本发明涉及一种调控灵芝胞外多糖中单糖组成及比例的方法，属于微生物发酵领域。
背景技术：
灵芝(Ganoderma lucidum)是名贵的食药用真菌，我国古代称其子实体为“仙草”，卫生部已经批准灵芝为食品新资源。灵芝多糖是灵芝主要的有效化学物质之一，是一类以葡萄糖为主的β-(1,3)和β-(1,4)键连接而成的多糖或杂多糖类大分子物质。包括灵芝多糖在内的食用真菌多糖的产生与分泌是一个非常复杂的过程，在不同培养批次之间，较难得到分子量相同的多糖组分，即使能得到分子量相同的多糖组分，它们的单糖组成及比例也难以达到完全一致。目前所报道的众多结构不一的灵芝多糖或高或低均表现出一定的生物活性，但上述的这种不均一性使得其在功能性食品或食品组分方面的基础和应用基础研究难以有效的深入展开。因此，如何高效、稳定地合成具有特定单糖组成和比例的灵芝多糖是一个亟待突破的瓶颈问题。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种调控灵芝胞外多糖中单糖组成及比例方法，所述方法是在灵芝的发酵培养基中添加0.1～0.6g/L的葡萄糖-6-磷酸进行发酵。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基每L含有葡萄糖15～25g，胰蛋白胨4～6g，无氨基酵母3～8g，初始pH＝6～7。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基每L含有葡萄糖20g，胰蛋白胨5g，无氨基酵母(YNB)5g，初始pH＝6～7。
在本发明的一种实施方式中，所述调控灵芝胞外多糖中单糖组成及比例是指控制胞外多糖中葡萄糖的含量占胞外多糖总量的比例≤80％。
在本发明的一种实施方式中，所述调控灵芝胞外多糖中单糖组成及比例是指控制胞外多糖中葡萄糖：甘露糖：半乳糖＝13～14:3～4:1～3。
在本发明的一种实施方式中，所述调控灵芝胞外多糖中单糖组成及比例是指控制胞外多糖中葡萄糖：甘露糖：半乳糖＝10～11:5～6:3～4。
在本发明的一种实施方式中，所述调控灵芝胞外多糖中单糖组成及比例是指控制胞外多糖中葡萄糖：甘露糖：半乳糖＝9～10:6～7:2～3。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵是在25～33℃，150～200r/min发酵5～7d。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵是以0.5～1g菌丝体/L培养基的接种量进行接种。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵是在发酵第0～96h向发酵培养基中加入0.1～0,6g/L葡萄糖-6-磷酸。
本发明的第二个目的是提供应用所述方法生产的灵芝胞外多糖。
本发明的第三个目的是提供所述方法在制备含灵芝胞外多糖的功能性食品、保健品方面的应用。
有益效果：本发明可通过调控葡萄糖-6-磷酸的添加量和添加时间，实现具有特定单糖组成和比例的灵芝多糖的合成，应用该方法生产的灵芝多糖具有有效抑制肿瘤细胞的生物活性，抑制率达80％以上，为将来合成具有较高生物活性、结构均一、生产可控的灵芝多糖奠定基础。
具体实施方式
多糖提取：取100ml发酵液滤液，加0.4倍的95％工业酒精，搅拌20min，4000r/min离心5min，去除蛋白，上清液加2.25倍95％工业酒精，搅拌20min，4℃过夜。10000r/min离心5分钟，去上清，沉淀加30ml蒸馏水溶解，10000r/min离心10min，清夜冷冻干燥后为灵芝胞外多糖粉。
多糖水解：称取20毫克左右多糖粗品于水解管中，加入2ml 1mol/L的硫酸水溶液，封管，于105℃水解8小时，水解液用碳酸钡中和，离心洗涤2次，上清液合并后冷冻干燥，得到的干燥物即为游离单糖。
衍生化：称取上述干燥单糖样加入10mg盐酸羟胺，加入1mg肌醇作为内标，0.5ml吡啶，于90℃水浴中保持30分钟；取出冷却后加入0.5ml乙酸酐于90℃水浴中保持30分钟，待样品冷却后进行GC分析。
色谱分析条件：采用岛津GC-14A气相色谱仪、OV1701石英毛细管柱、FID检测器，气化室温度260℃，检测器温度250℃，柱温起始温度120℃，保持3分钟，每分钟升10℃，至195℃，保留0.1分钟。每分钟升3℃，至240℃，保留10分钟。载气压力(N2)0.60kg/cm2，燃气压力(H2)0.65kg/cm2，助燃气压力(空气)0.50kg/cm2，分流比为30:1。
单糖分析：以内标法定出各单糖含量。
式中Ai表示某单糖样品峰面积；AIi表示样品中加入的肌醇内标峰面积；AIs表示标样中加入的肌醇内标峰面积；As表示某单糖标样峰面积；Ws表示某单糖标样的重量(mg)；WIs表示标样中加入的肌醇内标的重量(mg)；WIi表示样品中加入的肌醇内标的重量(mg)；W表示称取糖样品的重量(mg)。
基本培养基(g·L-1)：葡萄糖20，胰蛋白胨5，无氨基酵母(YNB)5，初始pH＝6.0，用于灵芝的种子培养和液体发酵培养。
灵芝多糖对体外肿瘤细胞抑制率的测定：本实验选取皮肤基底癌细胞A431和人乳腺癌细胞MDA-MB-231两株细胞。细胞贴壁均匀后，用胰蛋白酶消化配置成合适浓度的细胞悬浮液。采用96孔板，每孔加100μL细胞悬浮液。空白组中加等量的DMEM完全培养基，于细胞箱中培养一天。将96孔板中原来的培养基去除，分别更换不同剂量的DMEM培养基配置的多糖样品100μL(浓度为2g/L)。每个样品设6个复孔作为平行。空白组更换新的DMEM培养基。加样后继续在细胞箱中培养。每孔加入2μL噻唑蓝(thiazolyl blue)，在细胞箱中再继续培养4h。将每孔中的培养液更换为150μL的二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide DMSO)。在双波长570nm(检测波长)和630nm(参考波长)酶标仪上测定吸光值A。按照公式计算肿瘤抑制率：
实施例1
灵芝种子培养：取0.5cm2大小的菌块，接种于装液量80mL/250mL三角瓶的基本培养基中，150r·min-1、30℃培养7d。
灵芝发酵培养：500ml三角瓶中加入150ml培养基，初始pH 6.0，110℃灭菌20分钟。接种量为0.5g湿重灵芝菌丝体，150r·min-1、30℃培养7d。
发酵结束后，测定灵芝胞外多糖中的单糖组成。结果显示，灵芝多糖中葡萄糖、甘露糖和半乳糖所占比例分别为81.64％、9.44％和6.98％。
实施例2
灵芝种子培养：取0.5cm2大小的菌块，接种于装液量80mL/250mL三角瓶的基本培养基中，150r·min-1、30℃培养7d。
灵芝发酵培养：500ml三角瓶中加入150ml培养基，葡萄糖-6-磷酸的添加量为0.1g/L，初始pH 6.0，110℃灭菌20分钟。接种量为0.5g湿重灵芝菌丝体，150r·min-1、30℃培养7d。
发酵结束后，测定灵芝胞外多糖中的单糖组成。结果显示，当葡萄糖-6-磷酸添加量为0.1g/l时，灵芝多糖中葡萄糖、甘露糖和半乳糖所占比例分别为69.47％、16.66％和8.89％。
实施例3
灵芝种子培养：取0.5cm2大小的菌块，接种于装液量80mL/250mL三角瓶的基本培养基中，150r·min-1、30℃培养7d。
灵芝发酵培养：500ml三角瓶中加入150ml培养基，葡萄糖-6-磷酸的添加量为0.3g/L，初始pH 6.0，110℃灭菌20分钟。接种量为0.5g湿重灵芝菌丝体，150r·min-1、30℃培养7d。
发酵结束后，测定灵芝胞外多糖中的单糖组成。结果显示，当葡萄糖-6-磷酸添加量为0.3g/L时，葡萄糖、甘露糖和半乳糖所占比例分别为53.02％、29.02％和15.51％。
实施例4
灵芝种子培养：取0.5cm2大小的菌块，接种于装液量80mL/250mL三角瓶的基本培养基中，150r·min-1、30℃培养7d。
灵芝发酵培养：500ml三角瓶中加入150ml培养基，葡萄糖-6-磷酸的添加量为0.6g/L，初始pH 6.0，110℃灭菌20分钟。接种量为0.5g湿重灵芝菌丝体，150r·min-1、30℃培养7d。
发酵结束后，测定灵芝胞外多糖中的单糖组成。结果显示，当葡萄糖-6-磷酸添加量为0.6g/L时，葡萄糖、甘露糖和半乳糖所占比例分别为49.92％、34.33％和13.89％。
实施例5
培养基和培养方法同实施例1，区别在于，在发酵48h时添加0.3g/l葡萄糖-6-磷酸。发酵结束后，测定灵芝胞外多糖中的单糖组成。结果显示，发酵48h添加葡萄糖-6-磷酸时，葡萄糖、甘露糖和半乳糖所占比例分别为67.27％、19.80％和10.44％。
实施例6
培养基和培养方法同实施例1，区别在于，在发酵96h时添加0.3g/l葡萄糖-6-磷酸。发酵结束后，测定灵芝胞外多糖中的单糖组成。结果显示，发酵96h添加葡萄糖-6-磷酸时，葡萄糖、甘露糖和半乳糖所占比例分别为77.59％、10.56％和7.96％。
实施例7
培养基和培养方法同实施例3，区别在于，将0.3g/L葡萄糖-6-磷酸替换为0.3g/L葡萄糖-1-磷酸。发酵结束后，测定灵芝胞外多糖中的单糖组成。结果显示，当葡萄糖-1-磷酸添加量为0.3g/L发酵7d，葡萄糖、甘露糖和半乳糖所占比例分别为84.06％、8.69％和6.87％。
实施例8
培养基和培养方法同实施例3，区别在于，将0.3g/L葡萄糖-6-磷酸替换为0.3g/L果糖-1，6-二磷酸。发酵结束后，测定灵芝胞外多糖中的单糖组成。结果显示，当果糖-1，6-二磷酸添加量为0.3g/L发酵7d，葡萄糖、甘露糖和半乳糖所占比例分别为81.05％、11.40％和7.30％。
实施例9
对实施例1-8制备的灵芝多糖抗肿瘤活性进行测定，结果如表1所示。实施例2～6的方法制备的灵芝多糖对肿瘤细胞的抑制率均为60％以上，具有较强的生物活性。
表1 灵芝多糖对癌细胞的抑制作用
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。