基于重组κ‑卡拉胶酶制备卡拉胶寡糖的方法与流程

本发明涉基因工程领域，具体来讲涉及一种基于重组κ-卡拉胶酶制备卡拉胶寡糖的方法。

背景技术：

卡拉胶(Carrageenans)是以1,4-α-D-吡喃半乳糖和1,3-β-D-吡喃半乳糖为重复单元交替连接而成的硫酸线性多糖，主要存在于红藻纲海藻的细胞壁中。工业上使用的卡拉胶主要包括κ-、ι-和λ-三种。卡拉胶不但有凝胶、乳化、增稠、成膜和稳定分散等特性，而且能与其它食品胶共混并具有协同增效作用，因此在食品工业、日化工业及生化、医学研究等领域中，卡拉胶作为凝胶剂、稳定剂、持水剂悬浮剂和增稠剂等而被广泛应用。尽管卡拉胶具备良好的应用价值，但自身分子量大、溶解性差、可吸收性差和具有部分毒性等缺点，极大限制了其更为广泛的应用。卡拉胶寡糖(Carrageenan oligosaccharides)作为卡拉胶的降解产物，分子量较小、溶解性较好、稳定性和安全性都有所改善，同时因分子链上的活性基团充分暴露，其原有的活性得到提高，甚至产生了新的活性，进一步拓宽了卡拉胶的应用领域。

目前卡拉胶寡糖的制备有化学、物理和酶解三种方法。采用化学和物理等传统方法降解卡拉胶时，由于工艺复杂、反应条件不易控制，因而得到的卡拉胶寡糖聚合度不均一，无法进行大规模生产。相比较而言，利用卡拉胶酶水解生产卡拉胶寡糖的方法底物专一、产物均一，且反应条件温和，可以避免上述传统方法的缺点，因此卡拉胶降解酶被越来越多地研究和开发利用。稳定、连续、高效制备高质量的卡拉胶酶和优化酶解工艺是酶解法制备卡拉胶寡糖的前提条件，但目前酶解法制备卡拉加寡糖的工艺中高质量酶的来源是一个瓶颈问题。日本专利(专利号JP2000116376)使用了卡拉胶酶制备κ-卡拉胶寡糖，该方法首先从菌株中分离提取卡拉胶酶，再以此酶进行酶解得到寡糖混合体。由于此酶来源于海洋弧菌，菌株产酶条件不稳定，制备过程繁琐，生产周期长等特点，所以价格昂贵，导致成本高，不适合工业化生产。

技术实现要素：

本发明提供一种基于重组κ-卡拉胶酶制备卡拉胶寡糖的方法，该方法重组酶来源简单、酶活力好、稳定性高、酶解工艺简单、适合工业化生产，能够快速、大量生产聚合度均一的κ-卡拉胶寡糖，在酶解法制备κ-卡拉胶寡糖的生产方面有很大的应用前景。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：

一种基于重组κ-卡拉胶酶制备卡拉胶寡糖的方法，包括以下步骤：

一、重组κ-卡拉胶酶的制备

(1)将产重组κ-卡拉胶酶的工程菌株BL21-Cly-κ-CAR(专利申请号：201610503827.3)接种至卡那霉素浓度为20pg/ml的液体LB培养基中，37℃、150-200rpm条件下培养至菌液OD₆₀₀值达到0.5-0.6，LB培养基配方为：蛋白胨，10g/L、酵母抽提物，5g/L、氯化钠，10g/L、pH＝7；

(2)向菌液中加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导表达，诱导条件为18℃、100-120rpm、24h，使其产生重组κ-卡拉胶酶；

(3)收集诱导后的BL21-Cly-κ-CAR菌液，10000rpm，10min离心收集菌体，用PBS磷酸盐缓冲溶液洗涤菌体2-3次后，将菌体重悬于缓冲溶液，超声波破碎菌体，超声波条件为功率200W，每个循环包括超声5s，暂停5s，20个循环，破碎之后获得含有重组κ-卡拉胶酶的粗酶液；

二、重组κ-卡拉胶酶的酶活力测定

在不同温度、pH、底物浓度、反应时间的条件下，测定重组κ-卡拉胶酶粗酶液的酶活力，从而确定重组κ-卡拉胶酶的最适反应条件，酶活力测定方法为：取1mL粗酶液加入1mL浓度为0.5％的卡拉胶溶液，对照组为煮沸5min灭活的酶液，分别在不同条件下保温30min后，加入2mLDNS溶液，沸水浴反应5min后定容到25mL，紫外分光光度计测540nm处的吸光度，酶活力单位定义为上述条件下，每分钟释放1μmol还原糖所需的酶量为一个酶活力单位；

三、卡拉胶寡糖混合液的制备

按体积比1：1.5-2.0的比例将步骤一(3)中得到的粗酶液加入到无菌κ-卡拉胶溶液中，在步骤二中的得到的最适反应条件下于摇床或发酵罐中反应，获得含有卡拉胶寡糖的混合液；

四、κ-卡拉胶寡糖的纯化及鉴定

将步骤三获得的含有卡拉胶寡糖的混合液用2-3倍体积的活性炭处理2-4h，吸附聚合度较小的寡糖，用纯水洗脱为吸附的寡糖和盐类杂质，再利用20(v)％-40(v)％的乙醇对吸附后活性炭进行洗脱，洗脱液真空浓缩，冷冻干燥，得到κ-卡拉胶寡糖，采用薄层层析技术、高效液相色谱技术及质谱技术进行卡拉胶寡糖结构的鉴定。

一种基于重组κ-卡拉胶酶制备卡拉胶寡糖的方法，所述步骤一(3)中的缓冲溶液为PBS磷酸盐缓冲液或海洋细菌C.lytica M9发酵培养基，海洋细菌C.lytica M9发酵培养基的配方为：每100ml陈海水中含有卡拉胶0.1％、蛋白胨0.5％、FeSO₄.7H₂O 0.002％。

一种基于重组κ-卡拉胶酶制备卡拉胶寡糖的方法，所述步骤三中反应条件为：κ-卡拉胶的终浓度为0.7(wt)％-2.0(wt)％、温度35-45℃、pH＝6-8、反应时间2-4h，转速为100-150rpm。

本发明的优点在于卡拉胶酶的制备条件简单、酶活稳定以及酶产量高、酶解工艺简单、得率高，制备的κ-卡拉胶寡糖的聚合度为2-8。在规模化酶解法制备卡拉胶寡糖的生产方面有很大的前景。

附图说明

图1为重组κ-卡拉胶酶的酶学性质，其中A为在不同温度条件下的酶活力；B为不同温度以及反应时间条件下的酶活力；C为不同pH条件下的酶活力；D为不同pH以及反应时间条件下的酶活力；E为不同底物浓度条件下的酶活力；F为底物降解速率。

图2为制备的κ-卡拉胶寡糖的薄层层析图，其中，条带M代表半乳糖，条带C代表卡拉胶酶来自野生菌株C.lytica M9，条带1-6分别代表重组酶降解卡拉胶的作用时间10min，30min，1h，1.5h，2.5h和3h后的κ-卡拉胶寡糖的薄层层析图；a、b、c对应的位置分别为八糖、六糖及二糖)。

具体实施方式

结合具体实施方式和说明书附图对本发明做进一步说明。

一、重组κ-卡拉胶酶的制备

(1)将重组κ-卡拉胶酶的工程菌株BL21-Cly-κ-CAR接种至卡那霉素浓度为20pg/ml的液体LB培养基中，37℃、150rpm条件下培养至OD₆₀₀值达到0.5-0.6，LB培养基配方为：蛋白胨，10g/L、酵母抽提物，5g/L、氯化钠，10g/L、pH＝7；

(2)加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导表达，诱导条件为18℃、100rpm 24h，使其产生重组κ-卡拉胶酶；

(3)收集诱导后的BL21-Cly-κ-CAR菌液，10000rpm，10min离心收集菌体，用PBS磷酸盐缓冲溶液洗涤菌体2-3次后，将菌体重悬于海洋细菌C.lytica M9发酵培养基中，超声波破碎菌体，超声波条件为功率200W，每个循环包括超声5s，暂停5s，20个循环，破碎之后获得含有重组κ-卡拉胶酶的粗酶液；

二、重组κ-卡拉胶酶的酶活力测定

在不同温度、pH、底物浓度、反应时间的条件下，测定重组κ-卡拉胶酶粗酶液的酶活力，从而确定重组κ-卡拉胶酶的最适反应条件，酶活力的测定方法为：取1mL粗酶液加入1mL浓度为0.5％的卡拉胶溶液，对照组为煮沸5min灭活的酶液，分别在不同条件下保温30min后，加入2mLDNS溶液，沸水浴反应5min后定容到25mL，紫外分光光度计测540nm处的吸光度，酶活力单位定义为上述条件下，每分钟释放1μmol还原糖所需的酶量为一个酶活力单位；

其中，酶反应条件设置如下：

1、在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃条件下测定重组κ-卡拉胶酶粗酶液的酶活力，结果见图1A；

2、将重组κ-卡拉胶酶粗酶液分别置于35℃、40℃、45℃、50℃和55℃条件下，保温0.5h、1h、1.5h、2h后检测残余酶活力，结果见图1B；

3、用Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液将卡拉胶底物的pH值分别调节为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，测定重组κ-卡拉胶酶粗酶液的酶活力，结果见图1C；

4、将重组κ-卡拉胶酶粗酶液按1:1与不同pH缓冲液混合，置4℃条件下6h和24h后与相同pH的卡拉胶底物反应，按照上述酶活力测定方法测定剩余酶活力，结果见图1D；

5、以浓度分别为0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％和1％的卡拉胶作为底物，按照上述酶活力测定方法测定重组κ-卡拉胶酶活力，结果见图1E；

三、卡拉胶寡糖混合液的制备

按体积比1：1.5-2.0的比例将步骤一(3)中得到的粗酶液加入到无菌κ-卡拉胶溶液中，使κ-卡拉胶的终浓度为0.7(wt)％-2.0(wt)％，反应条件为35-45℃、pH＝6-8、转速为100-150rpm，置于摇床或发酵罐中反应2-4h，获得含有卡拉胶寡糖的混合液；

四、κ-卡拉胶寡糖的纯化及鉴定

将步骤三获得的含有卡拉胶寡糖的混合液用2-3倍体积的活性炭处理2-4h，吸附聚合度较小的寡糖，用纯水洗脱为吸附的寡糖和盐类杂质，再利用20(v)％-40(v)％的乙醇对吸附后活性炭进行洗脱，洗脱液真空浓缩，冷冻干燥，得到κ-卡拉胶寡糖，采用薄层层析技术、高效液相色谱技术及质谱技术进行卡拉胶寡糖结构的鉴定，结果见图2。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，按照本领域的普通技术知识和通用方法，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。