一种基于等温扩增的miRNA多位点联合检测方法与流程

一种基于等温扩增的mirna多位点联合检测方法
技术领域
[0001]
本发明属于mirna检测技术领域，涉及一种基于等温扩增的mirna多位点联合检测方法。


背景技术：

[0002]
microrna(简称mirna)是一类较小，仅含有19-23个碱基的内源性单链rna，广泛存在于各种真核生物细胞中。mirna作为一类高度保守的小分子非编码rna，它的异常表达参与了多种疾病的进程，其中包括癌症的发生、发展、转移和复发等多个过程，根据其调控的基因不同而发挥致癌因子作用或抑癌因子作用，而其表达量的变化便可作为疾病诊断和预后的标记物。
[0003]
mirna在各种体液都十分稳定、可定量，并且它们在体液中的水平和组成也与疾病发展的情况具有相关性。在无创液体活检领域，mirna可以作为包括癌症在内几乎所有人类疾病的理想候选生物标志物。事实上，mirna已经作为肝癌的血液学分子标志物加入《原发性肝癌诊疗规范(2019年版)》。该规范指出，目前基于循环mirna模型的肝癌检测试剂盒已经由多家医院验证，并获得国家药物监督管理局三类医疗器械注册证，进入临床应用。
[0004]
目前常见的mirna检测方法分为直接检测和间接检测两个类别。直接检测方法主要基于荧光、比色、电化学等方法，这些方法可以直接检测mirna的水平和表达，但是灵敏度较低，且难以区分序列相近的同源mirna。间接检测方法主要包括northern blot、微阵列芯片、实时荧光定量pcr(qrt-pcr)等检测方法。其中northern blot和微阵列芯片方法都是半定量方法，且敏感性较差，对起始mirna量的需求也较大。相比之下，qrt-pcr是目前定量检测rna的最灵敏、最有效的方法。
[0005]
基于taqman探针的实时qrt-pcr检测方法已被应用于mirna的检测，当前市场上占主导地位的商品是invitrogen公司(原abi公司)开发的实时荧光定量pcr方法(taqman microrna检测方法)。该方法首先通过针对特定mirna设计的茎环引物将mirna进行反转录，之后利用taqman探针和特定的引物进行荧光定量。该方法虽然在一定程度上克服了大部分mirna检测方法的缺陷，但是该方法还存在着以下几点问题。首先，taqman探针虽然检测灵敏度较高，但是针对每种mirna的设计不仅成本过高，技术上也很具有挑战性。其次，该方法不能在同一个反应孔进行mirna的多重检测，而单mirna位点的检测对于疾病诊断的敏感性和特异性相对较低。再加上该方法的检测成本较高，这些缺点都限制了该方法的广泛应用和对临床的转化。


技术实现要素：

[0006]
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种基于等温扩增的mirna多位点联合检测方法。
[0007]
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0008]
本发明提供了一种基于等温扩增的mirna多位点联合检测方法，包括以下步骤：
[0009]
1)设计并合成5
′
端带有生物素标记的上游通用引物和下游通用引物；针对每个目的mirna序列设计合成一条特异性单链dna探针，锁式探针与相对应的待检测mirna片段进行杂交，形成多个杂化双链；
[0010]
探针从5
′
端开始依次为：磷酸化标记——与mirna的5
′
端8-14个碱基反向互补序列——特异性tag序列——下游通用引物反向互补序列——上游通用引物序列——与mirna的3
′
端剩余碱基反向互补序列；
[0011]
2)使用连接酶连接步骤1)杂交成功的锁式探针的两端；
[0012]
3)使用上游通用引物和下游通用引物对步骤2)连接产物进行滚环等温扩增；
[0013]
4)使用特异性磁珠对步骤3)产物片段进行杂交；
[0014]
5)使用链霉亲和标记的荧光染料对步骤4)产物进行荧光标记；
[0015]
6)检测步骤5)产物荧光信号。
[0016]
优选地，步骤1)中，杂交条件为：80-90℃，2-5min，缓慢降至室温，保持2-4h。
[0017]
优选地，步骤2)中，所述连接酶选自t4 dna连接酶或t4 rna连接酶或splintr dna连接酶。
[0018]
优选地，步骤2)中，连接条件为：16-37℃，15-60min。
[0019]
优选地，步骤3)中，扩增反应可以选择市面上销售的任何等温扩增反应试剂盒。
[0020]
优选地，步骤3)中，等温扩增反应条件是20-40℃，2-12h。
[0021]
优选地，步骤4)中，所述特异性磁珠耦联有特异性核酸序列，每种微球上带有不同的标记，可以与特定的pcr产物结合。
[0022]
优选地，步骤4)中，杂交反应条件为：85-100℃，60-120s；25-40℃，10-20min。
[0023]
优选地，步骤5)中，进行荧光标记的反应条件为：25-37℃，10-30min。
[0024]
本发明与现有技术相比具有以下优点：
[0025]
1.无需进行逆转录，节省成本，降低损失；
[0026]
2.特异性好，可区分单个碱基(可参见实施例1)；
[0027]
3.多重检测(可参见实施例2)；
[0028]
4.本发明所述的方法可应用于各领域多位点mirna的定量检测，包括但不限于癌症筛查、疾病诊断、科学研究等。
附图说明
[0029]
图1是本发明多mirna位点联合检测方法的流程示意图。
[0030]
图2是本发明实施例1hsa-let-7c-5p特异性检测结果。
[0031]
图3是本发明实施例2乳腺癌样本多重检测结果。
具体实施方式
[0032]
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0033]
以下实施例中，
[0034]
连接酶及10
×
连接酶buffer采用thermo scientific
tm t4 dna ligase，el0011；
[0035]
等温扩增酶10
×
等温扩增酶buffer采用thermo scientific
tm phi29 dna polymerase，ep0091；
[0036]
杂交液配方：0.4m nacl，0.2m tris，0.016％triton x-100，ph＝8.0，4℃保存；
[0037]
磁珠采用magplex-tag microspheres，
[0038]
显色反应液配方：每80μl杂交液中加入1μl sape，厂家：moss sape-001g75，lifes-886。
[0039]
如未有特殊说明，实施例中各个步骤均可采用本领域现有材料及常规技术手段来实现。
[0040]
实施例1.检测特异性分析
[0041]
一、引物及探针设计原则
[0042]
1.设计两条通用引物(引物f、引物r)，均为非人源序列，且经过序列比对，不与已知的人源dna及rna序列相通，或相似超过4个连续碱基；通用引物f的5
′
端带有生物素标记。
[0043]
2.通用引物序列长度为18-25bp，tm值为55-65℃。
[0044]
3.根据待检测mirna序列，按照如下原则，设计1条特异性单链dna探针：
[0045]
1)长度80-100nt；
[0046]
2)核酸序列从5
′
端到3
′
端依次是与mirna的5
′
端8-14个碱基反向互补序列，特异性tag序列c以及通用引物r反向互补序列，通用引物f序列和与mirna的3
′
端剩余所有碱基反向互补的序列；
[0047]
3)探针5
′
端有磷酸化修饰。
[0048]
二、hsa-let-7c-5p特异性分析
[0049]
1.合成标准品，并按照步骤一的方法，进行引物、探针设计及合成。
[0050]
1)合成通用引物，序列如下：
[0051]
通用引物f：biotin-ccagataagggtgttatg(seq id no：1)，其中biotin表示生物素修饰；
[0052]
通用引物r：gaatgggcggattgcct(seq id no：2)。
[0053]
2)合成hsa-let-7a-5p、hsa-let-7b-5p、hsa-let-7c-5p标准品，序列如下：
[0054]
hsa-let-7a-5p:ugagguaguagguuguauaguu(seq id no：3)
[0055]
hsa-let-7b-5p:ugagguaguagguugugugguu(seq id no：4)
[0056]
hsa-let-7c-5p:ugagguaguagguuguaugguu(seq id no：5)。
[0057]
3)合成hsa-let-7c-5p的探针，序列如下：
[0058]
hsa-let-7c-5p-l：
[0059]
p-ctactacctcacaatttacatttcactttcttatcaggcaatccgcccattcagcgagtcaaccagataagggtgttatgaaccatacaac(seq id no：6)，其中p表示磷酸化修饰。
[0060]
2.mirna检测
[0061]
hsa-let-7a-5p、hsa-let-7b-5p、hsa-let-7c-5p标准品干粉分别加无酶水溶解后，稀释至10
15
拷贝/ml，10倍梯度稀释标准品，均取10
10
拷贝/ml作为标准品模板，使用hsa-let-7c-5p-l分别检测三种样本。
[0062]
按照下述步骤进行检测：
[0063]
1)取1μl上述模板，向反应体系中加入：1μl探针hsa-let-7c-5p-l，1μl10
×
连接酶buffer，补水至10μl；
[0064]
2)上述反应体系在pcr仪中进行杂交反应，程序为：85℃2min，缓慢降温至22℃，保持2h；
[0065]
3)取2μl产物，加入1μl连接酶，2μl10
×
连接酶buffer，补水至20μl；
[0066]
4)上述反应体系在pcr仪中进行连接反应，程序为：25℃30min，65℃10min；
[0067]
5)取20μl产物，加入0.5μl等温扩增酶，5μl 10
×
等温扩增酶buffer，2μl通用引物f，2μl通用引物r，补水至50μl；
[0068]
6)上述反应体系在pcr仪中进行等温扩增反应，程序为：37℃6h，65℃10min；
[0069]
7)向96孔板中加入10μl产物，30μl杂交液，3μl磁珠，补水至50μl，封膜，在pcr仪中进行反应，程序为：90℃，80s；37℃，20min；
[0070]
8)杂交反应结束后，将96孔板置于磁力架上2min，吸弃上清，加入25μl显色反应液，封膜，在pcr仪中进行反应，程序为：37℃，10min；
[0071]
9)显色反应结束后，从pcr仪取下立即置于磁力板上静置60s，弃去上清。加入50μl杂交液(该步骤中采用与步骤7)相同的杂交液)，震荡混匀20-30s，置于磁力板静置60s后弃去上清，重复1次。加入杂交液75μl，震荡混匀30s；
[0072]
10)使用luminex 200进行上机检测。
[0073]
3.实验结果如图2所示，nc为阴性对照，hsa-let-7c-5p结果大于nc检测值3倍而hsa-let-7a-5p、hsa-let-7b-5p结果均小于nc检测值3倍，证明探针hsa-let-7c-5p-l能够特异性的检测到hsa-let-7c-5p，而不能检测仅有1个碱基差异的片段，证明该方法特异性较好。
[0074]
实施例2.多重检测分析
[0075]
1.血浆样本mirna提取：
[0076]
使用天根生化科技(北京)有限公司生产的血清/血浆mirna提取分离试剂盒(dp503)，按照说明书方法，对5个乳腺癌患者及5个健康对照血浆(来自合作医院的患者及健康人血浆样本，已签署知情同意书，且样本经过测序验证)进行mirna提取。
[0077]
2.按照实施例1说明的方法，进行探针设计及合成。
[0078]
合成hsa-mir-200c-3p、hsa-mir-101-3p、hsa-mir-372-3p、hsa-mir-105-5p标准品，序列如下：
[0079]
hsa-mir-200c-3p:uaauacugccggguaaugaugga(seq id no：7)
[0080]
hsa-mir-101-3p:uacaguacugugauaacugaa(seq id no：8)
[0081]
hsa-mir-372-3p:aaagugcugcgacauuugagcgu(seq id no：9)
[0082]
hsa-mir-105-5p:uaacacugucugguaaagaugg(seq id no：10)
[0083]
设计并合成探针，序列如下：
[0084]
hsa-mir-200c-3p-l：
[0085]
p-ccggcagtattaacaaatatctaactactatcacaatcacaatccgcccattcagcgagtcaaccagataagggtgttgcgtccatcattac(seq id no：11)，其中p表示磷酸化修饰；
[0086]
hsa-mir-101-3p-l：
[0087]
p-acagtactgtacaatttacatttcactttcttatctcacaatccgcccattcagcgagtcaaccag
ataagggtgttgcgttcagttatc(seq id no：12)，其中p表示磷酸化修饰；
[0088]
hsa-mir-372-3p-l：
[0089]
p-gtcgcagcactttttaacaacttatacaaacacaaactcacaatccgcccattcagcgagtcaaccagataagggtgttgcgacgctcaaat(seq id no：13)，其中p表示磷酸化修饰；
[0090]
hsa-mir-105-5p-l：
[0091]
p-ctgagcatttgaacatcaaattctttcaatatcttctcacaatccgcccattcagcgagtcaaccagataagggtgttgcgaccacaggagt(seq id no：14)，其中p表示磷酸化修饰。
[0092]
3.多重检测
[0093]
各种标准品干粉分别加无酶水溶解后，按1：1比例混合并稀释至10
14
拷贝/ml，按照实施例2中的方法，分别配制每种标准品的梯度稀释液。使用稀释后各组分浓度均为10
10
拷贝/ml的标准品及提取的乳腺癌患者/健康人血浆样本中的mirna作为模板，将所有探针按相同浓度混合，作为多重检测探针，按照下述步骤进行检测：
[0094]
1)取10μl上述模板，向反应体系中加入：2μl探针，2μl10
×
连接酶buffer，补水至20μl；
[0095]
2)上述反应体系在pcr仪中进行杂交反应，程序为：85℃2min，缓慢降温至22℃，保持2h；
[0096]
3)取10μl产物，加入1μl连接酶，2μl10
×
连接酶buffer，补水至20μl；
[0097]
4)上述反应体系在pcr仪中进行连接反应，程序为：25℃30min，65℃10min；
[0098]
5)取20μl产物，加入0.5μl等温扩增酶，5μl10
×
等温扩增酶buffer，3μl引物f，3μl引物r，补水至50μl；
[0099]
6)上述反应体系在pcr仪中进行等温扩增反应，程序为：37℃6h，65℃10min；
[0100]
7)向96孔板中加入10μl产物，30μl杂交液，3μl磁珠，补水至50μl，封膜，在pcr仪中进行反应，程序为：90℃，80s；37℃，20min；
[0101]
8)杂交反应结束后，将96孔板置于磁力架上2min，吸弃上清，加入25μl显色反应液，封膜，在pcr仪中进行反应，程序为：37℃，10min；
[0102]
9)显色反应结束后，从pcr仪取下立即置于磁力板上静置60s，弃去上清。加入50μl杂交液，震荡混匀20-30s，置于磁力板静置60s后弃去上清，重复1次。加入杂交液75μl，震荡混匀30s；
[0103]
10)使用luminex 200进行上机检测。
[0104]
4.实验结果如图3所示，nc为阴性对照，pc为阳性对照，阳性对照几个位点的检测结果均大于其对应值n值的3倍，证明该方法可以同时进行多个位点的检测；5个患者样本均有不少于2个位点为阳性，而健康对照均为阳性结果均小于2个，证明该方法能够较好地将乳腺癌癌样本区分出来。