一株具有抑制幽门螺杆菌功能的罗伊氏乳杆菌SF-L-25及其应用的制作方法

一株具有抑制幽门螺杆菌功能的罗伊氏乳杆菌sf-l-25及其应用
技术领域
[0001]
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株具有抑制幽门螺杆菌功能的罗伊氏乳杆菌 sf-l-25及其应用。


背景技术：

[0002]
现代社会生活节奏加快、工作压力大以及饮食习惯不健康，加剧了胃肠道疾病的发生率，其中胃癌的发病率和死亡率长期居高不下，极大地威胁着人们的健康。幽门螺杆菌是公认的慢性活动性胃炎、胃十二指肠溃疡、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤、胃癌等消化系统疾病的主要致病因素，幽门螺杆菌(helicobacter pylori)是一种单极、多鞭毛、末端钝圆、螺旋形弯曲的细菌，在胃粘膜上皮细胞表面常呈典型的螺旋状或弧形，根除幽门螺杆菌是防治这些疾病的重要措施。对于幽门螺杆菌感染，目前我国临床上常规的治疗方案是三联或四联疗法，都是必须从基础抗生素用起，而且是至少使用两种，由于抗生素耐药性高，导致幽门螺杆菌耐药率的增加，且仍然存在幽门螺杆菌感染复发率高的现象。其次，长期不合理应用抗生素会引起胃肠功能紊乱及胃肠道菌群失调等不良反应，进而影响机体健康。生物治疗已被全世界公认为安全绿色的新型治疗方法，寻找可有效抑制幽门螺杆菌的微生物菌种成为解决问题的关键。


技术实现要素：

[0003]
针对现有技术中存在的问题，本发明提供一株具有抑制幽门螺杆菌功能的罗伊氏乳杆菌 sf-l-25及其应用，有效解决了在防治幽门螺杆菌感染过程中长期不合理使用抗生素引起肠胃功能紊乱及胃肠道菌群失调等不良反应的问题。
[0004]
本发明的目的之一在于提供一株具有抑制幽门螺杆菌功能的罗伊氏乳杆菌sf-l-25，所述罗伊氏乳杆菌sf-l-25已于2020年10月26号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为：cgmcc no.20956；分类命名为罗伊氏乳杆菌 (lactobacillus reuteri)；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0005]
所述罗伊氏乳杆菌sf-l-25从人体胃粘液中分离筛选获得。
[0006]
本发明的目的之二在于提供一种所述罗伊氏乳杆菌sf-l-25在制备食品或制备药品中的应用。
[0007]
所述含有罗伊氏乳杆菌sf-l-25菌粉的食品类型包括益生菌固体饮料。
[0008]
所述益生菌固体饮料，以质量份数计，包括以下原料：罗伊氏乳杆菌sf-l-25菌粉2-3 份、果粉20-30份、低聚果糖30-50份、麦芽糊精粉10-20份和柠檬酸1-2份。
[0009]
所述益生菌固体饮料的制备方法，包括如下步骤：将罗伊氏乳杆菌sf-l-25接种到mrs 培养基平板中，接种量为2％，在37℃下培养后，对mrs菌液进行离心、真空冷冻干燥处理，获得菌粉，将菌粉、果粉、低聚果糖粉、麦芽糊精和柠檬酸按配比混合后即得所述益生菌
固体饮料。
[0010]
所述mrs培养基包括以下组分：牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，蛋白胨10.0g，葡萄20.0g， k2hpo42.0g，醋酸钠5.0g，mgso4·
7h2o 0.2g，mnso4·
4h2o0.05g，吐温801.0g，柠檬酸三铵2.0g，琼脂15.0g，加蒸馏水至1000ml。
[0011]
所述益生菌固体饮料中益生菌活菌数为1
×
106cfu/g～1
×
107cfu/g。
[0012]
本发明的目的之三在于提供一种所述罗伊氏乳杆菌sf-l-25在制备缓解或治疗胃溃疡、十二指肠溃疡或胃肠道不适的保健食品或辅助型药剂中的应用。
[0013]
本发明的有益效果在于，
[0014]
本发明所提供的罗伊氏乳杆菌sf-l-25菌株是从健康人体胃粘液中分离筛选获得，安全性高，具有较强的稳定性，抑制幽门螺杆菌生长，有效解决了在防治幽门螺杆菌感染过程中长期不合理使用抗生素引起肠胃功能紊乱及胃肠道菌群失调等不良反应的问题；同时罗伊氏乳杆菌sf-l-25显著的功能特性使其在益生菌固体饮料中具有广泛的应用价值。
附图说明
[0015]
图1为实施例2不同实验组抑菌圈大小对比图，其中，0号代表对照组，1号代表试验组 1，2号代表试验组2，3号代表试验组3；
[0016]
图2为本发明提供的罗伊氏乳杆菌sf-l-25缓解gsrs的作用效果；
[0017]
图3为本发明提供的罗伊氏乳杆菌sf-l-25对血清炎症因子il-8水平的影响；
[0018]
图4为本发明提供的罗伊氏乳杆菌sf-l-25对血清炎症因子tnf-α水平的影响；
[0019]
图5为本发明提供的罗伊氏乳杆菌sf-l-25对血清pgⅰ水平的影响；
[0020]
图6为本发明提供的罗伊氏乳杆菌sf-l-25对血清pgⅱ水平的影响。
具体实施方式
[0021]
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
[0022]
生物材料保藏说明
[0023]
生物材料的分类命名：罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)
[0024]
生物材料的菌株编号：sf-l-25
[0025]
生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0026]
生物材料的保藏单位简称：cgmcc
[0027]
生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101
[0028]
生物材料的保藏日期：2020年10月26号
[0029]
生物材料的保藏中心登记入册编号：cgmcc no.20956
[0030]
本发明实施例中，以下缩写所代表的意义分别为：
[0031]
gsrs：胃肠道症状评定量表；
[0032]
il-8：血清白细胞介素-8；
[0033]
tnf-α：肿瘤坏死因子-α；
[0034]
pgⅰ：胃蛋白酶原ⅰ；
[0035]
pgⅱ：胃蛋白酶原ⅱ；
[0036]
pgⅲ：胃蛋白酶原ⅲ；
[0037]
mrs：乳酸细菌培养基；
[0038]
h.pylori：幽门螺杆菌；
[0039]
ags：人胃腺癌细胞。
[0040]
实施例1罗伊氏乳杆菌sf-l-25的筛选
[0041]
①
菌种来源：健康人体胃液
[0042]
②
平板培养基：牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，蛋白胨10.0g，葡萄20.0g，k2hpo42.0g，醋酸钠5.0g，mgso4·
7h2o 0.2g，mnso4·
4h2o0.05g，吐温801.0g，柠檬酸三铵2.0g，琼脂15.0g，加蒸馏水至1000ml。
[0043]
③
菌株的分离
[0044]
对样品液体做十倍梯度稀释，每个梯度取100μl均匀涂布于mrs固体平板培养基上，随后取出置于厌氧罐中，37℃厌氧培养过夜。次日可见平板上长有形态大小各异的菌落，挑取若干乳酸菌的特征菌落作二代划线纯化处理，平板厌氧活化1天，得培养物，随后做菌株鉴定。
[0045]
④
16s rrna序列的测定
[0046]
16s rrna扩增引物使用的是27f：5'-agagtttgatcmtggctcag-3'和1492r：5'
-ꢀ
ggttaccttgttacgactt-3'。产物委托有资质的第三方实验室进行sanger测序。应用 blast算法在genbank数据库中把序列和16srrna基因进行比较。blast分析，表明菌株 sf-l-25十分接近罗伊氏乳杆菌(99％亲缘)。
[0047]
检测结果：
[0048]
agtttgattcaggctcaggatgaacgccggcggtgtgcctaatacatgcaagtcgt acgcactggcccaactgattgatggtgcttgcacctgattgacgatggatcaccagtga gtggcggacgggtgagtaacacgtaggtaacctgccccggagcgggggataacatttg gaaacagatgctaataccgcataacaacaaaagccacatggcttttgtttgaaagatgg ctttggctatcactctgggatggacctgcggtgcattagctagttggtaaggtaacggct taccaaggcgatgatgcatagccgagttgagagactgatcggccacaatggaactgaga cacggtccatactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatgggcgcaagcc tgatggagcaacaccgcgtgagtgaagaagggtttcggctcgtaaagctctgttgttg gagaagaacgtgcgtgagagtaactgttcacgcagtgacggtatccaaccagaaagtc acggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggatt tattgggcgtaaagcgagcgcaggcggttgcttaggtctgatgtgaaagccttcggctt aaccgaagaagtgcatcggaaaccgggcgacttgagtgcagaagaggacagtggaac tccatgtgtagcggtggaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggct gtctggtctgcaactgacgctgaggctcgaaagcatgggtagcgaacaggattagatac cctggtagtccatgccgtaaacgatgagtgctaggtgttggagggtttccgcccttcag tgccggagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaact caaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcta cgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcttgcgctaaccttagagataaggcgttccc ttcggggacgcaatgacaggtggtgcatggtcgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttg gg
ttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgttactagttgccagcattaagttgggcac tctagtgagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggacgacgtcagatcatcat gccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacggtacaacgagtcgcaagct cgcgagagtaagctaatctcttaaagccgttctcagttcggactgtaggctgcaactcg cctacacgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttc ccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtttgtaacgcccaaagtcggtg gcctaacctttatggagggagccgcctaaggcgggacagatgactggggtgaagtcgt aacaaggtaacca
[0049]
实施例2罗伊氏乳杆菌sf-l-25抑菌能力测定
[0050]
罗伊氏乳杆菌sf-l-25活化2代，菌悬液经0.22μm无菌滤膜过滤，得到罗伊氏乳杆菌 sf-l-25发酵上清液。活化2代的h.pylori菌悬液调整为108cfu/ml，取100μl涂布于哥伦比亚血平板，牛津杯中加入150μl罗伊氏乳杆菌sf-l-25发酵上清液，对照组添加等量的蒸馏水，正置于三气培养箱中培养72h，测定抑菌圈直径(见图1)。做1个对照和3个平行实验。
[0051]
表1罗伊氏乳杆菌sf-l-25抑菌能力
[0052]
组别抑菌圈/(mm)对照0试验组112.92试验组212.38试验组312.15
[0053]
结果表明，罗伊氏乳杆菌sf-l-25抑菌效果明显。
[0054]
实施例3粘附能力测定
[0055]
人胃腺癌细胞(ags)接种于96孔板(2
×
104个/孔)过夜培养，待细胞贴壁后以感染复数100加入f-12重悬的幽门螺杆菌和罗伊氏乳杆菌sf-l-25分别培养2h，再加入200μl 尿素酶试剂培养3h，测定550nm波长的吸光值，做1个对照和3个平行实验。
[0056]
表2罗伊氏乳杆菌sf-l-25抑制幽门螺杆菌粘附能力测定
[0057]
组别粘附率/(％)对照100试验组169.62试验组270.38试验组369.25
[0058]
结果表明，罗伊氏乳杆菌sf-l-25处理后幽门螺杆菌对ags的粘附率显著下降。
[0059]
实施例4
[0060]
一种含有所述罗伊氏乳杆菌sf-l-25的益生菌固体饮料，以质量份数计，包括以下原料：罗伊氏乳杆菌sf-l-25菌粉2份、果粉24份、低聚果糖50份、麦芽糊精粉20份和柠檬酸2 份。
[0061]
将罗伊氏乳杆菌sf-l-25接种到mrs培养基平板中，接种量为2％，在37℃下培养后，对mrs菌液进行离心、真空冷冻干燥处理，获得菌粉，将菌粉、果粉、低聚果糖粉、麦芽糊精和柠檬酸按配比混合后即得所述益生菌固体饮料。
[0062]
所述mrs培养基包括以下组分：牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，蛋白胨10.0g，葡萄20.0g， k2hpo42.0g，醋酸钠5.0g，mgso4·
7h2o 0.2g，mnso4·
4h2o0.05g，吐温801.0g，柠檬酸三铵2.0g，琼脂15.0g，加蒸馏水至1000ml。
[0063]
所述益生菌固体饮料中益生菌活菌数为1
×
107cfu/g。
[0064]
试验例1
[0065]
将实施例4所得罗伊氏乳杆菌sf-l-25益生菌固体饮料治疗幽门螺杆菌相关性慢性胃炎的临床试验验证
[0066]
招募受试者为通过13c/14c呼气试验(urea breath test，ubt)、快速尿素酶或组织学检查，于入组3个月内诊断为h.pylori感染，且既往未进行抗h.pylori治疗的患者。若患者在纳入研究前的1个月内服用了抗生素或乳杆菌产品、既往有胃肠道手术史、有历史性的严重疾病或者精神疾病将被排除在外。实验招募了26名的h.pylori阳性患者，通过随机序列将受试者随机分为2组，即安慰剂和罗伊氏乳杆菌sf-l-25组。患者每天早晚2次服用益生菌固体饮料(1
×
107cfu/g，2g/包)或安慰剂产品，为期1个月。
[0067]
表3罗伊氏乳杆菌sf-l-25治疗幽门螺杆菌相关性慢性胃炎的临床试验验证
[0068]
组别人数阳性阴性阴性率/(％)安慰剂组1311215.38罗伊氏乳杆菌sf-l-25菌粉组138561.54
[0069]
结果显示，服用罗伊氏乳杆菌sf-l-25菌粉1个月后，试验组患者的根除率与安慰剂组相比显著提高(61.54％vs 15.38％，p<0.05)。
[0070]
对受试者进行血清胃功能检测，结果见附图2-6。
[0071]
图2为本发明提供的罗伊氏乳杆菌sf-l-25益生菌固体饮料缓解gsrs的作用效果，可以看出仅仅服用安慰剂的对照组前后变化不大，而服用罗伊氏乳杆菌sf-l-25益生菌固体饮料的试验组中gsrs评分显著降低，说明胃肠健康显著改善。
[0072]
图3为本发明提供的罗伊氏乳杆菌sf-l-25益生菌固体饮料对血清炎症因子il-8水平的影响，可以看出安慰剂对照组前后变化不大，服用罗伊氏乳杆菌sf-l-25益生菌固体饮料的试验组中血清炎症因子il-8水平提高2-5ng/l，说明罗伊氏乳杆菌sf-l-25益生菌固体饮料可刺激机体产生细胞因子，提高机体免疫。
[0073]
图4为本发明提供的罗伊氏乳杆菌sf-l-25益生菌固体饮料对血清炎症因子tnf-α水平的影响，可以看出安慰剂对照组前后变化不大，服用罗伊氏乳杆菌sf-l-25益生菌固体饮料的试验组中血清炎症因子il-8水平提高2-3ng/l，说明罗伊氏乳杆菌sf-l-25可刺激机体产生细胞因子，提高机体免疫。
[0074]
图5和图6为本发明提供的罗伊氏乳杆菌sf-l-25益生菌固体饮料对血清pgⅰ、pgⅱ水平的影响，可以看出服用罗伊氏乳杆菌sf-l-25益生菌固体饮料的试验组pgⅰ升高、pg
ꢀⅱ
水平降低，pgⅰ/pgⅱ比值升高。说明罗伊氏乳杆菌sf-l-25益生菌固体饮料可改善胃粘膜的分泌功能。
[0075]
通过优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求所述的保护范围为准。