本发明属于生物制药领域，具体涉及一种酶法制备艾沙度林中间体的方法。
背景技术：
伊卢多啉(Eluxadoline)又称为艾沙度林，其化学名称为4-(氨基羰基)-N-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-2,6-二甲基-L-苯丙氨酸，商品名为Viberzi，2015年5月27日获FDA批准上市，用于治疗腹泻性肠易激综合症，据权威机构统计，这种病症的患者在欧洲和美国高达2800万，市场前景广阔。艾沙度林结构式如下所示
其中化合物I为伊卢多啉制备过程中所需的关键中间体，该中间体收率、成本直接影响伊卢多啉的产品纯度和成本，故化合物I的制备方法已引起科研工作者的高度重视。
Chaozhong Cai等人描述了一种制备化合物I的方法(Tetrahedron,2005,61,6836-6838.)，其合成路线如下所示：
该方法以N-Boc-2,6-二甲基-L-酪氨酸为原料经4步反应得到化合物I，但是存在起始物料价格昂贵、总收率低等缺点。
现有文献报道的化合物I的制备方法均为化学法制备，存在反应条件苛刻、收率较低、环境污染严重等问题，工业化生产受到极大阻碍。与化学合成法相比，生物合成法具有反应条件温和、转化率高等优点近年来受到广泛关注，目前未见生物法制备艾沙度林中间体的公开文献。
技术实现要素：
为了克服现有技术所存在的上述缺陷，本发明公开了一种酶法制备艾沙度林中间体的方法。
具体工艺路线如下所示：
化合物V在腈水合酶的作用下进行酶催化反应得到化合物I，其中R1选自C1-C6的烷基、苄基或氢原子，优选为氢原子；R2选自Boc(叔丁氧羰基)、Cbz(苄氧羰基)、Fmoc(芴甲氧羰基)、Teoc(三甲基硅乙氧羰基)或氢原子，优选为叔丁氧羰基。
进一步说，腈水合酶为市场上可以购得的NHT101～NHT124，来自尚科生物医药(上海)有限公司。
进一步说，腈水合酶以酶粉形式、含腈水合酶的细胞破碎液或全细胞的形式加入，优选以酶粉形式加入。
进一步说，该酶法反应在温度为30～40℃，pH＝6～8条件下进行。
进一步说，该酶法反应将化合物V、腈水合酶和缓冲液按一定比例混合反应得到产物，其中化合物V的浓度为30～100g/L，腈水合酶的浓度为5～10g/L和所述缓冲液的浓度为10～100mM。
进一步说，化合物V的制备方法包括如下步骤：
步骤a)：化合物II与锌粉在有机溶剂中反应生成化合物III；
步骤b)：化合物III与化合物IV在钯催化剂和膦配体的催化下反应得到化合物V；
其中化合物II、III、V、I的R1和R2所代表的基团相同。
进一步说，所述有机溶剂为二甲基乙酰胺或二甲基甲酰胺，优选为二甲基甲酰胺。
进一步说，钯催化剂为Pd2(dba)3，膦配体为三(邻甲苯基)膦。
进一步说，步骤b)中钯催化剂与化合物IV的质量比为0.001～0.1，膦配体与化合物IV的质量比为0.001～0.1。
一种酶法制备下式化合物(I-A)的方法，
所述方法包括，
步骤a)：化合物II-A与锌粉在有机溶剂中反应生成化合物III-A；所述有机溶剂为二甲基乙酰胺或二甲基甲酰胺，优选为二甲基甲酰胺。
步骤b)：化合物III-A与化合物IV在钯催化剂和膦配体的催化下反应得到化合物V-A；钯催化剂为Pd2(dba)3，膦配体为三(邻甲苯基)膦。
步骤c)：化合物V-A经过碱性条件下酯的水解和腈水合酶作用下氰基还原制备化合物I-A，所述碱性条件为LiOH，NaOH或KOH，所述腈水合酶选自尚科生物医药(上海)有限公司自有的腈水合酶酶库，即NHT101～NHT124。
与现有化学合成方法相比，本发明提供了一种制备艾沙度林中间体的绿色技术方案，该方案反应条件温和，收率较高，对环境友好，具有良好的工业应用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术内容作进一步的阐述，其目的是为了更好的理解本发明的内容，但本发明的保护范围不限于此。
实施例1
(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(化合物V)的制备
将锌粉(2.17克)、DMF(5.4毫升)和1,2-二溴乙烷(0.36克)加入反应瓶中，加热至100℃，保温5分钟。冷却至室温，加入三甲基氯硅烷(0.13g),将(R)-3-碘代-N-Boc-丙氨酸甲酯(化合物II，7.1克)的DMF(5.4毫升)溶液在20℃下滴加入反应体系，搅拌1小时。25℃保温反应过夜得锌试剂，直接用于下一步反应。
将2,6-二甲基-4-氰基碘苯(2.8克)、三(邻甲苯基)膦(0.02克)、Pd2(dba)3(0.03克)和DMF(6毫升)加入反应瓶中，加热至90℃，滴入上述制备的锌试剂，0.5小时滴加完。TLC显示原料反应完全，冷却至15～20℃。加入饱和氯化铵溶液(20毫升)和乙酸乙酯(20毫升)，搅拌，分层，有机相用饱和氯化铵溶液(20毫升)洗涤、水(20毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(化合物V，3.29克，收率90％)。
(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(化合物I)的制备
于30mL反应容器中加入10mM的磷酸盐缓冲液(10mL，pH＝7.0)，用磷酸调节pH至7.0，加入上述制备得到的化合物V(1.5克)，搅拌均匀后加入腈水合酶酶粉NHT101(0.15克)定容至15mL，30℃下磁力搅拌敞口反应，反应过程中用NaOH(3M)控制反应pH在7.0左右，TLC检测反应进程。反应结束后70℃保温2h使反应液中蛋白质变性，过滤去除蛋白质，加NaOH(3M)调节pH＝9，等体积乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏获得(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(化合物I，1.55g，收率98％)，HPLC检测S型产物ee值为99.1％。
实施例2
百克级(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(化合物V)的制备
将锌粉(216.6克)、DMF(540毫升)和1,2-二溴乙烷(36克)加入反应瓶中，加热至100℃，保温5分钟。冷却至室温，加入三甲基氯硅烷(13克)，将(R)-3-碘代-N-Boc-丙氨酸甲酯(化合物II，710克)的DMF(540毫升)溶液在20℃下滴加入反应体系，搅拌1.5小时。25℃保温反应过夜得锌试剂，直接用于下一步反应。
将2,6-二甲基-4-氰基碘苯(280克)、三(邻甲苯基)膦(2克)、Pd2(dba)3(3克)和DMF(600毫升)加入反应瓶中，加热至90℃，滴入上述制备的锌试剂，1.5小时滴加完。TLC显示原料反应完全，冷却至15～20℃。向反应液中加入硅胶(100克)，搅拌1小时过滤。滤液中加入饱和氯化铵溶液(4500毫升)，搅拌1小时过滤，滤饼烘干得(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(化合物V，333克，收率92％)。
百克级(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(化合物I)的制备
向带夹套的玻璃反应釜(5L)中加入10mM的磷酸盐缓冲液(2L，pH＝7.0)，用磷酸调节pH至7.0，加入上述制备得到的化合物V(150克)，搅拌均匀后加入腈水合酶酶粉NHT101(10克)定容至3L，30℃下磁力搅拌敞口反应，反应过程中用NaOH(3M)控制反应pH在7.0左右，TLC检测反应进程。反应结束后70℃保温2h使反应液中蛋白质变性，过滤去除蛋白质，加NaOH(3M)调节pH＝9，等体积乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏获得(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(化合物I，151.8克，收率96％)，HPLC检测S型产物ee值为99.3％。
实施例3
(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Boc-苯丙氨酸乙酯(化合物V)的制备
将锌粉(1.08克)、DMF(2.7毫升)和1,2-二溴乙烷(0.18克)加入反应瓶中，加热至90℃，保温5分钟。冷却至室温，加入三甲基氯硅烷(0.07克),将(R)-3-碘代-N-Boc-丙氨酸乙酯(化合物II，3.3克)的DMF(2.7毫升)溶液在20℃下滴加入反应体系，搅拌0.5小时。20℃保温反应过夜得锌试剂，直接用于下一步反应。
将2,6-二甲基-4-氰基碘苯(1.4克)、三(邻甲苯基)膦(0.01克)、Pd2(dba)3(0.15克)和DMF(3毫升)加入反应瓶中，加热至90℃，滴入上述制备的锌试剂，0.5小时滴加完。TLC显示原料反应完全，冷却至15～20℃。加入饱和氯化铵溶液(10毫升)和乙酸乙酯(10毫升)，搅拌，分层，有机相用饱和氯化铵溶液(10毫升)洗涤、水(10毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Boc-苯丙氨酸乙酯(化合物V，1.66克，收率88％)。
(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Boc-苯丙氨酸乙酯(化合物I)的制备
于50mL反应容器中加入10mM的磷酸盐缓冲液(20mL，pH＝7.0)，用磷酸调节pH至8.0，加入上述制备得到的化合物V(1.5克)，搅拌均匀后加入腈水合酶酶粉NHT110(0.12克)定容至30mL，35℃下磁力搅拌敞口反应，反应过程中用NaOH(3M)控制反应pH在8.0左右，TLC检测反应进程。反应结束后70℃保温2h使反应液中蛋白质变性，过滤去除蛋白质，加NaOH(3M)调节pH＝9，等体积乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏获得(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Boc-苯丙氨酸乙酯(化合物I，1.53克，收率97％)，HPLC检测S型产物ee值为99.0％。
实施例4
(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Cbz-苯丙氨酸甲酯(化合物V)的制备
将锌粉(2.17克)、DMF(5.4毫升)和1,2-二溴乙烷(0.36克)加入反应瓶中，加热至100℃，保温5分钟。冷却至室温，加入三甲基氯硅烷(0.13克),将(R)-3-碘代-N-Cbz-丙氨酸甲酯(化合物II，7.9克)的DMF(5.4毫升)溶液在20℃下滴加入反应体系，搅拌1小时。25℃保温反应过夜得锌试剂，直接用于下一步反应。
将2,6-二甲基-4-氰基碘苯(2.8克)、三(邻甲苯基)膦(0.02克)、Pd2(dba)3(0.03克)和DMF(6毫升)加入反应瓶中，加热至90℃，滴入上述制备的锌试剂，0.5小时滴加完。TLC显示原料反应完全，冷却至15～20℃。加入饱和氯化铵溶液(20毫升)和乙酸乙酯(20毫升)，搅拌，分层，有机相用饱和氯化铵溶液(20毫升)洗涤、水(20毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Cbz-苯丙氨酸甲酯(化合物V，3.66克，收率91％)。
(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Cbz-苯丙氨酸甲酯(化合物I)的制备
于100mL反应容器中加入10mM的磷酸盐缓冲液(20mL，pH＝7.0)，用磷酸调节pH至6.5，加入上述制备得到的化合物V(1.5克)，搅拌均匀后加入腈水合酶酶粉NHT121(0.12克)定容至30mL，30℃下磁力搅拌敞口反应，反应过程中用NaOH(3M)控制反应pH在7.0左右，TLC检测反应进程。反应结束后75℃保温2h使反应液中蛋白质变性，过滤去除蛋白质，加NaOH(3M)调节pH＝9，等体积乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏获得(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Cbz-苯丙氨酸甲酯(化合物I，1.54克，收率98％)，HPLC检测S型产物ee值为99.0％。
实施例5
(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Boc-苯丙氨酸(化合物I-A)的制备
将锌粉(2.17克)、DMF(5.4毫升)和1,2-二溴乙烷(0.36克)加入反应瓶中，加热至100℃，保温5分钟。冷却至室温，加入三甲基氯硅烷(0.13克),将(R)-3-碘代-N-Boc-丙氨酸甲酯(7.1克)的DMF(5.4毫升)溶液在20℃下滴加入反应体系，搅拌1小时。25℃保温反应过夜得锌试剂，直接用于下一步反应。
将2,6-二甲基-4-氰基碘苯(2.8克)、三(邻甲苯基)膦(0.02克)、Pd2(dba)3(0.03克)和DMF(6毫升)加入反应瓶中，加热至90℃，滴入上述制备的锌试剂，0.5小时滴加完。TLC显示原料反应完全，冷却至15～20℃。加入饱和氯化铵溶液(20毫升)和乙酸乙酯(20毫升)，搅拌，分层，有机相用饱和氯化铵溶液(20毫升)洗涤、水(20毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(3.29克，收率90％)。
将(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(3.29克)加入到四氢呋喃(15毫升)和水(15毫升)，搅拌下降温至0～5℃。向溶液中滴加一水合氢氧化锂(0.62克)的水(10毫升)溶液。搅拌1.5小时，TLC显示反应完全。加入乙酸乙酯(15毫升*3)提取，水相中滴加1M的盐酸调pH＝2，过滤，水(20ml)洗涤，40℃真空干燥8小时得(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Boc-苯丙氨酸(化合物V，3.03克，96％)。
于100mL反应容器中加入10mM的磷酸盐缓冲液(20mL，pH＝7.0)，用磷酸调节pH至7.5，加入上述制备得到的(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Boc-苯丙氨酸(1.5克)，搅拌均匀后加入腈水合酶酶粉NHT101(0.1克)定容至30mL，25℃下磁力搅拌敞口反应，反应过程中用NaOH(3M)控制反应pH在7.0左右，TLC检测反应进程。反应结束后70℃保温2h使反应液中蛋白质变性，过滤去除蛋白质，加NaOH(3M)调节pH＝9，等体积乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏获得(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Boc-苯丙氨酸(化合物I-A，1.54克，收率97％)，HPLC检测S型产物ee值为99.5％。
实施例6
(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Boc-苯丙氨酸(化合物I-A)的制备
将锌粉(2.17克)、DMF(5.4毫升)和1,2-二溴乙烷(0.36克)加入反应瓶中，加热至100℃，保温5分钟。冷却至室温，加入三甲基氯硅烷(0.13克),将(R)-3-碘代-N-Boc-丙氨酸甲酯(7.1克)的DMF(5.4毫升)溶液在20℃下滴加入反应体系，搅拌1小时。25℃保温反应过夜得锌试剂，直接用于下一步反应。
将2,6-二甲基-4-氰基碘苯(2.8克)、三(邻甲苯基)膦(0.02克)、Pd2(dba)3(0.03克)和DMF(6毫升)加入反应瓶中，加热至90℃，滴入上述制备的锌试剂，0.5小时滴加完。TLC显示原料反应完全，冷却至15～20℃。加入饱和氯化铵溶液(20毫升)和乙酸乙酯(20毫升)，搅拌，分层，有机相用饱和氯化铵溶液(20毫升)洗涤、水(20毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(3.29克，收率90％)。
于50mL反应容器中加入10mM的磷酸盐缓冲液(20mL，pH＝7.0)，用磷酸调节pH至7.0，加入上述制备得到的(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(3克)，搅拌均匀后加入腈水合酶酶粉NHT101(0.3克)定容至30mL，30℃下磁力搅拌敞口反应，反应过程中用NaOH(3M)控制反应pH在7.0左右，TLC检测反应进程。反应结束后75℃保温2h使反应液中蛋白质变性，过滤去除蛋白质，加NaOH(3M)调节pH＝9，等体积乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏获得(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(化合物I，3.1克，收率98％)，HPLC检测S型产物ee值为99.1％。
将(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(3.1克)加入到四氢呋喃(15毫升)和水(15毫升)，搅拌下降温至0～5℃。向溶液中滴加一水合氢氧化锂(0.62克)的水(10毫升)溶液。搅拌1.5小时，TLC显示反应完全。加入乙酸乙酯(15毫升*3)提取，水相中滴加1M的盐酸调pH＝2，过滤，水(20ml)洗涤，40℃真空干燥8小时得(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Boc-苯丙氨酸(化合物I-A，2.83克，95％)，HPLC检测S型产物ee值为99.2％。