一组用于华东木犀物种的特异性叶绿体基因变异位点鉴定的DNA探针及其鉴定方法与流程

一组用于华东木犀物种的特异性叶绿体基因变异位点鉴定的dna探针及其鉴定方法
技术领域
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本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一组用于华东木犀物种的特异性叶绿体基因变异位点鉴定的dna探针及其鉴定方法。


背景技术：

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华东木犀（osmanthu cooperi hemsl.）属木犀属（osmanthus lour.）于木犀科（oleaceae），又称宁波木犀。其叶全缘，花冠白色，清新淡雅，花冠管与裂片几乎等长，果实蓝黑色，是优良的园林观赏植物。
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随着对华东木犀的研究逐渐深入，快速且准确地鉴定华东木犀物种是亟需解决的一大难题。目前，判断一个物种是否为华东木犀的方法多是通过树势、叶片形态和着生方式、节间、花形态等传统手段，易受环境因素和人为因素影响。且华东木犀的某些形态特征与木犀属其他种类似，传统方法难以准确鉴别。
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以特异性叶绿体基因变异位点为分子标记的鉴定方法可以直接检测出不同物种在dna水平上的差异，不受生长阶段、环境和人为因素的影响，具有较高的特异性和准确性，能快速准确鉴定传统手段难以鉴定的物种。目前，还未有基于特异性叶绿体基因变异位点的快速鉴定华东木犀物种的分子标记。


技术实现要素：

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发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一组用于华东木犀物种的特异性叶绿体基因变异位点鉴定的dna探针，针对12个能鉴定出华东木犀物种的特异性叶绿体基因变异位点，进行分子水平的鉴定，克服以往形态学鉴定上存在的不足，提供准确可靠、简单快捷且灵敏度高的分子标记，对华东木犀的barcode研究以及华东木犀的起源和进化研究都具有重要意义。
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本发明包括以下技术方案：一组用于华东木犀物种的特异性叶绿体基因变异位点鉴定的dna探针，所述dna探针能够与华东木犀叶绿体基因组（genbank: mk841488.1）完整序列中的下述特异性叶绿体基因变异位点的一个或者多个结合，所述特异性叶绿体基因变异位点按照其在基因组上的序号分别为2200、15674、22633、23897、34024、37716、44994-45005、50543、110945-110952、115953-115960、129106、132560-132567。
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进一步的，上述一组用于华东木犀物种的特异性叶绿体基因变异位点鉴定的dna探针，所述dna探针选自seq id no.1
-ꢀ
seq id no.12中的一种或者多种。
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其中：seq id no.1= cagaatagtggaaatcacatttttattttgttseq id no.2= aaatcaactgaaatgtagaatagtttctseq id no.3= cacaaatacctcgacgattcccgctc
seq id no.4= tgaaagtttcctttcatccggctseq id no.5= tatttccgattaaatcttcttseq id no.6= gaaagacaatttttattttattseq id no.7= ttttaaactgaaatttggattcaatttgseq id no.8= gggtagagttttttaaataaagtatseq id no.9= gggaagtacctttccctctgggggtaggaaaatseq id no.10= aattcgctccgctgttagaacttagaatatgtagseq id no.11= taaaatagattgagttattaacatseq id no.12= gatttcctacccccagagggaaa进一步的，上述一组用于华东木犀物种的特异性叶绿体基因变异位点鉴定的dna探针，所述dna探针上标记有示踪剂。
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进一步的，上述一组用于华东木犀物种的特异性叶绿体基因变异位点鉴定的dna探针，所述示踪剂为同位素标记、非同位剂中的一种或者多种。
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进一步的，上述一组用于华东木犀物种的特异性叶绿体基因变异位点鉴定的dna探针，所述非同位素标记为酶或者有色基团。
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进一步的，上述一组用于华东木犀物种的特异性叶绿体基因变异位点鉴定的dna探针，所述特异性叶绿体基因变异位点的变异类型是：进一步的，上述一组用于华东木犀物种的特异性叶绿体基因变异位点鉴定的dna探针，寻找所述华东木犀物种的特异性叶绿体基因变异位点的方法包括以下步骤：1）采用illumina hiseq 2500高通量测序平台，对三个不同来源的华东木犀叶片进行叶绿体全基因组测序。
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2）使用clc genomics workbench v9对raw reads进行修剪，然后使用novoplasty程序将得到的clean reads组装成叶绿体基因组。
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3）使用cpgavas对上一步合成的叶绿体基因组进行注释。
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4）从ncbi细胞器基因组和核苷酸资源数据库，下载已知的23个木犀属物种的叶绿体基因组；5）使用mafft软件对步骤2）得到的叶绿体基因组和步骤4）下载的23个木犀属物种的叶绿体基因组进行比对；6）使用mega6软件利用邻接法构建系统进化树，找到华东木犀特有的变异位点进一步的，一种快速鉴定华东木犀物种的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待测植物的叶绿体基因组dna；(2)以步骤(1)提取的叶绿体基因组dna为模板，进行pcr扩增，利用权利要求1-7任一项所述的dna探针检测所述特异性叶绿体基因变异位点存在与否；(3)若经检测，所述特异性叶绿体基因变异位点存在，则判断该待测植物鉴定为华东木犀。
[0015]
一种鉴定华东木犀物种的试剂盒，其特征在于，包含上述dna探针和其他必要的试剂。
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有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优势：1）保守性高，可靠性好：叶绿体基因组为母系遗传，相较于核基因组上的分子标记，叶绿体基因变异位点的保守性较高。
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2）特异性高，适用范围广：本发明可对所有疑似华东木犀的木犀属物种进行鉴定。
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3）鉴定方便简便易行，可制备成试剂盒，对疑似植物进行快速鉴定。
附图说明
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图1是第1个变异位点的具体序列示意图；图2是第2个变异位点的具体序列示意图；图3是第3个变异位点的具体序列示意图；图4是第4个变异位点的具体序列示意图；图5是第5个变异位点的具体序列示意图；图6是第6个变异位点的具体序列示意图；图7是第7个变异位点的具体序列示意图；图8是第8个变异位点的具体序列示意图；图9是第9个变异位点的具体序列示意图；图10是第10个变异位点的具体序列示意图；图11是第11个变异位点的具体序列示意图；图12是第12个变异位点的具体序列示意图。
具体实施方式
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下面结合具体附图对本发明做进一步说明。
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实施例112个能鉴定出华东木犀物种的特异性叶绿体基因变异位点，其寻找过程包括以下步骤：
1）采用illumina hiseq 2500高通量测序平台，对三个不同来源的华东木犀叶片进行叶绿体全基因组测序。
[0022]
2）使用clc genomics workbench v9对raw reads进行修剪，然后使用novoplasty程序将得到的clean reads组装成叶绿体基因组。
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3）使用cpgavas对上一步合成的叶绿体基因组进行注释。
[0024]
4）从ncbi细胞器基因组和核苷酸资源数据库，下载已知的23个木犀属物种的叶绿体基因组。
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5）使用mafft软件对步骤2）得到的叶绿体基因组和步骤4）下载的23个木犀属物种的叶绿体基因组进行比对。
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6）使用mega6软件利用邻接法构建系统进化树，找到华东木犀特有的变异位点，结果如图1-12所示。
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所述特异性叶绿体基因变异位点的变异类型为。起始位置结束位置变异类型22002200t-a1567415674t2263322633t-c2389723897c-t3402434024a-t3771637716c-t4499445005aatttggattc5054350543a-t110945110952ctctggg115953115960cttagaa129106129106a-g132560132567cccagag
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实施例2利用实施例2获得的12个特异性叶绿体基因变异位点设计一组用于华东木犀物种的特异性叶绿体基因变异位点鉴定的dna探针，所述dna探针能够与华东木犀叶绿体基因组完整序列中的1-12个位点结合，所述dna探针的序列为：探针1=seq id no.1= cagaatagtggaaatcacatttttattttgtt探针2=seq id no.2= aaatcaactgaaatgtagaatagtttct探针3=seq id no.3= cacaaatacctcgacgattcccgctc探针4=seq id no.4= tgaaagtttcctttcatccggct探针5=seq id no.5= tatttccgattaaatcttctt探针6=seq id no.6= gaaagacaatttttattttatt探针7=seq id no.7= ttttaaactgaaatttggattcaatttg探针8=seq id no.8= gggtagagttttttaaataaagtat探针9=seq id no.9= gggaagtacctttccctctgggggtaggaaaat探针10=seq id no.10= aattcgctccgctgttagaacttagaatatgtag
探针11=seq id no.11= taaaatagattgagttattaacat探针12=seq id no.12= gatttcctacccccagagggaaa实施例3依据实施例2获得的探针，鉴别疑似华东木犀物种的总体方法，包括以下步骤：(1)提取待测植物的叶绿体基因组dna；(2)以步骤(1)提取的叶绿体基因组dna为模板，进行pcr扩增，利用权利要求1-7任一项所述的dna探针检测所述特异性叶绿体基因变异位点存在与否；(3)若经检测，所述特异性叶绿体基因变异位点存在，则判断该待测植物鉴定为华东木犀。
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未特别说明，其中的分子生物学操作方法和试剂均为常规的分子生物学方法和试剂。
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以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。