基于重组κ‑卡拉胶酶制备卡拉胶寡糖的方法与流程

文档序号:12412409阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种基于重组κ-卡拉胶酶制备卡拉胶寡糖的方法,其特征在于,包括以下步骤:

一、重组κ-卡拉胶酶的制备

(1)将产重组κ-卡拉胶酶的工程菌株BL21-Cly-κ-CAR接种至卡那霉素浓度为20pg/ml的液体LB培养基中,37℃、150-200rpm条件下培养至菌液OD600值达到0.5-0.6,LB培养基配方为:蛋白胨,10g/L、酵母抽提物,5g/L、氯化钠,10g/L、pH=7;

(2)向菌液中加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导表达,诱导条件为18℃、100-120rpm、24h,使其产生重组κ-卡拉胶酶;

(3)收集诱导后的BL21-Cly-κ-CAR菌液,10000rpm,10min离心收集菌体,用PBS磷酸盐缓冲溶液洗涤菌体2-3次后,将菌体重悬于缓冲溶液,超声波破碎菌体,超声波条件为功率200W,每个循环包括超声5s,暂停5s,20个循环,破碎之后获得含有重组κ-卡拉胶酶的粗酶液;

二、重组κ-卡拉胶酶的酶活力测定

在不同温度、pH、底物浓度、反应时间的条件下,测定重组κ-卡拉胶酶粗酶液的酶活力,从而确定重组κ-卡拉胶酶的最适反应条件,酶活力测定方法为:取1mL粗酶液加入1mL浓度为0.5%的卡拉胶溶液,对照组为煮沸5min灭活的酶液,分别在不同条件下保温30min后,加入2mLDNS溶液,沸水浴反应5min后定容到25mL,紫外分光光度计测540nm处的吸光度,酶活力单位定义为上述条件下,每分钟释放1μmol还原糖所需的酶量为一个酶活力单位;

三、卡拉胶寡糖混合液的制备

按体积比1:1.5-2.0的比例将步骤一(3)中得到的粗酶液加入到无菌κ-卡拉胶溶液中,在步骤二中的得到的最适反应条件下于摇床或发酵罐中反应,获得含有卡拉胶寡糖的混合液;

四、κ-卡拉胶寡糖的纯化及鉴定

将步骤三获得的含有卡拉胶寡糖的混合液用2-3倍体积的活性炭处理2-4h,吸附聚合度较小的寡糖,用纯水洗脱为吸附的寡糖和盐类杂质,再利用20(v)%-40(v)%的乙醇对吸附后活性炭进行洗脱,洗脱液真空浓缩,冷冻干燥,得到κ-卡拉胶寡糖,采用薄层层析技术、高效液相色谱技术及质谱技术进行卡拉胶寡糖结构的鉴定。

2.根据权利要求1所述的一种基于重组κ-卡拉胶酶制备卡拉胶寡糖的方法,其特征在于,所述步骤一(3)中的缓冲溶液为PBS磷酸盐缓冲液或海洋细菌C.lytica M9发酵培养基,海洋细菌C.lytica M9发酵培养基的配方为:每100ml陈海水中含有卡拉胶0.1%、蛋白胨0.5%、FeSO4.7H2O 0.002%。

3.根据权利要求1所述的一种基于重组κ-卡拉胶酶制备卡拉胶寡糖的方法,其特征在于,所述步骤三中最适反应条件为:κ-卡拉胶的终浓度为0.7(wt)%-2.0(wt)%、温度35-45℃、pH=6-8、反应时间2-4h,转速为100-150rpm。

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