本发明涉及一种新的深海适冷微生物胞外多糖的制备方法，属于海洋生物技术领域。
背景技术：
60％的海洋是深度超过2000米的深海，深海是一个特殊的生态环境，这里永久低温(深海热液口是高温环境)、高压、黑暗、高盐、寡营养。深海中生活着多种极端微生物，比如嗜(耐)热菌、嗜(适)冷菌、嗜(耐)压菌、嗜(耐)盐菌等。深海热液口区域的微生物是目前研究的热点领域。
过去十年，科学家对深海热液口微生物分泌的胞外多糖(Exopolysaccharides EPSs)的结构与功能进行了大量的研究，主要是热液口附近的中温菌分泌的多糖：交替单胞菌属、假交替单胞菌属和弧菌属。热液口微生物分泌的胞外多糖与其他生态环境中微生物分泌的胞外多糖的结构不同，表现在糖醛酸含量高(高达10～40％)和高度乙酰化上，使得这些多糖粘度较高，对金属离子、微生物菌体自身以及蛋白颗粒具有较强的结合能力。深海热液口的微生物资源被认为是能够分泌新型特殊功能多糖的重要资源。因为，一方面，深海热液口微生物分泌的胞外多糖的特殊结构，预示其具有新的潜在的生物学功能，在生物技术领域中将有新的用途；另一方面，深海极端环境下胞外多糖可以作为研究极端环境下生物大分子稳定性保护的模式材料。因此，深海微生物多糖的研究日益引起了各国科学家的重视，已经成为微生物学领域研究的热点，同时，也成为各国竞争的焦点。我国应该加强深海微生物多糖的研究，从而能在这一海洋生物高技术领域占有一席之地。
微生物多糖是重要地生物技术产品，在药物、生物技术领域、食品、环保、化妆品等领域具有广泛的应用。微生物多糖的种类很多，多糖的结构决定其功能。深海区域由于其高压、高盐、低温等独特的极端生态特性，因此，深海微生物分泌的胞外多糖应该具有新的结构特性。过去关注更多的是深海热液口微生物分泌的胞外多糖的结构及其在微生物适应热液口极端环境中的作用。但是，深海热液口在整个深海海底中所占的面积很少，而且，在该区域生长的微生物大多都是嗜(耐)热菌或中温菌。而深海海底绝大部分区域是一个高压、低温、弱光、寡营养的海水流动的环境，这些区域生长着大量的嗜(适)冷微生物。
2001年，陈秀兰等人首次报道了深海适冷菌Pseudomonas sp.SM9913的菌株筛选及特征与鉴定，参见陈秀兰等，“深海适冷菌SM9913产生的低温蛋白酶”，《海洋科学》2001年，第5卷，第1期，第4-8页。中国专利01127405.0公开了利用该菌株生产适冷风味蛋白酶的方法。但到目前为止，对深海适冷微生物胞外多糖的结构与功能的研究，尚未见报道，而对该问题的研究，对于深海微生物利用而言具有更普遍的意义，值得深入探讨。
本发明提供一种深海适冷微生物胞外多糖的制备方法。
本发明首先提供以胞外多糖产率高的深海适冷菌Pseudomonas sp.SM9913为菌株，通过液体深层发酵制备胞外多糖的工艺，得到分离纯化的胞外多糖，解析其结构，为其在生物技术领域的应用奠定基础。
技术实现要素：
一种深海适冷微生物胞外多糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)种子制备
培养基：豆饼粉2～3份、玉米2～3份、麸皮1～1.5份、Na2HPO4 0.4～0.5份、KH2PO40.03～0.04份和水100份，均为重量份，培养基100-120℃灭菌30-50分钟，冷却后，以深海适冷菌Pseudomonas sp.SM9913为菌株(参见陈秀兰等，“深海适冷菌SM9913产生的低温蛋白酶”，《海洋科学》2001年1月19日，菌株持有人山东大学)，接茄子瓶菌种的菌悬液，接种量5-7％质量百分比。通风，搅拌，培养。得种子液，待用。
优选的，上述培养基中加豆油300～350毫升作消泡剂。
优选的，上述种子制备是在150升发酵罐中装样量70升，于10～12℃下，通风1∶0.5～0.6，搅拌320～330转/分，培养36～48小时。胞外多糖产量约5克/升。
(2)液体深层发酵制备胞外多糖发酵液
培养基，：豆饼粉3～3.5份、玉米粉2.5～3份、山芋粉2.5～3份、麸皮2.0～2.5份、Na2HPO40.4～0.5份、KH2PO4 0.03～0.04份和水100份，均为重量份。1000升发酵罐，装450升培养基，灭菌后pH6.2～6.3，接种步骤(1)制备的种子5～7％，搅拌200～220转/分，控制通风量0-12小时1∶0.5～0.6，12-20小时1∶0.6～0.7，20-28小时1∶0.8～0.9，控制培养温度10～12℃，发酵48～72小时。每升产多糖量可达5克。
优选的，上述培养基中加豆油1～1.2公斤作消泡剂。
(3)胞外多糖发酵液的后处理
上述胞外多糖发酵液经10000rpm离心，然后离心上清液用无水乙醇沉淀，上清液体积与无水乙醇体积比例为1∶3，除蛋白、脱色后，离心干燥得到多糖粗制品。多糖粗品在60～70℃热水中重溶，浓缩至原体积的20～30％，再经过凝胶过滤层析和离子交换层析技术分离，真空冷冻干燥，得到多糖的纯品。
最后，经质检、分装成胞外多糖产品。
上述步骤(1)中所述的茄子瓶斜面菌种的制作可按已有技术。本发明提供如下具体操作步骤：
以0.2～0.4份牛肉膏、0.8～1.2份蛋白胨、1.5～2份琼脂、0.4～0.6份NaCl为培养基，水95～100份，pH为7.0～7.2，灭菌，在试管斜面上，划线接深海适冷菌Pseudomonassp.SM9913菌种，12～15℃培养24～26小时，贮藏于4℃。
将上述菌种移入茄子瓶斜面(培养基与保藏斜面相同)，12～15℃培养24～26小时，作菌悬液用。
上述步骤(3)凝胶过滤层析和离子交换层析中优选：
凝胶过滤层析柱：100cm×1.2cm，凝胶类型：Sephadex G-100。
离子交换层析柱：25cm×1.6cm，凝胶类型：DEAE-Sepharose Fast Flow。
下面结合胞外多糖的结构解析，对本发明做进一步说明。
本发明方法所制备的多糖纯品经过1D、2D-NMR、MS、甲基化分析得到此多糖的主要结构组成重复单元为：
{→6)-[3，6-O-acetyl]-α-D-Glcp-(1→6)-[3-O-acetyl]-α-D-Glcp-(1→6)-[3-O-acetyl]-α-D-Glcp-(1→6)-[3-O-acetyl]-α-D-Glcp-(1→}n
其中糖单元∶乙酰基∶乙醇基＝4∶5∶1，高度乙酰化的α-(1→6)构成多糖主链的核心结构(61.8％)，多糖链的末端还存在少量的Ara(11.0％)、Xyl(3.9％)、Gal(3.1％)、(1→4)Glc(5％)和(3→6)Glc(4％)。从此胞外多糖结构中，可以看出高度乙酰化能够改变多糖分子的定向性和横向次序，从而改变多糖的物理性质，乙酰基的引入使分子的伸展变化，最终导致多糖羟基基团的暴露，增加其在水中的溶解性，从而达到提高其生物活性的效果。
本发明的所制备的多糖纯品为生物技术产品，在药物、生物技术领域、食品、环保、化妆品等领域具有广泛的应用。
本发明的技术特点在于：
1、海洋作为一个特殊的极端环境，海洋微生物分泌的EPS应该具有特殊的结构与功能，已经日益引起各国科学家的关注。近年来，已经对深海热液口的中温及耐热微生物和极地适冷微生物分泌的EPS的结构与功能进行了许多研究，发现了多种新的结构和功能的EPS。但关于深海适冷微生物分泌的EPS的结构与功能的研究，至今未见报道。因为，世界上60％以上的环境都是深度超过2000米的深海，其中绝大部分都是低温环境。
2、首次以深海适冷菌Pseudomonas sp.SM9913为菌株发酵生产胞外多糖，建立该菌株合成分泌的胞外多糖EPS的优化发酵生产工艺。
3、首次提供高效分离纯化深海适冷菌Pseudomonas sp.SM9913分泌的胞外多糖的技术方法，利用核磁共振、红外光谱、质谱等技术，分析其物理化学特性，解析其结构，多糖的主要结构组成如前所述，说明这是一种新的结构的深海微生物胞外多糖。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但不限于此。
实施例1：茄子瓶菌种的菌悬液的制备
以0.3份牛肉膏、1.0份蛋白胨、1.7份琼脂、0.5份NaCl为培养基，水96份，pH为7.0～7.2，灭菌，在试管斜面上，划线接深海适冷菌Pseudomonas sp.SM9913菌种(参见陈秀兰等，“深海适冷菌SM9913产生的低温蛋白酶”，《海洋科学》2001年1月19日，菌株持有人山东大学)，12～15℃培养25小时，贮藏于4℃。将该菌种移入茄子瓶斜面(培养基与保藏斜面相同)，12～15℃培养25小时，作菌悬液用。
实施例2：深海适冷微生物胞外多糖的制备，步骤如下：
(1)种子制备
培养基：豆饼粉2份、玉米3份、麸皮1.5份、Na2HPO40.5份、KH2PO4 0.04份和水100份，均为重量份，培养基中加豆油300毫升作消泡剂。培养基120℃灭菌50分钟，冷却后，在150升发酵罐中装样量70升，接实施例1制备的茄子瓶菌种的菌悬液，接种量5％。于10～12℃下，通风1∶0.5～0.6，搅拌320～330转/分，培养40小时。
(2)液体深层发酵制备胞外多糖发酵液
培养基，：豆饼粉3.5份、玉米粉2.5份、山芋粉3份、麸皮2.5份、Na2HPO4 0.4份、KH2PO40.03份和水100份，均为重量份。培养基中加豆油1公斤作消泡剂。1000升发酵罐，装450升培养基，灭菌后pH6.2～6.3，接种步骤(1)制备的种子，接种量5％，搅拌220转/分，控制通风量0-12小时1∶0.5～0.6，12-20小时1∶0.6～0.7，20-28小时1∶0.8～0.9，控制培养温度10～12℃，发酵56小时。每升产多糖量可达5克。
(3)胞外多糖发酵液的后处理
上述胞外多糖发酵液经10000rpm离心，然后用无水乙醇沉淀(离心上清液体积与无水乙醇体积比例为1∶3)，除蛋白、脱色后，离心干燥得到多糖的粗制品。多糖粗品在60～70℃热水中重溶，浓缩至原体积的22％，再经过凝胶过滤层析和离子交换层析技术分离，真空冷冻干燥，得到多糖的纯品(固体)。凝胶过滤层析和离子交换层析中优选：凝胶过滤层析柱：100cm×1.2cm，凝胶类型：Sephadex G-100；离子交换层析柱：25cm×1.6cm，凝胶类型：DEAE-Sepharose Fast Flow。
所制备的多糖纯品经过1D、2D-NMR、MS、甲基化分析得到此多糖的主要结构组成重复单元为：
{→6)-[3,6-O-acetyl]-α-D-Glcp-(1→6)-[3-O-acetyl]-α-D-Glcp-(1→6)-[3-O-acetyl]-α-D-Glcp-(1→6)-[3-O-acetyl]-α-D-Glcp-(1→)n
其中糖单元∶乙酰基∶乙醇基＝4∶5∶1，高度乙酰化的α-(1→6)构成多糖主链的核心结构(61.8％)，多糖链的末端还存在少量的Ara(11.0％)、Xyl(3.9％)、Gal(3.1％)、(1→4)Glc(5％)和(3→6)Glc(4％)。
实施例3：
深海适冷微生物胞外多糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)种子制备
培养基：豆饼粉2份、玉米3份、麸皮1.5份、Na2HPO4 0.5份、KH2PO4 0.04份和水100份，均为重量份，培养基中加豆油300毫升作消泡剂。培养基120℃灭菌50分钟，冷却后，接种SM9913菌种茄子瓶菌种的菌悬液(可为实施例1的产物)，接种量5％质量百分比。上述种子制备是在150升发酵罐中装样量70升，于10～12℃下，通风1∶0.5～0.6，搅拌320～330转/分，培养48小时。胞外多糖产量5克/升。
(2)液体深层发酵制备胞外多糖发酵液
培养基：豆饼粉3.5份、玉米粉2.5份、山芋粉3份、麸皮2.5份、Na2HPO4 0.4份、KH2PO4 0.03份和水100份，均为重量份，培养基中加豆油1.2公斤作消泡剂。1000升发酵罐，装450升培养基，灭菌后pH6.2～6.3，接种步骤(1)制备的种子，接种量6％，搅拌200～220转/分，控制通风量0-12小时1∶0.5～0.6，12-20小时1∶0.6～0.7，20-28小时1∶0.8～0.9，控制培养温度10～12℃，发酵72小时。每升产多糖量可达5克。
(3)胞外多糖发酵液的后处理
上述胞外多糖发酵液经10000rpm离心，然后用无水乙醇沉淀(离心上清液体积与无水乙醇体积比例为1∶3)，除蛋白、脱色后，离心干燥得到多糖的粗制品。多糖粗品在65℃热水中重溶，浓缩至原体积的30％，再经过凝胶过滤层析和离子交换层析技术分离，真空冷冻干燥，得到多糖的纯品。凝胶过滤层析和离子交换层析中优选：凝胶过滤层析柱：100cm×1.2cm，凝胶类型：Sephadex G-100；离子交换层析柱：25cm×1.6cm，凝胶类型：DEAE-Sepharose Fast Flow。
多糖结构组成同实施例2。