[0001]
本发明涉及分离提纯领域，尤其涉及一种甜菊糖苷分离纯化用吸附树脂及其应用。
背景技术：
[0002]
甜菊糖苷是一种天然、高甜度、低热量且不致龋的甜味剂，是从甜叶菊的叶子和根茎中提取精制得到。甜菊糖苷的主要用途是替代蔗糖、高果糖浆、阿斯巴甜、三氯蔗糖等甜味剂，用于食品增甜。
[0003]
目前从甜叶菊中分离得到8种不同甜度的糖苷，其中，甜菊苷(stv)的含量最高，约占甜叶菊干叶的6-8％，莱鲍迪苷a(ra)与其它糖苷相比，它的甜度最高，约为蔗糖的300-400倍。
[0004]
近年来，国内外有很多关于甜菊糖苷分离纯化的研究，利用了许多新型分离、制备方法，但主要还是以树脂吸附分离为主。大孔吸附树脂是一类聚合物基材的吸附分离材料，由聚合单体、交联剂、引发剂、致孔剂和其他助剂等经聚合反应制备而成。大孔树脂具有理化性质稳定，机械强度高，抗污染能力强，再生简便、解吸条件温和等特点，在水溶液和非水溶液中都能使用，使用周期较长、宜于构成闭路循环、节省费用。近年来，大孔树脂在植物组织和发酵液中的活性成分的提取、分离、纯化、浓缩等方面的应用日益广泛。
[0005]
目前，大孔吸附树脂技术广泛用于甜菊糖苷的提取纯化，国外主要使用diaion hp-20和amberlite xad-2，国内大多使用ab-8吸附甜菊糖苷。但这些大孔吸附树脂在吸附甜菊糖苷时，色素和其他可溶性杂质同样会被树脂吸附，在乙醇溶液解吸工段，部分色素同样被解吸，即大孔树脂存在甜菊糖苷吸附选择性差的问题。
技术实现要素：
[0006]
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种甜菊糖苷分离纯化用吸附树脂及其应用，该吸附树脂负载有苯硼酸基团，利用该苯硼酸基团与含有邻位顺式羟基结构的甜菊糖苷与硼酸基之间能够发生络合这一特性，实现了对甜菊糖苷的选择性可逆循环吸附，分离出了高纯度甜菊糖苷。
[0007]
本发明提出的一种甜菊糖苷分离纯化用吸附树脂，所述吸附树脂是将功能单体与乙烯基功能化氧化石墨烯、交联剂和引发剂，在致孔剂中进行聚合反应得到；
[0008]
其中，所述功能单体包括丙烯酰胺和4-乙烯基苯硼酸，所述交联剂包括乙二醇二甲基丙烯酸酯。
[0009]
优选地，所述引发剂包括偶氮二异丁腈，所述致孔剂包括乙腈。
[0010]
优选地，所述乙烯基功能化氧化石墨烯是通过将氧化石墨烯与3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷进行反应得到；
[0011]
优选地，所述乙烯基功能化氧化石墨烯是通过将氧化石墨烯分散于乙醇中，加入3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷，在60-80℃下搅拌反应3-5h得到。
[0012]
优选地，所述氧化石墨烯与3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷的质量体积比为1g:0.1-1ml。
[0013]
优选地，所述吸附树脂是将功能单体与乙烯基功能化氧化石墨烯、交联剂和引发剂分散在致孔剂中，在50-70℃下聚合反应后，再洗脱出致孔剂得到。
[0014]
优选地，所述丙烯酰胺和4-乙烯基苯硼酸的质量比为1:1-3；所述丙烯酰胺和乙烯基功能化氧化石墨烯的质量比为1:1-4；所述丙烯酰胺和乙二醇二甲基丙烯酸酯的质量比为1:10-20；
[0015]
优选地，所述丙烯酰胺和引发剂的质量比为1:0.02-0.2；所述丙烯酰胺和致孔剂的质量体积比为1g:80-160ml。
[0016]
本发明还提出一种上述吸附树脂在甜菊糖苷分离纯化中的应用。
[0017]
优选地，所述应用包括：先将吸附树脂装入色谱柱中，再将待分离的甜菊糖苷溶液通过该色谱柱，用洗脱剂进行洗脱后，得到高纯度甜菊糖苷。
[0018]
优选地，所述待分离的甜菊糖苷溶液为甜叶菊水提液；
[0019]
优选地，所述甜叶菊水提液是通过将甜叶菊水提后得到。
[0020]
优选地，所述洗脱剂为体积分数60-80％的乙醇水溶液。
[0021]
本发明中，通过将丙烯酰胺、4-乙烯基苯硼酸功能单体与乙烯基功能化的氧化石墨烯、乙二醇二甲基丙烯酸酯交联剂进行聚合，得到了一种同时具有苯硼酸基团修饰和石墨烯负载的大孔树脂。一方面，苯硼酸基团修饰的大孔树脂，对甜菊糖苷尤其是莱鲍迪苷a和甜菊苷具有选择性吸附能力，利用柱色谱即可实现该类甜菊糖苷的高效分离；另一方面，采用乙烯基功能化的氧化石墨烯参与聚合反应，其可以有效控制吸附树脂的形貌呈现，使所得吸附树脂均匀分布大量的孔隙结构，有助于实现对甜菊糖苷的快速吸附和解吸，从而获得极高纯度的甜菊糖苷。最终通过上述两方面的作用，可将甜菊糖苷的纯度提高至96％以上。
具体实施方式
[0022]
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
[0023]
下述实施例中，甜菊糖苷特指莱鲍迪苷a(ra)和甜菊苷(stv)两种甜菊糖苷，其回收率按照计算，其中c是ra和stv的浓度之和(mg/ml)(由hplc分析确定)，v是洗脱液的体积(ml)，w是甜叶菊水提液中ra和stv的质量之和(mg)；纯度按照计算，c是ra和stv的浓度之和(mg/ml)(由hplc分析确定)，v是洗脱液的体积(ml)，m是v体积的洗脱液于烘箱中80℃干燥至恒重后干燥物质的质量(mg)。
[0024]
实施例1
[0025]
本发明提出的一种甜菊糖苷分离纯化用吸附树脂，其是采用下述方法制备得到：
[0026]
(1)制备乙烯基功能化氧化石墨烯
[0027]
将1g鳞片石墨和120ml浓硫酸、15ml浓磷酸混匀后，加入6g kmno4，在30℃水浴中搅拌反应1h，再缓慢滴加h2o2(30wt％)溶液，直至反应液变为金黄色，加入盐酸离心洗涤，再用去离子水洗涤至中性，过滤，干燥，得到氧化石墨烯；
[0028]
将1g氧化石墨烯加入到30ml乙醇中超声分散均匀，再加入0.5ml 3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷，升温至80℃后保温搅拌反应4h，蒸干溶剂后，乙醇洗涤3次，60℃下真空干燥过夜，得到乙烯基功能化氧化石墨烯；
[0029]
(2)制备甜菊糖苷分离纯化用吸附树脂：
[0030]
将1g乙烯基功能化氧化石墨烯分散在60ml乙腈中，再加入0.5g丙烯酰胺、1g 4-乙烯基苯硼酸和8g乙二醇二甲基丙烯酸酯，室温下搅拌均匀后，再加入0.05g偶氮二异丁腈，通氮气排空氧气后，密封条件下在60℃水浴中热引发聚合反应15h，形成块状聚合物；
[0031]
将所述块状聚合物研磨成粉，过100目筛后，通过索氏萃取，用甲醇/乙酸(8/2，v/v)的混合溶剂洗涤12h，除去乙腈，再用甲醇洗涤至中性，60℃下真空干燥12h，得到所述甜菊糖苷分离纯化用吸附树脂。
[0032]
实施例2
[0033]
本发明提出的一种甜菊糖苷分离纯化用吸附树脂，其是采用下述方法制备得到：
[0034]
(1)制备乙烯基功能化氧化石墨烯
[0035]
将1g鳞片石墨和120ml浓硫酸、15ml浓磷酸混匀后，加入6g kmno4，在30℃水浴中搅拌反应1h，再缓慢滴加h2o2(30wt％)溶液，直至反应液变为金黄色，加入盐酸离心洗涤，再用去离子水洗涤至中性，过滤，干燥，得到氧化石墨烯；
[0036]
将1g氧化石墨烯加入到30ml乙醇中超声分散均匀，再加入0.5ml 3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷，升温至80℃后保温搅拌反应4h，蒸干溶剂后，乙醇洗涤3次，60℃下真空干燥过夜，得到乙烯基功能化氧化石墨烯；
[0037]
(2)制备甜菊糖苷分离纯化用吸附树脂：
[0038]
将1g乙烯基功能化氧化石墨烯分散在160ml乙腈中，再加入1g丙烯酰胺、1g 4-乙烯基苯硼酸和20g乙二醇二甲基丙烯酸酯，室温下搅拌均匀后，再加入0.4g偶氮二异丁腈，通氮气排空氧气后，密封条件下在60℃水浴中热引发聚合反应20h，形成块状聚合物；
[0039]
将所述块状聚合物研磨成粉，过100目筛后，通过索氏萃取，用甲醇/乙酸(8/2，v/v)的混合溶剂洗涤16h，除去乙腈，再用甲醇洗涤至中性，60℃下真空干燥12h，得到所述甜菊糖苷分离纯化用吸附树脂。
[0040]
实施例3
[0041]
本发明提出的一种甜菊糖苷分离纯化用吸附树脂，其是采用下述方法制备得到：
[0042]
(1)制备乙烯基功能化氧化石墨烯
[0043]
将1g鳞片石墨和120ml浓硫酸、15ml浓磷酸混匀后，加入6g kmno4，在30℃水浴中搅拌反应1h，再缓慢滴加h2o2(30wt％)溶液，直至反应液变为金黄色，加入盐酸离心洗涤，再用去离子水洗涤至中性，过滤，干燥，得到氧化石墨烯；
[0044]
将1g氧化石墨烯加入到30ml乙醇中超声分散均匀，再加入0.5ml 3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷，升温至80℃后保温搅拌反应4h，蒸干溶剂后，乙醇洗涤3次，60℃下真空干燥过夜，得到乙烯基功能化氧化石墨烯；
[0045]
(2)制备甜菊糖苷分离纯化用吸附树脂：
[0046]
将1g乙烯基功能化氧化石墨烯分散在60ml乙腈中，再加入0.25g丙烯酰胺、0.75g 4-乙烯基苯硼酸和2.5g乙二醇二甲基丙烯酸酯，室温下搅拌均匀后，再加入0.005g偶氮二异丁腈，通氮气排空氧气后，密封条件下在60℃水浴中热引发聚合反应10h，形成块状聚合
物；
[0047]
将所述块状聚合物研磨成粉，过100目筛后，通过索氏萃取，用甲醇/乙酸(8/2，v/v)的混合溶剂洗涤12h，除去乙腈，再用甲醇洗涤至中性，60℃下真空干燥12h，得到所述甜菊糖苷分离纯化用吸附树脂。
[0048]
对比例1
[0049]
本对比例提出的一种甜菊糖苷分离纯化用吸附树脂，其是采用下述方法制备得到：
[0050]
(1)制备乙烯基功能化氧化石墨烯
[0051]
将1g鳞片石墨和120ml浓硫酸、15ml浓磷酸混匀后，加入6g kmno4，在30℃水浴中搅拌反应1h，再缓慢滴加h2o2(30wt％)溶液，直至反应液变为金黄色，加入盐酸离心洗涤，再用去离子水洗涤至中性，过滤，干燥，得到氧化石墨烯；
[0052]
将1g氧化石墨烯加入到30ml乙醇中超声分散均匀，再加入0.5ml 3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷，升温至80℃后保温搅拌反应4h，蒸干溶剂后，乙醇洗涤3次，60℃下真空干燥过夜，得到乙烯基功能化氧化石墨烯；
[0053]
(2)制备甜菊糖苷分离纯化用吸附树脂：
[0054]
将1g乙烯基功能化氧化石墨烯分散在60ml乙腈中，再加入1g丙烯酰胺和8g乙二醇二甲基丙烯酸酯，室温下搅拌均匀后，再加入0.05g偶氮二异丁腈，通氮气排空氧气后，密封条件下在60℃水浴中热引发聚合反应15h，形成块状聚合物；
[0055]
将所述块状聚合物研磨成粉，过100目筛后，通过索氏萃取，用甲醇/乙酸(8/2，v/v)的混合溶剂洗涤12h，除去乙腈，再用甲醇洗涤至中性，60℃下真空干燥12h，得到所述甜菊糖苷分离纯化用吸附树脂。
[0056]
对比例2
[0057]
本对比例提出的一种甜菊糖苷分离纯化用吸附树脂，其是采用下述方法制备得到：
[0058]
在60ml乙腈中加入0.5g丙烯酰胺、1g 4-乙烯基苯硼酸和8g乙二醇二甲基丙烯酸酯，室温下搅拌均匀后，再加入0.05g偶氮二异丁腈，通氮气排空氧气后，密封条件下在60℃水浴中热引发聚合反应15h，形成块状聚合物；
[0059]
将所述块状聚合物研磨成粉，过100目筛后，通过索氏萃取，用甲醇/乙酸(8/2，v/v)的混合溶剂洗涤12h，除去乙腈，再用甲醇洗涤至中性，60℃下真空干燥12h，得到所述甜菊糖苷分离纯化用吸附树脂。
[0060]
试验例1
[0061]
一种实施例1所述吸附树脂在甜菊糖苷分离纯化中的应用，其具体包括：
[0062]
(1)将甜叶菊干叶粉碎至30目后，按照料液比1:5加入500ml去离子水中，室温下(25℃)超声辅助提取12min(超声功率360w，每工作10s，停5s)，过滤，滤渣拧干后重复提取两次，合并滤液，得到甜叶菊水提液；
[0063]
(2)将100ml甜叶菊水提液以1bv/h的流速通入装填有3g实施例1所述吸附树脂的色谱柱进行吸附，控制柱温为25℃，吸附结束后先用4bv去离子水以3bv/小时的流速水洗柱，再用3bv乙醇水混合溶剂(7/3，v/v)以2bv/h的流速进行洗脱，收集洗脱液，经测定其中的甜菊糖苷纯度为97.7％，回收率为94.6％。
[0064]
试验例2
[0065]
一种实施例2所述吸附树脂在甜菊糖苷分离纯化中的应用，除了采用3g实施例2所述吸附树脂替代实施例1所述吸附树脂，其它操作和试验例1相同。
[0066]
收集洗脱液，经测定其中的甜菊糖苷纯度为96.9％，回收率为93.8％。
[0067]
试验例3
[0068]
一种实施例3所述吸附树脂在甜菊糖苷分离纯化中的应用，除了采用3g实施例3所述吸附树脂替代实施例1所述吸附树脂，其它操作和试验例1相同。
[0069]
收集洗脱液，经测定其中的甜菊糖苷纯度为96.1％，回收率为95.5％。
[0070]
试验例4
[0071]
一种对比例1所述吸附树脂在甜菊糖苷分离纯化中的应用，除了采用3g对比例1所述吸附树脂替代实施例1所述吸附树脂，其它操作和试验例1相同。
[0072]
收集洗脱液，经测定其中的甜菊糖苷纯度为63.9％，回收率为67.5％。
[0073]
试验例5
[0074]
一种对比例2所述吸附树脂在甜菊糖苷分离纯化中的应用，除了采用3g对比例2所述吸附树脂替代实施例1所述吸附树脂，其它操作和试验例1相同。
[0075]
收集洗脱液，经测定其中的甜菊糖苷纯度为77.3％，回收率为49.6％。
[0076]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。