突变。然而，可以观测到即使单个突变也会对降低总免疫原性评分具有有意义的影响。举例来说，ser122asp突变消去两个表位并使总命中数目从14降低至8。

表4

突变以粗体展示。

修饰溶葡萄球菌酶序列用于巴斯德毕赤氏酵母表达

最初企图在巴斯德毕赤氏酵母中制备模仿葡萄球菌溶葡萄球菌酶被缺乏蛋白质表达阻碍。因此，对基因进行修饰以在巴斯德毕赤氏酵母中表达(zhao等人,(2014)上述)。简单地说，调整野生型溶葡萄球菌酶的序列以反映巴斯德毕赤氏酵母的密码子偏爱。另外，鉴别序列中具有不相称a+t含量的长区段并加以破坏。发现基因的新型式(syn溶葡萄球菌酶)在摇瓶培养物中产生多达80mg/l的蛋白质，并在2l生物反应器中产生500mg/l(zhao等人,(2014)上述)。

随后用syn溶葡萄球菌酶进行的表达实验展示蛋白质作为sds-page中双重线迁移。怀疑所观测到的双重线归因于蛋白质n-糖基化。溶葡萄球菌酶序列的仔细检查揭露其在位置125含有糖基化序列子。n-聚糖的存在通过培养物上清液的pngase处理证实。一经处理，蛋白质即作为sds-page中单线迁移。

通过引入保守asn->gln、asn->ser和asn->asp单点突变，企图破坏asn125糖基化序列子。此分析的结果表明这些突变体展现类似的表达水平，但活性分别比野生型酶降低10、20和40倍。

在随后研究中，通过饱和突变诱发来构筑文库以确定在位置125上可以容许除asn以外的哪些其它残基且仍然允许破坏n-糖基化序列(zhao等人,(2014)上述)。文库结果和随后溶葡萄球菌酶序列与其同源物(ale-1和lytm)的比对表明asn125是保守残基，因而需要集中于使糖基化序列子的其它残基突变。因此，合成两种其它突变体ser126pro和thr127ala，且发现其成功预防n-糖基化。将这些突变体与野生型溶葡萄球菌酶相比且发现其展现同等活性。因为需要完全活性的去糖基化突变体，所以选择溶葡萄球菌酶ser126pro用于使用episweep算法进行进一步实验评估。

去糖基化溶葡萄球菌酶的episweep校正

用epimatrix和episweep分析ser126pro溶葡萄球菌酶主链，以确定表位评分并比较最频繁的突变。结果展示变成ser126pro突变体增加预测的表位评分。与asn125gln主链的表位评分46相比，ser126pro的总表位评分为50(表2)。epimatrix分析还展示ser126pro具有五个epibar(至少四个对偶基因具有1.64或更高的z评分的肽)，而asn125gln具有三个。ser126pro主链具有15例预测最高1％结合子(评分>2.32)和35例最高5％mhc结合子(评分>1.64)。肽¹¹⁶fqrmvnsfs¹²⁴(seqidno:88)与asn125gln主链中一样仍然有同等问题，且预测其对所有八种都具有高免疫原性。存在于ser126pro主链中的四个新表位被引入肽¹¹⁹mvnsfsnpt¹²⁷(seqidno:142)和¹²⁰vnsfsnpta¹²⁸(seqidno:143)(表5)。

表5

ser126pro主链的episweep分析产生总共2,333个计划，其中96个计划被评估为在两个至八个突变的突变负荷下帕累托最佳计划(与asn125gln主链比较，asn125gln主链产生总共1,533个计划，其中81个计划为帕累托最佳)。表6比较在asn125gln和ser126pro主链中发现的最频繁的突变。在变成新的主链后突变模式未显著改变。大部分的突变保持在最高15个，其中仅仅四个突变例外：分别移至位置16、18、23和24的ser122gly、ser124gly、leu83met和ile99gln。最频繁的突变arg118thr在两个主链中仍然占优势。虽然在asn125gln主链中，所有15个最频繁的突变都是表面暴露的残基，但新的主链推动隐藏残基ser49gly至最高15个。大部分的突变在总计划和最佳计划中类似地代表，其中例外为ser124gly，其从存在于72％计划中变成不存在于用ser126pro主链选择的任何最佳计划中。最频繁的15个突变(根据asn125gln主链评估)存在于使用ser126pro主链产生的总计划的2％-82％和帕累托最佳计划的0％-88％中。

表6

仍然预测基于asn125gln主链的15个突变显著地降低残基与mhcii的结合且在ser126pro主链中产生更少免疫原性的变异体(表7)。预测的缺失基本上类似于由asn125gln得到的缺失。asn125gln下总突变体命中率为35(ser126pro下为40)，且野生型命中率为84(ser126pro下为88)，因此两个主链靶向约相同数目的表位。

观测到的一个显著差异是arg118thr突变，其在asn125gln主链中消去两个表位，在ser126pro主链中未消去任何表位。然而，更仔细的检查展示arg118thr帮助其它突变消去更多表位。举例来说，当arg118thr与ser122asp组合时，两个突变消去总共13个表位。因而，进一步的研究不排除arg118thr突变。然而，排除ser122gly突变，因为其靶向与ser122asp相同的残基，但仅仅消去三个表位(与预测ser122asp去除10个相对比)。

表7

突变以粗体展示。

溶葡萄球菌酶变异体的表达水平和活性

即使算法集中在仅仅催化结构域的去免疫化上，也要注意在全长成熟蛋白质的情况下测试单点突变体以确保适当的蛋白质折叠。因为溶葡萄球菌酶分泌至培养基中，所以认为从培养上清液简单分析溶葡萄球菌酶活性足够评估单点突变对蛋白质的作用。

溶葡萄球菌酶单点突变体的分析揭露所有变异体都在巴斯德毕赤氏酵母中表达。因此，最频繁的episweep突变中无一个消除表达。具有最低表达水平的两种突变是arg118thr和ser124tyr，分别是野生型表达水平的47％和35％。此外，13个溶葡萄球菌酶变异体之活性等于或者超过野生型酶。点突变体phe38gly是活性低于野生型(69％)的两种突变之一。具有低活性的第二突变是ser124tyr，具有野生型活性的16％。因为phe38gly和ser124tyr未满足超过野生型活性70％的阈值活性水平，所以没有酶包括在进一步研究中。虽然arg118thr突变的表达水平少于野生型酶的50％，但考虑到此突变所去除的表位数目，进一步分析此酶。

主链柔性调整

使用episweep获得的所有设计都采用刚性主链(本文中称为“刚性”主链设计)。然而，因为蛋白质以其高水平柔性出名，所以设想在加工后能量最小化步骤中保持主链固定通过引起不精确的能量评估而可能有损去免疫化变异体的准确性。已经观测到完全刚性设计与在最小化期间允许侧链松驰(而主链固定)的设计在能量-表位评分概况上完全不同(parker等人,(2013)上述)。因此，为以计算允许的方式实现柔性，进行episweep设计的其它加工后能量最小化(本文中称为“柔性”主链设计)。此分析的结果展示两个主链之间存在实际上明显移动。

所选突变的episweep分析

如上所述，分析15个最频繁的突变的表达和活性。基于此分析，两个突变由于不令人满意的活性值而略去。另外，因为ser122gly靶向与ser122asp相同的残基，所以去除ser122gly，与ser122gly突变的三个表位比较，ser122asp消去10个表位。在ser126pro主链情况下最频繁的突变arg118thr未消去任何表位，且具有相对较低的表达水平。然而，因为arg118thr帮助其它突变靶向表位，所以维持arg118thr。举例来说，当arg118thr与ser122asp组合时，arg118thr突变靶向总共13个表位。结果，数据集含有12个不同的突变：ser124gly、ser122asp、asn121gly、arg118thr、ile99gln、lys95glu、tyr93his、leu83met、lys46his、ile41glu、asn13his和asn12gly。

再一次进行episweep分析，但限制算法使用仅仅12个非常容许的突变。允许突变负荷在两个至八个突变之间变化，且限制算法不在活性位点引入突变(his32、asp36、his82、his113和his115)。因为观测到ser122asp突变是极有效的表位去除子，所以限制算法在所有产生的计划中包括此突变。如前所述，算法在每个突变负荷下产生帕累托最佳计划和其它19个次最佳计划。发现最低表位评分是24，且仅仅可用含有八种突变的计划实现。最高表位评分是40，且具有此评分的计划仅仅具有强迫的ser122asp突变。

选择沿着帕累托最佳曲线的大量计划(在固定表位评分和突变负荷下具有最低可能的旋转异构体能量的设计)。episweep分析产生刚性主链计划，且选择在两个至八个突变范围内的突变负荷下总共14个帕累托最佳计划，其中表位评分在24(最低)至36范围内。因为野生型溶葡萄球菌酶主链具有50的表位评分，所以设想此范围覆盖显著去免疫化的设计。

为解决蛋白质柔性问题，还包括14个在加工后进行能量最小化的设计(柔性主链设计)。选择与刚性主链设计相同表位评分和突变负荷的设计，使得可以直接评估获得变异体的两种不同方法。举例来说，如果选择具有八个突变和表位评分为24的帕累托最佳刚性计划，那么选择相同突变负荷和表位评分的柔性主链设计。当面对若干选项时，选择最低旋转异构体能量的柔性主链设计。因为其能量最小化，所以这些设计不出现在帕累托边界上。应注意刚性与柔性主链设计之间共享两个突变计划。

合成变异体的表达水平和活性

每个溶葡萄球菌酶变异体在摇瓶培养中生长，且通过sds-page检查表达水平。对发现在培养上清液中以有意义的水平表达的计划(通过sds-page检测)进一步表征其相对特定活性。结果展示28个刚性和柔性主链计划中，仅仅11个表达。发现除刚性1外所有变异体的表达水平都低于野生型溶葡萄球菌酶。

所有计划(除柔性1外；seqidno:32)都具有低于野生型酶的活性，但仅仅两个具有低于商业大肠杆菌产生的溶葡萄球菌酶的活性。注意到在巴斯德毕赤氏酵母中产生的野生型溶葡萄球菌酶的活性与sslys之间存在显著差异。在总共11个表达计划中，六个是柔性主链设计且五个是刚性主链设计。刚性设计突变负荷在两个至六个范围内，且柔性在两个至八个范围内。

计划的活性水平随突变数目增加而降低。在柔性而非刚性主链设计中更观测到此趋势。类似地，在柔性计划中，发现表达水平随突变负荷增加而减少。在刚性主链设计中未观测到此趋势，因为无论突变负荷如何，其表达水平仍旧低。具有高表达水平的唯一刚性设计是两个突变设计刚性1，其为刚性与柔性设计之间共享(又称为柔性14)。

未表达突变体的分析

因为少于一半的合成设计以有意义的水平表达，所以分析未表达的设计的突变模式。此分析展示表达和未表达的设计共享大部分突变。例如leu83met、tyr93his和lys95glu等一些突变存在于大部分未表达的计划中，但仅仅存在于几个表达计划中。类似地，arg118thr存在于仅仅几个表达计划中，但不同于任何其它突变(排除强迫的ser122asp突变)，可以在所有未表达的计划中发现其(表8)。

表8

^e，表达。ⁿ，未表达。双线将表达与未表达的计划分开。

因为较早期的结果展示突变arg118thr具有相对较低表达水平(少于野生型50％)，所以设想大部分合成计划中观测到的表达缺乏可归因于arg118thr突变。为测试此，在所有具有此突变的计划中，使突变回复至野生型。

原始与回复计划的表征

所有表达计划进行纯化，用于活性和稳定性的进一步表征。此外，评估最初具有arg118thr突变但现在在相同位置具有野生型残基的所有设计(回复计划)。此分析的结果展示于表9中。

表9

回复计划用*指示。

总共32个计划(原始和回复)中，发现28个表达。28个良好表达的计划进行纯化并针对其活性和稳定性表征。在初步分析期间，发现刚性3和刚性14在培养上清液中微弱表达。刚性8和12的回复型式未显著地提高表达。此四个计划可能由于存在除arg118thr外的其它突变而具有低表达水平，但未能发现明显突变模式。发现arg118thr突变变回野生型序列的所有其它计划良好表达。因而，arg118thr突变似乎影响大部分计划的表达。

结果展示与野生型酶相比，变异体具有高水平的活性和稳定性。活性值表达为野生型活性％，且在92％(刚性13*)至36％(柔性4*)范围内。观测到的mic值接近野生型，最高为0.25μg/ml(柔性3*、柔性7*和刚性4*)。tm值还类似于在野生型酶中观测到的值，其中最低tm展示稳定性下降12.3℃(刚性13，表9)。

此分析表明突变负荷增加引起变异体的活性/tm值下降和mic值增加。平均下来，与柔性设计相比，刚性设计具有更高特定活性和更低mic值。然而，柔性设计的总稳定性比刚性设计好，如平均tm值更高所证明。基于双尾t检验的结果，在两个设计组之间观测到的差异是统计上显著的(p值<0.03)。

设计被分成七个不同组(表10)，用于进一步表征。使用来自表9的数据，计算每个设计组的柔性/刚性能量、突变负荷、活性和稳定性之间的皮尔逊相关系数(pearsoncorrelationcoefficient)。

表10

nm，突变数目；act.，活性；fe，柔性能量；re，刚性能量。

当一起考虑时，所有28个设计都展示突变数目与mic值之间的弱正相关(表10，所有设计)。因此，因为变异体的突变负荷增加，所以其活性降低(mic值增加)。发现在回复的刚性和所有刚性计划中突变数目与mic之间的正相关更强。

当所有计划一起分析时不明显的其它相关性在分别评估设计时变得显而易见。举例来说，观测到在原始柔性计划、回复的刚性计划和所有刚性计划中突变负荷与活性之间存在强的负相关。还发现柔性原始、柔性回复和所有柔性计划中突变数目与tm值之间发现强的负相关。

总体上，当一起考虑所有设计时，未在能量与活性/稳定性项之间观测到强相关。唯一观测到的有意义的相关性是柔性能量与tm之间的弱负相关(表10，所有设计)。观测到的柔性能量与活性项之间的相关性具有与预期相反的符号。另一方面，刚性能量与活性之间的相关性不显著，而刚性能量与tm之间的相关性具有不正确的符号。因此，为进一步检查能量是否是一种可靠的预测工具，评估能量组分与实验测定的活性和稳定性值之间的相关性。

即使柔性和刚性能量不是活性的重要预测因子，也发现可以使用由溶剂相互作用产生的能量代之(表11)。如针对功能预测因子所预期，溶剂能量与活性具有负(不过弱)相关，且与mic值更强正相关。

表11

综合来说，这些结果表明柔性主链能量为相对优良的稳定性预测工具，而由溶剂相互作用产生的能量似乎为使用mic检定观测到的实验活性的最佳预测因子。

表征溶葡萄球菌酶变异体的免疫反应性

野生型溶葡萄球菌酶催化结构域中的预测表位广泛分布在溶葡萄球菌酶序列中，但大部分表位可以分成五个簇(图2)。预测大部分的表位具有大量结合事件。

为了评估变异体的相对免疫原性，设计总共26个跨越溶葡萄球菌酶催化结构域的序列的合成肽。具体地说，集中在图2中所示的五个免疫原性簇。对于所列出的每个簇，设计野生型肽和对应的突变肽。突变肽含有计划中出现的单个突变与突变组合。

在合成肽的情况下，评估每个突变消除表位的预测潜能。在簇2(⁴⁵vkaissgki⁵³，seqidno:97)、簇3(⁸⁰wmhlskynv⁸⁸，seqidno:147)和簇5(¹¹⁶fqrmvnsfs¹²⁴，seqidno:88；¹¹⁹mvnsfsnpt¹²⁷，seqidno:142；和¹²⁰vnsfsnpta¹²⁸，seqidno:143)中发现epibars(在epimatrix免疫原性量表上至少四个对偶基因具有1.64或更高的z评分的肽)。

在高通量mhcii结合检定中实验评估每种肽与八种mhcii对偶基因的结合潜能。episweep产生的突变一般减轻肽与mhc的结合。168个逐对比较中，在73个情况下突变降低结合亲和力，在60个情况下没有影响，且在35个情况下增加结合。如果观测到ic50值小于0.1μm，那么肽分类为强结合子，如果ic50值在0.1-1μm范围内，那么为中度结合子，且如果ic50值在1-10μm范围内，那么为弱结合子。所有超过10μm的肽都视为非结合子。

使用10μm截止值将结合子与非结合子分离，将epimatrix预测(在5％阈值下)与mhcii结合结果相比。计算真阳性(准确预测的结合子)、真阴性(准确预测的非结合子)、假阳性(不正确预测的结合子)和假阴性(不正确预测的非结合子)的百分比。结果表明总预测成功率为70％，结果稍微低于先前公布的研究，先前公布的研究指出预测率为约76％(groot等人,(2011)immunomeres.7:2-7；moise等人,(2013)humm.vaccin.immunother.9:2060-2068)。对偶基因特定的检查揭露了对于drb1*0101、0301、0401和0701，预测在先前观测的范围内。未能发现0801的数据。观测到对于1301，大部分肽登记为弱或非结合子。此观测将表明用于1301的测试肽可能为真实强结合子，因而将数据移向较小预测成功率。类似地，1101和1501的预测率低于先前报导且也认为促成较低总预测率。

预测簇1野生型(c1wt)表位结合八种测试的mhcii对偶基因中的四者。根据预测，asn12gly与asn13his突变破坏mhcii结合。asn13his突变更佳地去除drb1*0801和1101表位，且突变同样利于去除drb1*1501表位。然而，突变还引起drb1*0101(asn12gly)的强结合，且引起drb1*1301(asn13his)的弱结合(表12)。

表12

¹saqwlnnykkgygyg(seqidno:148)。²saqwlgnykkgygyg(seqidno:221)。³saqwlnhykkgygyg(seqidno:222)。^*预测结合子与实验观测到的结合子之间的正相关。预测的结合阈值设定为5％，且实验为10μm。

在簇2野生型(c2wt)表位情况下，预测七种mhcii对偶基因的结合，其中drb1*0101、0301、0401、0701和1501为多个表位(表13)。预测突变靶向除drb1*0101和0701外的七种对偶基因，且对于另三种对偶基因(除0401之外)，观测到结合增加。一种例外为lys46his突变体，其展示与0101的结合下降两倍。lys46his也降低与1101的结合，而ile41glu和ile41glu/lys46his引起强结合。如所预测，所有突变体对0301都具有较低亲和力。ile41glu和lys46his展示降低的与1501的结合，而ile41glu/lys46his显现为强结合子。此突变组合尤其不好，因为其引起除0301外的所有对偶基因的结合增加。此簇的高结合亲和力可以通过大量表位说明。总共13个跨越八个对偶基因的表位中，预测突变破坏仅仅四个表位。此外，此具体区域含有epibar，且先前的研究展示这些表位往往比不具有epibar的表位更具免疫原性(groot等人,(2011)上述)。

表13

¹gvdffmnigtpvkaissgkiv(seqidno:223)。²gvdffmnegtpvkaissgkiv(seqidno:224)。³gvdffmnigtpvhaissgkiv(seqidno:225)。⁴gvdffmnegtpvhaissgkiv(seqidno:226)。^*预测结合子与实验观测到的结合子之间的正相关。预测的结合阈值设定为5％，且实验为10μm。

簇3野生型(c3wt)表位是drb1*0101、0701和1101的预测结合子，其中0801和1501为多个表位(表14)。实验展示c3wt也微弱地结合1301。预期leu83met突变仅仅破坏0801和1501中的结合。按照所述预测，发现0801的结合下降大约五倍。然而，还观测到0701下降超过两倍(强至中度)、1101降低十倍和0101下降约2000倍(强至弱)。检测到1501(预测其相反者)、1301和0301的结合增加。对于1501，观测到从弱移至中度结合子，而1301仍然是弱结合子，且0301为非结合子。因此，leu83met突变基本上是有成效的，因为其降低与四个对偶基因的结合且不引起两个其它对偶基因分类的改变(肽仍然是弱或非结合子)。

表14

¹gvhrqwymhlskynvkvgd(seqidno:149)。²gvhrqwymhmskynvkvgd(seqidno:150)。^*预测结合子与实验观测到的结合子之间的正相关。预测的结合阈值设定为5％，且实验为10μm。

预测簇4野生型(c4wt)表位结合八种测试的mhcii对偶基因中的三个：drb1*0101、0401和0801。除0101和0401外，观测到0301(弱)、1101(强)、1301(弱)和1501(强)的结合，但未观测到0801的结合(表15)。根据预测，突变破坏mhcii结合。一种例外是突变lys95glu，预测其减少与0101和0801的结合，而代之以跨越所有八种对偶基因的更强结合(或仍然为强结合子)。突变显著地降低与0101的结合：tyr93his、ile99gln和tyr93his/lys95glu/ile99gln使强结合子转变成弱或非结合子，且tyr93his/lys95glu使强结合子转成中度结合子。所有突变和其组合使0301的结合从弱降低至非结合子。类似地，除了tyr93his/ile99gln的所有突变都引起与1101的结合显著降低(强至弱/非结合子)，且除tyr93his/lys95glu外的所有突变体都减轻与1301的结合。最后，仅仅ile99gln和tyr93his/lys95glu/ile99gln消除与1501的结合(强至弱/非结合子)。突变ile99gln、tyr93his/ile99gln和tyr93his/lys95glu通过使非结合子c4wt转成弱结合子而略微增加对0701的结合亲和力。总体来说，tyr93his、ile99gln、tyr93his/lys95glu、lys95glu/ile99gln和tyr93his/lys95glu/ile99gln是跨越所有八种对偶基因最有成效的。tyr93his/lys95glu/ile99gln尤其优良，因为其消除与所有八种对偶基因的结合。

表15

¹dyvkagqiigwsgstgy(seqidno:151)。²dhvkagqiigwsgstgy(seqidno:152).³dyveagqiigwsgstgy(seqidno:153)。⁴dyvkagqqigwsgstgy(seqidno:154)。⁵dhvkagqqigwsgstgy(seqidno:155)。⁶dhveagqiigwsgstgy(seqidno:156)。⁷dyveagqqigwsgstgy(seqidno:157)。⁸dhveagqqigwsgstgy(seqidno:158)。^*预测结合子与实验观测到的结合子之间的正相关。预测的结合阈值设定为5％，且实验为10μm。

预测簇5野生型(c5wt)表位结合所有八种对偶基因，其中除drb1*0301和0801外都是多个表位。除0301和1301外都在实验上观测到结合，其中0701和0801测量为弱结合子(表16)。最去免疫化突变是arg118thr/ser122asp/ser124gly和asn121gly/ser122asp/ser124gly，因为其每一个显著地降低对六个对偶基因的结合亲和力。对于0301对偶基因，突变体的ic50值略微降低，但肽仍然为非结合子。此结果与episweep预测一致，其中突变破坏对所有八种对偶基因的结合。asn121gly减弱与四种对偶基因的结合，而ser124gly和asn121gly/ser122asp降低与三种对偶基因的结合。asn121gly/ser122asp还略微增加与0301的结合(非结合子至弱结合子)。类似地，arg118thr和r118t/s122d减轻对两种对偶基因的亲和力，但展示与0301的结合增加(非结合子至弱结合子)。在突变组合中观测到的对0301对偶基因的结合亲和力可以通过预测ser122asp引入对偶基因的一个表位的事实说明。事实上，可以观测到ser122asp将非结合子肽c5wt变成中度结合子。

表16

¹hlhfqrmvnsfsnptaq(seqidno:159)。²hlhfqtmvnsfsnptaq(seqidno:160)。³hlhfqrmvgsfsnptaq(seqidno:161)。⁴hlhfqrmvndfsnptaq(seqidno:162)。⁵hlhfqrmvnsfgnptaq(seqidno:163)。⁶hlhfqtmvndfsnptaq(seqidno:164)。⁷hlhfqtmvndfgnptaq(seqidno:165)。⁸hlhfqrmvgdfsnptaq(seqidno:166)。⁹hlhfqrmvgdfgnptaq(seqidno:167)。^*预测结合子与实验观测到的结合子之间的正相关。预测的结合阈值设定为5％，且实验为10μm。

为比较全长设计之间的免疫原性，计算每个设计的合计表位评分(图3)。此分析展示野生型溶葡萄球菌酶催化结构域具有总共26个结合相互作用(或表位)：14个强、1个中度和11个弱。此酶还具有14个非结合相互作用。相比之下，18个设计具有低于野生型的表位评分，六个具有相同评分，且仅仅四个具有超过野生型的表位评分(按两个表位的最大值)。除三个设计外的所有设计还具有比野生型更高数目的非结合相互作用。表位的最小数目是18，且其存在于三个变异体中：柔性4*(5个突变)、柔性11*(7个突变)和柔性13*(6个突变)。此外，与野生型相比，18个设计展示强结合子的数目减少。

注意到突变数目与实验观测到的强结合子之间强负相关(皮尔森系数-0.69)。类似地，观测到表位评分与强结合子数目之间正相关(皮尔森系数0.52)。同时，发现突变负荷/表位评分与结合子总数之间无相关。此结果表明算法不仅降低结合，还主要靶向强表位。

一般说来，与刚性主链设计相比，在柔性中发现更去免疫化的计划。平均下来，与刚性计划相比，在柔性发现更少的强、中度、弱和总结合相互作用。此趋势可以通过大部分刚性设计回复和错过一个突变的事实部分说明。在柔性11*和刚性5*中观测到最低数目的强结合子。如所预期，最侵袭性计划柔性9展示免疫原性显著下降，其中总共仅仅22个结合相互作用：9个强、6个中度和7个弱。

柔性5和柔性9变异体的体外分析

变异体柔性5和柔性9在生物复制品中表达、纯化和表征。作为另一对照，从商业供应商获得野生型lst并同时分析。两种变异体的表观熔融温度与在初步测试期间获得的数值一致，但在更精密的分析时发现其细菌溶解的特定速率稍微更高(表17)。重要地，在两种检定中，去免疫化变异体等同于或优于商业来源lst。酶的抗菌活性通过评估对金黄色葡萄球菌的四个菌株的最小抑制浓度(mic)进一步定量。菌株sa113的柔性5mic等同于野生型和商业lst，且其在三个临床分离株的单一2倍连续稀释液内，包括mrsa菌株3425-3。变异体柔性9还保留优良的杀菌/抑菌作用，预防所有四个菌株的副产物在200ng/ml(约7nm)或更少下。考虑到lstcat变异体分别编码四个或八个突变的事实，其高水平的抗葡萄球菌活性是惊人的。

表17

*误差是与一式三份测量的生物复制品中最小值的标准偏差

柔性5和柔性9变异体的体内功效和免疫原性

为以更临床相关的方式评估抗菌活性，采用鼠类肺感染模型，其使用金黄色葡萄球菌临床分离株。经由口咽吸气，小鼠感染活细菌，且一小时后，其经由相同的途径用含有2.5μg野生型lst、变异体柔性5或变异体柔性9的溶液处理。感染后二十四小时，处死小鼠，收获肺，且通过涂铺肺匀浆的连续稀释液，确定活细菌数。所有三种酶相对于生理盐水缓冲液对照，使得细菌负荷减少统计上显著10倍(单向anovap＝0.007，图基事后检验(tukeyposttest))，但三个处理之间没有显著差异(图4a)。因此，去免疫化候选酶在感染和发炎肺环境中保留野生型功效。

使用已通过手术用人类免疫细胞、肝组织和胸腺组织(humi小鼠)人类化的nod/scid/γc^-/-小鼠，评估体内免疫原性。在六周龄移植人类组织后，使humi小鼠成熟且形成人类b和t细胞的循环谱系。在移植后14周，小鼠被分成三组，每组四只，且皮下免疫接种含100μg野生型lst、柔性5或柔性9的佐剂。免疫接种后十三天，对各组，处死小鼠，收获脾细胞，且汇集，且汇集的细胞用其同源蛋白质离体再刺激。通过在72小时氚化胸腺嘧啶吸收测量细胞增殖。虽然刺激指数(蛋白质对比dmso增殖反应)是野生型lst的2倍不到(图4b)，但注意到公认来自人类化小鼠的t细胞展现削弱的功能。具体地说，已经展示人类化小鼠脾细胞展现差的离体增殖反应，甚至是在例如植物血球凝集素、伊屋诺霉素-pma和抗cd3/抗cd28抗体混合液等有效刺激剂存在下(watanabe等人,(2009)internatl.immunol.21:843-858)。此外，在两次至三次体内免疫接种含有效抗原钥孔血蓝素的完全弗氏佐剂(completefreund’sadjuvant，cfa)后，再刺激的人类化小鼠脾细胞未能产生ifn-γ或il-4(watanabe等人,(2009)internatl.immunol.21:843-858)且仅仅展现2至6倍离体刺激指数(tonomura等人,(2008)blood111:4293-6)。因此，野生型lst脾细胞的显著(p＝0.0005，双向anova)1.6倍刺激指数是抗原特异性免疫反应的合理标记，尤其在当前研究的小鼠接受仅仅一个免疫接种的事实。相对于野生型免疫接种组，从柔性5和柔性9免疫接种小鼠汇集的脾细胞展现显著降低的增殖(图4b)。背景减去后，柔性5汇集细胞展示50％降低反应且柔性9汇集细胞展示65％降低反应。

除未处理免疫系统的情况下固有免疫原性外，还考虑去免疫化蛋白质可逃避针对天然序列已建立的记忆反应的程度。由于此类研究的长时限和humi小鼠的短寿命，故评估转基因dr4小鼠中的记忆反应。此同型结合菌株具有完整的鼠类免疫系统，其中例外为其具有基于来自人类hladra和drb1*0401的肽结合结构域的嵌合类别iimhc(ito等人,(1996)j.exp.med.183:2635-44)。此稳定的转基因模型具有正常的能够进行长期研究的健康寿命，然而其抗原呈递细胞展现人类肽结合特异性。十只dr4小鼠通过皮下注射野生型lst而免疫接种和重复加打。最后加打后十九周，其被分成两组，每组五只，使得每组展现类似的平均抗体滴度。接着用100μg野生型lst或者100μg变异体柔性5再攻击小鼠。十三天后，对各组，收获脾细胞，汇集，并用来自最终再攻击的同源蛋白质离体再刺激。类似于humi小鼠中的结果，用野生型lst离体再刺激dr4脾细胞产生1.8倍刺激指数(图4c)。注意到dr2、dr3和dq8转基因小鼠中类似小的刺激指数展示与抗原特异性抗体产生有关且指示抗原特异性免疫反应(depil等人,(2006)vaccine24:2225-9)。因此，此处看到的显著(p＝0.0002，双向anova)1.8倍刺激指数是抗药物免疫反应的合理标记。与野生型lst再攻击小鼠相比，来自柔性5攻击组的汇集脾细胞的增殖处于或低于背景水平(图4c)。因此，初打的识别野生型lst的免疫细胞在用柔性5再攻击后展现降低活性，表明去免疫化变异体有效逃避针对野生型酶的记忆反应。

实施例2:针对hla对偶基因drb1＊0401的溶葡萄球菌酶催化和细胞壁结合结构域的去免疫化

概述

进行此分析以证明lst中假定t细胞表位的消除将减轻抗药物抗体反应并因此增强治疗功效。使用两个不同的通过计算引导的策略发展表位消除的变异体：个别去免疫化变异体的基于结构的设计，接着凭经验改善(称为“opt”变异体)；和基于结构的设计并筛选富集了功能上去免疫化的成员的组合文库(称为“lib”变异体)。人类化hla转基因小鼠用以评估每种方法消除假定免疫原性表位并由此预防抗lst抗体在体内形成的效率。随后，复发性菌血症模型用以计量lst去免疫化清除全身性金黄色葡萄球菌感染能够达到的程度。去免疫化变异体与其野生型对应物之间的此系统比较提供了假定t细胞表位、体内免疫原性和治疗功效之间的临床相关联系的直接实验证据。

作为概念证明，集中于对偶基因drb1×0401(此后为dr4)，其在北美和欧洲人口中高度流行。在5％阈值(即最高5％预测结合子中的肽)下，propred分析工具(singh和raghava(2001)bioinformatics17:1236-7)预测野生型lst内16个dr4限制的t细胞表位(lst^wt表位评分＝16)。肽表位排列成重叠簇与分离的九聚体，分布在蛋白质序列和结构中(图5)。有趣地，propred预测dr4比七个其它代表性drb1对偶基因任一个更多的表位：0101、0301、0701、0801、1101、1301和1501。考虑任何单个对偶基因，因此dr4模型代表总蛋白质重新设计的高目标。

材料与方法

材料.引物用标准脱盐，从idttechnologies(coralville,ia)订购。用于分子克隆的限制酶和phusiondna聚合酶购自newenglandbiolabs(ipswich,ma)。除非特别指示，否则所有其它试剂和供应品都来自vwrscientific(philadelphia,pa)。

巴斯德毕赤氏酵母表达载体ppic9和巴斯德毕赤氏酵母菌株gs115(his4)购自invitrogen(grandisland,ny)。大肠杆菌dh5[f-φ80laczδm15δ(laczya-argf)u169reca1enda1hsdr17(rk-,mk+)phoasupe44λ-thi-1gyra96rela1]、金黄色葡萄球菌菌株sa113和mrsa菌株usa400来自美国典型菌种保藏中心(manassas,va)。

lst同源性模型.因为溶葡萄球菌酶的晶体结构不可获得，所以构筑两个结构域的同源性模型。选择来自lytm的三个模板结构用于催化结构域(2b0p:a、2b44:a和1qwy:a)(firczuk等人,(2005)j.mol.biol.354:578-90；odintsov等人,(2004)j.mol.biol.335:775-85)。三个模板结构共享显著序列一致性(95％-97％)，但其在保守活性位点周围具有高度可移动的环(firczuk等人,(2005)j.mol.biol.354:578-90)。针对溶葡萄球菌酶催化结构域的最高序列一致性是46.7％，其足够建立质量模型结构(baker和andrej(2001)science294:93-96)。使用modeller建立初始同源性模型。使用环模型化方法fread(choi和deane(2010)proteins78:1431-1440)，将次模板区域(²⁴plgingg³⁰；seqidno:168)模型化，其从1gmn:a(¹⁸⁰prgeegg¹⁸⁶；seqidno:169)选择序列类似环(lietha等人,(2001)emboj.20:5543-5555)。使用具有高度序列一致性(83.5％)的单一模板结构(1r77:a，ale-1的靶向细胞壁的结构域结构，溶葡萄球菌酶同源物)构筑细胞壁结合结构域(lu等人,(2006)j.biol.chem.281:549-558)。根据dope统计势函数评分选择最佳模型(shen和sali(2006)proteinsci.15:2507-2524)。催化结构域模型针对amber99sb与gb/sa减到最少，以使预测环松驰(hornak等人,(2006)proteins65:712-725；still等人,(1990)j.am.chem.soc.112:6127-6129)。

突变选择的预处理.对于每个结构域，针对非冗余数据库，进行三次迭代psi-blast(altschul等人,(1997)nucleicacidsres.25:3389-3402)以找到同源物。针对所鉴别的序列，构筑多重序列比对，并加工以鉴别不过多间隙(至多25％)且足够类似于lst(至少35％)但足够彼此不同(至多90％一致)的序列。剩余一组114个代表性催化结构域同源物和23个代表性细胞壁结构域序列。在每个多重序列比对中鉴别每个位置的氨基酸，并随后用作设计的可能突变。视为功能上重要的具体位置和突变不允许突变(位置32、36、82、113、115、117、118、119、125、126、127锁住；不允许特异性突变y33t、f38a、f38g、m39a、i41r、s124y和r118t)。第二过滤步骤仅仅保持预测消去至少一个表位的那些突变，如使用propred在5％阈值下所确定。为避免所推测的不利作用，还排除脯氨酸和半胱氨酸的突变。

扩大突变选择用于文库设计，因为筛选使得取代更危险。具体地说，chou-fasman(chou和fasman(1974)biochem.13:222-45)倾向用以根据1.5的严格阈值，鉴别可能在野生型二级结构环境中可接受的残基。另外，因为文库用可并有超过所需氨基酸的其它氨基酸的简并寡核苷酸构筑，所以允许这些添加，只要简并寡核苷酸内需要与不需要的比率保持超过2:3即可。

个别变异体的基于结构的设计.为产生消去表位的设计，基于结构的去免疫化方法episweep应用于每个结构域，如实施例1中所描述。osprey(2.0版)(chen等人,(2009)proc.natl.acad.sci.usa106:7678-7678)用以针对突变选择，根据amber力场(pearlman等人,(1995)comput.phys.commun.91:1-41)和参考能量(lippow和tidor(2007)curr.opin.biotechnol.18:305-311)，评估可能旋转异构体的一体和二体能量项(lovell等人,(2000)proteins40:389-408)。在5％阈值下propred(singh和raghava(2001)bioinformatics17:1236-7)用以评估dr4表位(hla对偶基因drb1*0401)含量，表征每个九聚体为结合子或者非结合子。发现消去催化结构域中所有预测的dr4表位需要至少七个突变；完全消去细胞壁结合结构域需要六个。经由episweep最佳化算法，针对各结构域，鉴别一组20个能量最佳和接近最佳的完全消去设计。能量最佳的催化结构域设计在ser124含有突变，所述分析已鉴别为可能不利。然而，预测替代双重突变asn121gly和ser122gly去除相同的表位，然而此两个突变显现比lst^wt高的实验确定活性。能量最佳的设计(含有不利的ser124突变)与替代双重突变设计之间的能量差很微小(-294.94和-293.9)。因此，选择一种设计(opt1)，以具有对于细胞壁结合结构域和催化结构域的c端部分中替代双重突变来说能量最佳的设计(asn121gly和ser122gly)。

去免疫化文库的基于结构的设计.为设计富集稳定的去免疫化变异体的组合文库，发展一种称为episocom的方法，其加强了具有表位分析的socom基于结构的文库设计方法，并采用基于扫描的帕累托最佳化算法(parker等人,(2013)j.comput.biol.20:152-65)以同时最佳化能量与表位含量。考虑到突变所在的一组可能位置和在那些位置并入的可能氨基酸，连同所需文库尺寸，episocom选择位置子集和那些位置的取代子集。由此，其指定了构筑由取代和对应野生型残基的所有组合构成的文库。episocom将文库针对其构成变异体上平均能量评分和平均表位评分最佳化，使得一般说来变异体将“优良”。其帕累托最佳化算法鉴别所有文库设计(位置和取代)，使得两个评分之间均衡，因为对于两者来说，没有更佳的其它文库设计。

为了在没有每个变异体的明确旋转异构体模型化下能够快速评估基于结构的能量，socom采用集团展开法(grigoryan等人,(2009)nature458:859-64；grigoryan等人,(2006)ploscomput.biol.2:e63)(ce)技术，其根据氨基酸序列的蛋白质特定功能表现基于结构的特性。此处，rosetta(rohl等人,(2004)methodsenzymol.383:66-93)用于预处理步骤中以基于所允许的突变选择模拟随机lst变异体和评估随机lst变异体的能量。这些结构训练组允许ce经由在位置特异性的一体和二体序列势上求和来表达可能lst变异体s的能量ψ：

其中和涉及位置i的氨基酸ai和位置j的aj。总共9000个催化结构域和6000个细胞壁结合结构域模型用以按照ce准则训练ce模型。接着这些能够在不相重叠的测试背景(尺寸为训练组的约20％)下准确预测新的随机变异体的能量，实现催化结构域的ce序列势与rosetta能量之间0.8的相关性，和细胞壁结合结构域0.9的相关性。因此，此模型化步骤能够快速准确地预测设计最佳化“内环”内的能量。

为了在不计数所有其变异体下(当在可能文库的大规模设计空间上最佳化时不易处理)评估文库，socom采用文库平均的位置特异性评分。举例来说，如果组{arg,lys}将并入一个位置，那么在文库所有变异体上求平均值的该位置的能量贡献将为arg能量和lys能量的平均值；类似地，在文库上求平均值的来自该位置的逐对贡献和另一并入{asp,glu}将为arg:asp、arg:glu、lys:asp和lys:glu的平均值。因此，假定所允许的突变，socom预先计算在位置i可以选择的氨基酸的可能子集的平均能量贡献；以及一对位置i和j的平均值。其接着利用类似于单一变异体的等式，评估整个文库t上平均能量

其中和涉及位置i的氨基酸ti和位置j的tj的集合。因此，在最佳化内评估文库与评估单一变异体一样有效。

为了形成episocom，还需要以类似于socom处理能量评分的方式，将表位评分“提高”至文库平均的贡献。如果氨基酸{ti,ti+1,…,ti+8}将并入以i开始的连续九个位置，那么氨基酸的多个九聚体组合的平均表位评分贡献计算为：

其中和是在氨基酸的每个组合上，一个来自每个集合，且函数e(·)给出九聚体的表位评分。接着文库的平均表位评分^ξ仅仅是所有九聚体的和：

socom使用整数线性规划公式来选择位置最佳集合和氨基酸集合以最佳化受文库尺寸约束影响的方程式2。在episocom下，存在两个目标，能量(方程式2)和表位评分(方程式4)。因为没有确定这些不相称特性之间最佳平衡的先验方式，所以episocom产生代表最佳平衡的所有帕累托最佳设计，从而能够随后表征折衷方案和选择适合的设计。为了鉴别帕累托最佳设计，其采用基于episweep的扫描算法。在扫描中的每个步骤，根据平均表位评分(方程式4)上的约束最佳化平均文库能量(方程式2)。连续收紧约束，使得每个文库必须具有比先前一个更佳的表位评分(且因此能量更差)。帕累托最佳化被执行为socom的约束型式上的迭代层，其又使用ibmcplex整数规划解算机来最佳化每个设计。

蛋白质表达、纯化和表征.lst和其衍生物从巴斯德毕赤氏酵母分泌。简单地说，将重组毕赤氏酵母属菌株在2.5l生物反应器(appliconbiotechnology)中培养，且通过聚乙二醇-6000(peg-6000)沉淀从上清液捕捉蛋白质并通过spsepharosef.f.阳离子交换色谱法纯化到均质。通过triton-x114提取从蛋白质制剂去除内毒素(liu等人,(1997)clin.biochem.30:455-63)。通过sds-page凝胶的密度测定分析，估计蛋白质表达水平。蛋白质的活性通过确定针对金黄色葡萄球菌菌株sa113的最小抑制浓度(mic)来评估，并报导为相对于针对lst^wt确定的mic稀释的标准化百分比(即50％活性相对于野生型mic高2倍，且25％活性是相对于野生型mic高4倍)。

文库构筑和筛选.通过剪接重叠pcr与表18中所示的引物，构筑lst文库。

表18

将pcr产物接合到ppic9载体中且转化到dh5a中。构筑体经序列验证，并通过电穿孔转化到巴斯德毕赤氏酵母中(wu和letchworth(2004)biotechniques36:152-4)。文库构筑和筛选如迭代定向进化策略执行。使用中等通量板晕环形成检定，鉴别活性文库成员。简单地说，来自每轮文库构筑的巴斯德毕赤氏酵母转化体在ypm琼脂培养基(1％酵母提取物、2％胨、1％甲醇、1％琼脂糖)上传播并在30℃下培育2天。指示顶部琼脂糖(0.5％酵母提取物、1％胨、1％nacl、0.1od600sa113、1％低熔琼脂糖)倾倒在ypm酵母板上，并在37℃下培育板10小时。表达活性酶的酵母克隆通过其晕环或清除区域来鉴别。每轮筛选大约10,000个克隆。编码展现最大晕环的10个变异体的基因经pcr，从基因整合的卡匣扩增，亚克隆回ppic9，定序并再转化到新制备的巴斯德毕赤氏酵母细胞中，以通过确定mic来验证功能。最去免疫化和功能变异体用作随后轮的文库构筑和筛选的起点。

体内研究。进行动物感染、处理和免疫接种的方案以使动物痛苦减到最少。c57bl/6小鼠购自jacksonlaboratory(barharbor,me)。c57bl/6背景abb剔除/转基因hla-dr4小鼠(b6.129s2-h2-ab1^tm1grutg(hla-dra/h2-ea,hla-drb1*0401/h2-eb)1kito)购自taconicfarms(germantown,ny)。

体内免疫原性。100μl体积的含100μg纯化野生型或变异酶的完全弗氏佐剂(cfa)皮下注射在dr4(每组n＝5)或c57bl/6(每组n＝4)小鼠。免疫接种后十三天，收集血清并通过elisa测量抗lstigg抗体滴度(对野生型或变异蛋白质具特异性)。简单地说，将野生型或变异蛋白质抗原涂布到高度结合elisa板上，接着用bsa阻断。来自小鼠的免疫血清连续稀释到涂布板中，接着使用山羊抗小鼠igg-hrp结合物(santacruzbiotechnology,dallas,tx)在1:1000的工作浓度下探测。随后使用tmb底物(santacruzbiotechnology)使板显影，报导滴度定义为产生1.5的吸光度的血清稀释倍数。

体内功效。在细菌攻击前，dr4小鼠(每组n＝3)的免疫系统通过每周皮下注射含100μglst^wt或lib5变异体的无菌磷酸盐缓冲生理盐水(pbs：2.7mmkcl、1.5mmkh2po4、8.9mmna2hpo4、136.9mmnacl，ph7.4)初打3次。这些免疫接种和加打不含佐剂。抗lst抗体滴度如上所述测定。对于感染和处理的第一周期，通过腹膜内施用猪科粘蛋白的3％悬浮液中2×10⁸cfu金黄色葡萄球菌菌株usa400，对小鼠进行攻击，并在一小时后，通过静脉内尾静脉施用含500μglst^wt或lib5变异体的无菌pbs处理。通过酶处理拯救的小鼠每隔一周进行随后感染和处理周期。为了补偿第一次细菌暴露后先天性鼠类抗菌免疫性的发展，小鼠在第二和第三周期中用1×10⁹cfuusa400攻击，但处理保持在500μg适当蛋白质下。作为验证每个周期中致命细菌剂量的对照，给与一只小鼠pbs的假处理。

个别变异体的基于结构的设计

episweep算法(parker等人,(2013)j.comput.biol.20:152-65)用以最佳化去免疫化变异体，在如propred评估的表位含量的预测减少与如基于结构的旋转异构体能量评估的蛋白质稳定性的预测维持之间达成最佳平衡。分别产生催化结构域和细胞壁结合结构域两者的20种完全消去设计(即dr4表位评分＝0)的组。选择组合来自每个结构域的低能量设计的变异体opt1(表19)用于实验分析，并克隆到最佳化的巴斯德毕赤氏酵母表达系统中。不幸地，此14突变设计未能产生功能蛋白(表20)。

表19

请调整图，有些数字在里面，并不是没有，需要调整

表20

^a活性测量为最小抑制浓度(mic)，报导为相对于实现mic的野生型的稀释倍数％。

^b未检出。

实施例1中的lst重新设计工作展示单个突变可以用其它方式破坏稳定和活性的去免疫化变异体。因此，通过系统回复突变和突变组合来鉴别opt1设计中的不利突变。分离opt1突变的分析揭露met119arg独力消除蛋白质分泌，但设计opt2(表19)中此单个突变的回复未能恢复表达(表20)。最终，发现三个突变组合ser166glu、ser168lys和val193trp也破坏表达，且在此三个位点回复至野生型以及met119产生可以表达的10突变变异体opt3(表20)。

虽然opt3实现合理的表达水平(表20)，但sds-page的纯度分析揭露两个亮带：一个在预期25kda质量下，且第二个在大约30kda下。基于实施例1中的结果，怀疑c端细胞壁结合结构域中潜在的n-连接的糖基化序列子(²³²nks²³⁴)已活化。因此，将去免疫化asn236asp突变换成ser234lys突变，ser234lys突变消去c端表位与n-连接的糖基化序列子。所得到的10突变变异体opt4仅仅具有五个预测的dr4表位且表现为单一25kda亮带，同时产率低于opt3(表20)。虽然高度工程改造的opt4变异体呈折叠和能够分泌的状态产生，但随后发现其仅仅具有小部分的野生型酶抗菌活性(表20)。

经由计算文库设计的基于结构的去免疫化

与设计个别变异体同时，进行一种替代组合方法，其中计算设计用以产生预测富集功能性去免疫化变异体的lst文库。基于结构的文库设计法socom经表位分析加强，以鉴别组合产生具有如propred所评估的低表位评分以及如rosetta模型上训练的集团展开势评估的优良能量的变异体的残基位置和突变。在最初一轮中，设计基于野生型参考，而在随后各轮中，参考变成选自先前文库筛选的主导克隆。

文库a靶向催化结构域中的九个位点，且互补文库b群体靶向细胞壁结合结构域中的八个位点(表18)。虽然去免疫化lst设计空间大，但约束初始文库少于40,000个成员，以便维持文库尺寸与琼脂板晕环形成检定的筛选能力之间的一定平衡。从文库a与b筛选大约10,000个克隆，并对来自每个文库的10个形成大晕环的菌落进行定序并验证功能。来自文库a的最有前景的变异体(克隆lib1)在催化结构域中含有四个突变且发挥等于lst^wt的抗菌活性(表19和20)。同样地，来自文库b的最有前景的变异体(克隆lib2)在细胞壁结合结构域中具有四个突变(表19)且也具有野生型抗菌活性(表20)。

将变异体lib1和lib2的相应去免疫化结构域组合，产生变异体lib3，其含有八个突变(表19)，预测表位含量减少50％且保留50％野生型活性(表20)。随后将两个lib3结构域的结构模型化并用作另一轮去免疫化文库设计的模板。所得到的文库c靶向催化结构域中的五个位点和细胞壁结合结构域中的三个位点(表19)。10,000个克隆的功能筛选产生变异体lib4，其消去10/16dr4表位。相对于其lib3开始模板，lib4在催化结构域和细胞壁结合结构域中含有一个其它突变，且保留同等的抗菌活性(表20)。lib4的结构域用于迭代的另一轮模型化和去免疫化文库设计中，产生文库d，从文库d筛选10,000个克隆以分离变异体lib5。变异体lib5消去13/16假定dr4表位(表19)，但保留50％野生型表达和50％抗菌活性(表20)。与变异体opt4比较，来自个别蛋白质设计工作的最佳酶lib5展现较低的预测表位评分和较高的测量功能性。

进一步文库构筑和筛选工作(文库e)未能鉴别其它的功能构筑体。因此，13突变lib5变异体被指定为主要候选变异体用于进一步分析。有趣地注意到，保留在变异体lib5中的三个假定表位(³³ygvdffmti⁴¹，seqidno:215；³⁸fmtigtpvk⁴⁶，seqidno:216；和¹¹⁶fqrmdntfs¹²⁴，seqidno:217)涵盖负责活性位点zn²⁺配位的氨基酸(his32、asp36和his115)或与其邻接。此事实可能说明这些区域内功能突变的逃避性；不同文库群体的筛选仅仅鉴别区域33-46中一个功能取代和区域116-124中两个功能取代(表19)。

表位消去设计显示体内显著降低的免疫原性

随后评估表位消去影响体内免疫原性的程度。在c57bl/6和转基因dr4小鼠中确定抗lst抗体反应，后者不存在内源性鼠类mhcii，但载有来源于人类hladrb1*0401的嵌合mhcii受体(ito等人,(1996)j.exp.med.183:2635-44)。作为去免疫化的严格基准，将小鼠皮下免疫接种含蛋白质的完全弗氏佐剂(一种有效免疫刺激剂)。单次免疫接种lst^wt后两周，所有dr4小鼠发起有效的抗lstigg抗体反应，滴度在1:150与1:1700之间。相比之下，免疫接种opt4的小鼠展示滴度显著减少；仅仅2/5小鼠展现任何可检测的抗lst抗体，并且甚至相对于lst^wt免疫接种动物基本上降低。变异体lib5还引起降低的抗体反应；仅仅一种动物展现高抗体滴度(1:1200)，三只展示显著较低的抗体滴度(1:15至1:26)，且1只小鼠展现接近背景水平的抗lst抗体。重要地，lst^wt与opt4在c57bl/6实验室小鼠菌株中具有同等免疫原性，而lib5免疫原性实际上比lst^wt多(分别igg滴度1:4400至1:15,000对比1:560至1:2100)。因此，与天然鼠类mhcii相对比，opt4和lib5免疫原性的显著减少特别与人类dr4对分子识别的破坏相关。

注意到，虽然蛋白质设计过程对除对偶基因dr4外所有对偶基因不知情，但propred预测指示对于七种其它代表性人类drb1对偶基因，opt4和lib5都不含新表位(补充图s1)。事实上，超出从opt4消去的11个假定dr4表位，预测表明还消去12个与对偶基因dr1、dr3、dr7、dr13和dr15相关的表位。对于lib5类似地，除消去13个dr4限制的表位外，propred预测消去与其它七种drb1对偶基因相关的18个其它表位。

溶葡萄球菌酶去免疫化转变成提高治疗功效

在一些实施方案中，lst的治疗应用可能需要重复施用以完全根除金黄色葡萄球菌感染。因此，为了更接近地模拟潜在的临床应用，在每周给药期间在缺乏佐剂的情况下监测lst^wt和lib5的免疫原性。第三次免疫接种后七天，所有接受lst^wt的dr4小鼠已发起相对较强的免疫反应，其中抗lst滴度在1:40至1:160范围内。在相同时限期间，三只免疫接种lib5的小鼠中仅仅一只发展高抗体滴度(1:120)，其中另外两只lib5小鼠展现仅仅略高过背景的滴度。

随后使用金黄色葡萄球菌复发性菌血症模型，评估lst免疫原性影响体内功效的程度。在第三周确定抗体滴度后，以上dr4小鼠通过腹膜内施用2×10⁸菌落形成单位(cfu)的甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(mrsa)菌株usa400来感染。一小时后，小鼠分别静脉内推注500μglst^wt或lib5。两种酶从此初始感染拯救其相应组，而给与pbs假处理的对照小鼠由于过度发病而不得不处死。

一周后，lst^wt组(1:300至1:650)和lib5组(1小鼠>1:1000，剩余两者在1:15与1:20之间)的抗体滴度增加，但后者继续展现较低总趋势。小鼠现在感染10⁹cfu的mrsa并在1小时后通过静脉内推注500μg相应酶再次处理。在此第二次感染周期中，在小鼠发展更高的抗体滴度下，lst^wt未能拯救三个处理小鼠中的任一只。类似地，展现高抗体滴度的单个lib5小鼠死于感染，但从第二次mrsa攻击拯救出两只较低滴度lib5小鼠。

随后一周，发现两只存活的lib5小鼠的抗体滴度再一次增加(1:70和1:120)，但值得注意地，其保持低于第4周lst^wt滴度。mrsa第三次感染周期后，一只小鼠用lib5处理且存活，而第二只小鼠给与pbs假并死于感染。总体上，这些结果表明人类化dr4小鼠发起对lst^wt的强免疫反应，甚至是在缺乏佐剂的情况下。在重复施用期间，每周抗lst^wt抗体滴度增加与功效丧失相关。相反地，在接受lib5去免疫化变异体的三只小鼠中的两只中免疫反应减弱，且再一次体内功效用抗lst抗体滴度追踪。lib5对mrsa多达三次的连续攻击发挥有效的抗菌功效。

在整个研究中，低于1:256的抗lst抗体滴度与酶介导的免于金黄色葡萄球菌感染相关，而超过256的滴度普遍与抗菌酶疗法的失败相关。因此，变异体lib5减轻抗药物抗体反应的能力显现为相对于lst^wt的功效增强。

实施例3：人类群体中溶葡萄球菌酶催化结构域和细胞壁结合结构域针对代表hla结合特异性的hla对偶基因的去免疫化

为了将lst针对人类hla对偶基因drb1*0101、0301、0401、0701、0801、1101、1301和1501去免疫化，产生预测富集功能性去免疫化的变异体的个别变异体和文库。如实施例2中所描述，进行催化结构域(图6a)和细胞壁结合结构域(图6b)的表位定位。使用此信息以及溶剂可及性和进化保守性，产生去免疫化lst突变体。

具体地说，细胞壁结合结构域的突变(表21)与柔性9突变体(实施例1)或柔性9衍生物的催化结构域的突变组合。

表21

筛选变异体并鉴别三个相关变异体f11、f12和f13(表22)。

表22

*真核宿主细胞中有效产生的无糖基化的突变。细菌宿主中表达不需要这些突变。

^#相对于野生型溶葡萄球菌酶序列(seqidno:49)。

针对mrsa菌株usa400的体外抑制活性筛选f11、f12和f13(图7)。此分析指示变异体f11和f13相对于野生型lst保留12.5％mic活性，而变异体f12相对于野生型lst保留25％mic活性。此外，在确定针对mrsa菌株usa400的活性前，在50℃下加热变异体1小时后，发现野生型lst保留完全mic活性，f13保留25％其原始mic活性，且f12保留50％其原始mic活性。

在c57bl/6小鼠中进一步分析f11变异体的体内功效。小鼠通过腹膜内注射2×10⁸mrsa菌株usa400攻击，且1小时后，小鼠用100μg呈单次静脉内推注施用的野生型lst、f11或pbs处理。两种蛋白质处理的存活率是1/3。选择100μg剂量，因为已知野生型lst仅仅在此剂量下部分有效。通过使用此剂量，可证明f11变异体清楚的功效同等性。此分析指示两种蛋白质在体内具有同等功效(图8)。

在dr4hla转基因小鼠(即载有部分人类化免疫系统的小鼠)中，将f13变异体的免疫原性与野生型lst相比。将100μg野生型lst或变异体f13与完全弗氏佐剂混合且皮下注射至dr4小鼠中。十四天后，通过elisa测量抗体滴度。与野生型lst比较，变异体f13产生超过200倍抗体滴度。为了评估抗体滴度对抗菌功效的影响，小鼠用腹膜内注射2×10⁸mrsa菌株usa400攻击，且1小时后，小鼠用500μg呈单次静脉内推注施用的野生型lst、变异体f13或pbs处理。接受pbs假处理的两种小鼠如用野生型lst处理的两只小鼠一样死亡。相比之下，用变异体f13处理的两种小鼠存活。因此，f13的免疫原性降低使得体内治疗功效增强。

在类似组的实验中，在缺乏佐剂的情况下，使用dr4hla转基因小鼠，将变异体f12的免疫原性和功效与野生型lst相比。在第0周，小鼠用腹膜内注射2×10⁸mrsa菌株usa400攻击，且1小时后，小鼠用呈单次皮下推注施用的500μg野生型lst或500μg变异体f12处理。随后，小鼠每周用腹膜内注射1×10⁹mrsa菌株usa400攻击，且如上处理。从第2周开始，每周测量抗体滴度。野生型lst能够将小鼠从总共四次复发性全身性mrsa感染中拯救，但未能从第五次感染拯救任何小鼠(表23)。变异体f12从四次复发性全身性mrsa感染拯救所有小鼠(表24)。变异体f12引起的基本上较低的抗体滴度指示此变异体比野生型lst更有效。

表23

*仅仅测量总共五只中四只代表性小鼠的elisa抗体滴度

表24

*仅仅测量总共九只中八只的elisa抗体滴度